Name: design, synthesis, and photochemical properties of clickable caged compounds
Uploaded: 2019-10-15T13:00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI Grant Number JP16H01282 (TF), en støtte til videnskabelig forskning i innovative områder "Memory dynamik" og JP19H05778 (TF), "MolMovies."

1. syntese af den modulære anbringelse pabhc gruppe for klikbare bur forbindelser28,41
<ol><li>
Tilberedning af (6-brom-7-hydroxycoumarin-4-yl) methylchlorid (BHC-CH2CL)
	<ol>
<li>Sted 4-bromoresorcinol (9,742 g, 51,5 mmol) i en 100 mL rundbundet kolbe udstyret med en omrørs stang.</li>
		<li>Tilsæt conc. H2så4 (98%, 30 ml) til kolben og rør blandingen for at opløse den.</li>
		<li>Tilsæt ethyl 4-chloroacetoacetat (10 mL, 74 mmol) dropwise.</li>
		<li>Fortsæt omrøring af blandingen ved omgivelsestemperatur i 5 dage.</li>
		<li>Hver for sig anbringes knuste isterninger (~ 200 mL) i en 500 mL Erlenmeyer-kolbe.</li>
		<li>Hæld reaktionsblandingen i isen og rør kraftigt i 30 minutter, indtil der opnås et fint pulverformet bundfald.</li>
		<li>Opsamles bundfaldet via vakuum filtrering. Skyl det lysebrune bundfald med vand fem gange.</li>
		<li>Bundfaldet tørres under vakuum natten over for at give BhcCH2cl som et let brunt pulver (13,57 g, 46,9 mmol).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Klargøring af (6-brom-7-hydroxycoumarin-4-yl) methanol (BhcCH2Oh)
	<ol>
<li>Den forberedte BhcCH2Cl (1,1440 g, 3,95 mmol) og 1 M HCl (300 ml) anbringes i en 1 L rundbundet kolbe, der er udstyret med en Dimroth-kondensator. Blandingen omrøres ved 140 °C i 5 dage. Efter denne tid, afkøles blandingen til omgivende temperatur.</li>
		<li>Fjern vandet fra reaktionen ved roterende fordampning under vakuum for at give BhcCH2Oh (1) som et let brunt pulver (1,0359 g, 3,82 mmol, 97% udbytte). Bemærk: brugen af 250 mL af 1 M HCl pr. 1 g BhcCH2CL giver et tilfredsstillende resultat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Klargøring af paBhcCH2Oh (2) via mannich-reaktionen
	<ol>
<li>PARAFORMALDEHYD (446,4 mg, 14,9 mmol) anbringes i en 50 mL rundbundet kolbe. Tilsæt vandfri ethanol (5 mL) og N-methylpropargylamin (1,25 mL, 14,8 mmol) til kolben.</li>
		<li>Blandingen omrøres ved omgivende temperatur i 1 time under en AR-atmosfære.</li>
		<li>Tilsæt BhcCH2Oh (1) (1,367 g, 5,04 mmol) til kolben. Blandingen opvarmes til 80 °C med et blok varmeapparat, og blandingen fortsættes ved 80 °C i 2 timer under en AR-atmosfære.</li>
		<li>Stop blok varmer og Afkøl reaktionsblandingen til stuetemperatur.</li>
		<li>Saml det resulterende lysebrunt-gule bundfald ved vakuum filtrering. Bundfaldet vaskes to gange med en lille mængde vandfri ethanol (1 mL hver gang).</li>
		<li>Fjern den overskydende ethanol under vakuum for at give paBhcCH2Oh (2) (1,393 g, 3,96 mmol).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. klargøring af klikbare bur forbindelser
Bemærk: følgende procedurer kan anvendes til fremstilling af andre klikbare bur forbindelser, der indeholder hydroxyl-, amino-og carboxylat-funktionelle grupper.
<ol><li>
Generel procedure 1: klargøring af et klikbart bur Amin
	<ol>
<li>Placer paBhcCH2Oh (2) (709,6 mg, 2,02 mmol) og n,n '-carbonyl diimidazol (CDI, 397,6 mg, 2,45 mmol) i en 30 ml rundbundet kolbe. Tilsæt tør LM2CL2 (6 ml) og rør opløsningen ved omgivende temperatur i 1 time.</li>
		<li>Tilsæt 4-dimethylaminopyridin (4-DMAP, 324,8 mg, 2,66 mmol) og tert-butyl (6-aminohexyl) carbamat (533,1 mg, 2,46 mmol). Opløsningen omrøres ved omgivende temperatur i 3 timer.</li>
		<li>Fjern opløsningsmidlet og andre flygtige materialer ved hjælp af en rotationsfordamper under vakuum. Rense rester direkte ved hjælp af silica gel flash kolonne kromatografi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generel procedure 2: klargøring af et klikbart bur alkohol
	<ol>
<li>Paclitaxel (PTX, 48,7 mg, 0,057 mmol) anbringes i en 30 mL rundbundet kolbe, der er udstyret med en trevejs stophane og en AR-ballon. Tilsæt tør LM2CL2 (1 ml), 4-DMAP (17,1 mg, 0,14 mmol) og 4-nitrophenyl chloroformat (26,0 mg, 0,13 mmol).</li>
		<li>Opløsningen omrøres ved omgivende temperatur for 2,5 h under en AR-atmosfære.</li>
		<li>Tilsæt 4-DMAP (15,7 mg, 0,13 mmol) og paBhcCH2Oh (2) (39,1 mg, 0,111 mmol) til opløsningen. Fortsæt omrøring af blandingen ved omgivelsestemperatur i 17 timer.</li>
		<li>Tilsæt CHCl3 (10 ml) og 15% vandig NaHCO3 (5 ml) til blandingen. Blandingen omrøres kraftigt i ca. 3 min. Fjern det vandige lag med en pipette.</li>
		<li>Tilsæt 0,5 M citronsyre (5 mL) til kolben indeholdende det organiske lag. Bland blandingen og fjern det vandige lag som ovenfor.</li>
		<li>Separer det organiske lag ved hjælp af en fase separations søjle. Fjern opløsningsmidlerne med en rotationsfordamper under vakuum. Rense produktet ved hjælp af standard silicagel flash kolonne kromatografi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generel procedure 3: klargøring af en klikbar carboxylsyre
	<ol>
<li>Arachidonsyre opløses (33,0 μL, 0,100 mmol), paBhcCH2Oh (2) (39,6 mg, 0,112 mmol) og 4-DMAP (14,1 mg, 0,115 MMOL) i tør LM2CL 2 (2 ml ). Tilsæt n,n-diisopropylcarbodiimide (Dipc, 17,0 μl, 0,110 mmol) og rør opløsningen ved omgivelsestemperatur i 140 min.</li>
		<li>Fjern opløsningsmidlet under vakuum. Rense rester direkte ved hjælp af silica gel flash kolonne kromatografi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. installation af en funktionel enhed i de klikbare bur forbindelser
<ol><li>Kobber (II) sulfat pentahydrat (249 mg) opløses i ionbyttet vand (IEW, 10 mL) for at give en 0,1 M CuSO4 opløsning.</li>
	<li>2-paBhcmoc-PTX opløses (8,0 mg, 6,5 μmol), tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl) Amin (THPTA, 17,5 mg, 40,3 μmol), natrium l-Ascorbat (162,4 mg, 0,825 mmol) og 15-chloro-3, 6, 9-trioxapentadecyl-Azid (3,1 mg, 11 μmol) i et blandet opløsningsmiddel på 0,1 M fosfat buffer (2,5 mL, pH 7,2) og dimethylsulfoxid (DMSO, 0,5 mL).</li>
	<li>Tilsæt 0,1 M CuSO4 -opløsningen (81,2 μL, 8,1 μmol) til reaktionsblandingen. Blandingen omrøres ved omgivende temperatur i 80 min. Overvåg forløbet af reaktionen ved hjælp af højtydende væskekromatografi (HPLC).</li>
	<li>Bundfaldet opløses ved tilsætning af en 75% acetonitril/vand opløsning (3,5 mL). Anvend den resulterende opløsning direkte på det semi-præparative HPLC-system for at rense det ønskede produkt. Bemærk: Solubilisering af reaktionsblandingen ved tilsætning af tert-butanol kan fremskynde progression af reaktionen.</li>
</ol>4. photolytic-ucaging reaktion af de bur forbindelser
<ol><li>Klargøring af stamopløsninger
	<ol>
<li>Den ønskede bur-forbindelse (5 μmol) opløses i DMSO (500 μl) for at tilberede en 10 mm stamopløsning. En alikvot af hver opløsning (10 μL) dispenserer i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas og opbevares i en fryser (− 20 °C) indtil lige før brug.</li>
		<li>6 mM K3[Fe (C2O4)3] (100 ml): Opløs den omkrystalliserede kaliumferrioxalat (0,295 g, 0,675 mmol) i 80 ml vand. Tilsæt 0,5 M H2så4 (10 ml) og en passende mængde af iew at gøre op volumen til 100 ml. Bemærk: Kaliumferrioxalat skal renses via omkrystallisering fra varmt vand og opbevares i mørke. Endrystalliseret kalium ferrioxalat opnås som trihydrat; Derfor er dens formel K3[Fe (C2O4)3] · 3h2o og en formel vægt på 491,24 bør overvejes under tilberedning af stamopløsningen. Kontroller renheden af 6 mM opløsningen ved at måle dens absorption ved 510 nm. Hvis absorbansen er < 0,02, er den egnet til brug i forsøget.</li>
		<li>0,1% buffer-Phen (30 mL): Opløs NaOAc · 3H2O (7,35 g), 1, 10-phenanthroline (Phen) · H2O (30 mg) og conc. H2så4 (0,9 ml) i iew (20 ml). Tilføj IEW for at gøre lydstyrken op til 30 mL. Bemærk: opløsningen indeholder 1,8 M NaOAc, 0,54 M H2så4, og 0,1% 1, 10-phenanthroline.</li>
	</ol></li>
	<li>Måling af antallet af fotoner ved brug af ferrioxalataktinometri
	<ol>
<li>Placer 6 mM K3[Fe (C2O4)3] (V1 L) i kvarts kuvette. Irradiate opløsningen med 350 nm lys for 5 s.</li>
		<li>Den bestrålede opløsning overføres til en Pyrex-kuvette med en længde på l [cm].</li>
		<li>Tilsæt 0,1% buffer-Phen (V2 L) til den bestrålede prøveopløsning, og bland godt ved pipettering. Prøvens absorbans måles ved 510 nm. Beregn den gennemsnitlige absorptions ændring pr. tidsenhed (ΔA510 [s− 1]).</li>
		<li>Beregn antallet af mol af genererede fe2 + ioner pr. tidsenhed i henhold til følgende ligning: NFE2 + [mol s− 1] = ((v1 + v2) [l] × ΔA510 [s− 1])/(L [cm] × ε510 [l mol− 1 cm− 1]), hvor (v1 + v2) er volumenet af prøven til absorptions målingen, er l den optiske stilængde af kuvetten, og ε510 er den molære absorption af fe2 +- Phen-kompleks ved 510 nm. Bemærk: i de typiske eksperimentelle betingelser, værdier v1 = 2,0 × 10− 3 l, v2 = 0,33 × 10− 3 l, L = 1,0 cm, og ε510 = 1,1 × 104 L mol− 1 cm− 1 blev anvendt.</li>
		<li>Beregn antallet af modermærker af fotoner, der når prøven (I0) ved hjælp af følgende formel: I0 [Einstein cm− 2 s− 1] = NFE2 +/Φ350 hvor Φ 350 er kvante effektiviteten af fotoreduktion af ferrioxalat ved 350 nm. Bemærk: selv om kvante effektiviteten af kaliumferrioxalatactinometer ved 350 nm ikke rapporteres, blev den rapporterede værdi af 1,2542 ved 358 nm anvendt.</li>
	</ol></li>
	<li>Kvante effektivitetsmålinger ved 350 nm
	<ol>
<li>Prøve stamopløsningen fortyndes (i DMSO, 10 μL) med K-MOPS buffer (pH 7,2, 10 mL) for at give en 10 μM opløsning i K-MOPS indeholdende 0,1% DMSO. Bemærk: K-MOPS-bufferen bestod af 100 mM KCl og 10 mM 3-(N-morpholino) propanesulfonsyre (Mops) titreret til pH 7,2 med Koh.</li>
		<li>En alikvot opløsning (V1 L) overføres til samme kuvette, som anvendes ved foto virkningen af det kemiske aktinometer. Udstråle prøveopløsningen ved hjælp af samme opsætning som beskrevet i trin 4.2.1.</li>
		<li>Fjern en alikvot (50 μL) fra den bestrålede opløsning periodisk og analysér ved hjælp af HPLC.</li>
		<li>Fastlægge bestrålings tiden i sekunder, hvor 90% af udgangsmaterialet reagerede (t90%) ved at montere observationsområder for udgangsmaterialets tidsafhængige forsvinden. Bemærk: absorbansen af den bestrålede prøve skal holdes på < 0,1, således at den indvendige filtrering af strålingen kan ignoreres. Det er ønskeligt, at det fotolytiske forbrug af udgangsmaterialet kan tilnærtes ved enkelt eksponentiel forfald, således at der ikke er nogen uønsket sekundær effekt, der forstyrrer fotolyse processen.</li>
		<li>Beregn Quantum udbyttet af forsvinden (ΦDIS) ved hjælp af følgende ligning28: ΦDIS = 1/(t90% × I0 × σ350) hvor t90% [s] er bestrålings tiden, hvor 90% af udgangsmaterialet blev forbrugt, i0 [Einstein cm− 2 s− 1] er antallet af mol af fotoner, og σ350 [cm 2 mol− 1] er prøvens decadiske ekstinktionskoefficient ved 350 nm. Bemærk: σ350 [cm2 mol− 1] = 103ε350 [M− 1 cm− 1].</li>
	</ol></li>
</ol>5. målretning af et klikbart bur sammensatte med en halotag ligand
Bemærk: før brug skal du vedligeholde HeLa-cellerne i Dulbecco's modificerede Eagle-medium (DMEM, lavt glucose, natriumpyruvat, l-glutamin) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), der indeholder 1% antibiotika (streptomycin-sulfat, penicillin G og amphotericin) ved 37 °C og 5% CO2.
<ol><li>Fjern mediet og trypsinisér cellerne ved behandling med trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA, 1 mL) ved 37 °C i 1 min. Tilsæt DMEM (4 mL) til cellerne og re-suspendere cellerne ved pipettering forsigtigt. Frø ca. 5 × 105 celler pr. skål i 35 mm glasbund retter i DMEM (2 ml) 24 h før transfection.</li>
	<li>For fire retter, i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas, fortyndes plasmid-DNA (pcDNA3-Halo-EGFR, 14 μg) i det reducerede serum medium (700 μL). Separat fortyndes lipofection reagens (5 μL) i det reducerede serum medium (150 μL) til hvert af fire rør og lader dem stå ved omgivende temperatur i 5 min.</li>
	<li>Tilsæt en del af det fortyndede plasmid-DNA (150 μL) til hver af de fortyndede lipofection reagens prøver. Inkuber ved omgivende temperatur i 5 min.</li>
	<li>Efter opretholdelse af cellerne ved 37 °C og 5% CO2 i 24 timer, ASPIRER DMEM og skyl cellerne med fosfat-bufferet saltvand (PBS, 2 ml). Tilsæt det reducerede serum medium (1,5 mL).</li>
	<li>Tilsæt plasmid-lipofection reagens (150 μL) kompleks til hver skål. Cellerne fastholdes ved 37 °C og 5% CO2 for 48 h.</li>
	<li>Aspirér mediet, tilsæt en portion frisk tilberedt DMEM (1 mL) indeholdende 2 μM paBhc-hex-FITC/Halo, og Inkuber cellerne ved 37 °C og 5% CO2 i 30 min.</li>
	<li>Aspirer mediet, der indeholder det bur sammensatte, og skyl cellerne to gange med PBS + (1 ml pr. skylning) for at fjerne ubundne forbindelser. Tilsæt det reducerede serum medium (500 μL), og Inkuber cellerne ved 37 °C og 5% CO2 i 30 minutter for at fjerne de forbindelser, der indgik i cellerne. Bemærk: PBS + er fosfat-bufferet saltvand suppleret med 2 mM CaCl2 og 1 mm mgcl2.</li>
	<li>Fjern mediet, og skyl cellerne to gange med PBS + (1 mL). Tilsæt en del af et medium (1 mL), der ikke indeholder phenol rødt. Optag fluorescensbilleder ved Laserscanning Konfokal Fluorescens mikroskopi.</li>
</ol>6. photomediated modulation af en kinase lokalisering ved hjælp af et klikbart bur sammensatte
Bemærk: før brug skal du vedligeholde CHO-K1-cellerne i skinke F-12-medium suppleret med 10% FBS ved 37 °C og 5% CO2.
<ol><li>Forbered en 100 × arbejdsopløsning (1 mM) af paBhc-AA (5) i DMSO. Bemærk: en 10 mM stamopløsning af forbindelsen tilberedes og opbevares i en fryser (-20 °C).</li>
	<li>Frø ca. 5 × 105 celler pr. skål i 35 mm glasbund retter i DMEM (2 ml) 24 h før transfection.</li>
	<li>Transfect CHO-K1 celler med en plasmid kodning for GFP-DGKγ 48 h før de onder forsøg. Bemærk: Transfection udføres i henhold til trin 5.2 – 5.5.</li>
	<li>Udskift mediet med et reduceret serum medium (2 mL). Tilsæt 100 × paBhc-AA-arbejdsopløsningen (20 μL), og Inkuber cellerne ved 37 °C og 5% CO2 i mellem 5 min og 1 time. Bemærk: indlæsningstiden afhænger af den anvendte forbindelse.</li>
	<li>Placer cellerne på den objektive fase af et inverteret fluorescerende mikroskop udstyret med en fluorescens lampe med to lyskilder.</li>
	<li>Tag et fluorescerende billede hver 10 s. Irradiate cellerne med 330 – 385 nm lys gennem et mikroskop mål for en passende tid. Alternativt, bestråle cellerne med 405 nm lys ved hjælp af en XE lampe gennem fleksible kvarts fibre.</li>
	<li>Fortsæt med at optage fluorescerende billeder i 10 min.</li>
</ol>

Vi har intet at afsløre.

Vi har tidligere udviklet BHC bur forbindelser af forskellige biologisk aktive molekyler, der udviser høj fotolytiske effektivitetsgevinster28,45,46,47. Med det formål at udvide repertoiret af BHC anbringelse grupper, vi også rapporteret platforme af modulære bur forbindelser, der kan ændres nemt ved indførelsen af forskellige funktionelle enheder32,40,41. Denne protokol repræsenterer derfor en metode til syntese af en klikbart forløber for BHC anbringelse grupper, der kan modificeres via kobber (I)-katalyseret huisgen cyklisering. Syntesen af den klikbare forløber, paBhcCH2Oh (2), blev opnået via en fire-trins reaktions sekvens startende fra den kommercielt tilgængelige 4-bromoresorcinol (figur 1a). Fordelen ved denne protokol er, at der ikke er behov for besværlige rensningstrin (f. eks. kolonne kromatografiske separationer).
Som klikbare forløber pabhcch2Oh (2) kan bruges til at maskere forskellige funktionelle grupper, klikbare bur forbindelser af aminer, alkoholer, og carboxylsyrer blev syntetiseret ved hjælp af 2 som forløber (figur 1b). Aminer blev modificeret som deres carbamater, mens alkoholer blev modificeret som deres carbonater. I generelle procedurer 1 og 2 blev CDI anvendt til fremstilling af klikbare carbamater, mens 4-nitrophenyl chloroformat blev anvendt til fremstilling af carbonater. Som det fremgår af reaktions mekanismen, kan begge reagenser anvendes til fremstilling af carbamater og carbonater. Det skal også bemærkes, at udbyttet af den ønskede bur sammensatte afhænger af den kemiske struktur af molekyle, der skal bur. Andre eksempler kan ses i vores tidligere rapporter28,30,33,48.
Klik på ændring blev derefter udført ved hjælp af en mindre ændring af den rapporterede procedure49. Tilsætning af tris (triazolylmethyl) Amin-baserede ligander er nødvendig for at opnå de ønskede produkter i god til høje udbytter. Da en række azider er let tilgængelige både fra kommercielle kilder og fra litteratur procedurer, kan vi forberede forskellige modulære bur forbindelser med yderligere egenskaber såsom vandopløselighed og cellulære målretning evne (figur 2).
Kvante udbyttet af photolyse blev derefter målt i henhold til en rapporteret procedure28,50. Figur 3 viser, at det fotolytiske forbrug af 2-GLC-paBhcmoc-PTX og frigivelsen af PTX var tilnærmende ved en enkelt eksponentiel henfald og stigning, hvilket antyder, at der ikke var nogen indre filtrering af strålingen eller uønskede sekundære virkninger. Der blev observeret forbedrede kvante udbytter (Φ) og fotolyse-effektivitet (εφ) for de klikbare pabhc-bur-forbindelser sammenlignet med de tidligere rapporterede BHC-bur-forbindelser (tabel 1)41 . 43. da fotolysis-effektiviteten (εφ) af BHC-bur-forbindelser er mere end 100 gange højere end for 2-nitrobenzyl-type-bur-forbindelser48, er den markante forbedring på grund af tilstedeværelsen af pabhc-anbringelse-grupper klart en fordel for dette system.
Som et proof-of-concept-eksperiment blev en hydrofile-delen introduceret i 2 '-paBhcmoc-PTX (4) og en cellulær målrettethed blev introduceret i sammensatte 3 (figur 2). Vandopløseligheden af 2-GLC-paBhcmoc-PTX var 650 gange højere end for moderselskabet PTX (tabel 1). Selektiv cellulær målretning blev opnået ved hjælp af et tag-Probe system, og paBhcmoc-hex-FITC/Halo (8) med halotag ligand blev med succes målrettet til cellemembranen af dyrkede pattedyrsceller, der udtrykker halotag/EGFR fusion protein ( Figur 4). Foto medieret graduering af den subcellulære lokalisering af en kinase blev også opnået ved hjælp af et klikbart bur sammensatte 5 (figur 5).
Afslutningsvis, vi med succes demonstreret en metode til fremstilling af klikbare platforme for foto-caged forbindelser af biologisk interessante molekyler, der kan ændres nemt med yderligere egenskaber, såsom vandopløselighed og en cellulær målretning evne. Da pabhc anbringelse-gruppen kan anvendes til at forberede eventuelle molekyler med modificerbare funktionelle grupper, er anvendelsen af denne protokol ikke begrænset til de molekyler, der er beskrevet heri. Ved hjælp af en modulær platform, nemlig pabhc anbringelse gruppe, de ønskede bur forbindelser kan let forberedes, og deres fysiske og kemiske egenskaber kan moduleres via Click modifikation.

Caged forbindelser er designet syntetiske molekyler, hvis oprindelige funktioner er tidsmæssigt maskeret af kovalent vedhæftet foto-flytbare beskyttelse grupper. Interessant, bur forbindelser af biologisk relevante molekyler giver en uundværlig metode til spatiotemporale kontrol af cellulære fysiologi1,2,3,4,5 ,6. I 1977 rapporterede Engels og Schlaeger 2-nitrobenzyl ester af lejren som en membran gennemtrængelig og photolabile derivat af cAMP7. Det følgende år, Kaplan rapporterede 1-(2-nitrophenyl) ethylester af ATP (NPE-ATP) og hedder denne sammensatte "caged" ATP8. Siden da, en række fotokemisk aftagelige beskyttende grupper såsom 2-nitrobenzyls, p-hydroxyphenacyls9, 2-(2-nitrophenyl) ethyls10,11, 7-nitroindolin-1-yls12, 13, og (coumarin-4-yl) methyls14,15,16 er blevet anvendt til fremstilling af bur forbindelser.
Syntesen af bur forbindelser med ønskelige yderligere egenskaber såsom membran permeabilitet, vandopløselighed, og cellulære målretning evne forventes at lette celle biologiske applikationer. Da de fysiske og foto kemiske egenskaber af disse molekyler primært afhænger af den kemiske struktur af de fotokemisk flytbare beskyttelse grupper, der anvendes til at forberede dem, et mangfoldigt repertoire af foto-caging grupper er påkrævet. Men den strukturelle mangfoldighed af nuværende tilgængelige anbringelse grupper, der udviser høj fotolyse effektivitetsgevinster er begrænset. Dette kunne være en hindring for at øge brugen af bur forbindelser.
For at løse dette problem, er repertoiret af foto-caging grupper blevet udvidet med den kemiske modifikation af eksisterende photoremovable beskyttelse grupper eller udformningen af nye photolabile kromoforer med overlegne photophysical og foto kemiske egenskaber. Eksempler omfatter nitrodibenzofuran (ndbf)17, [3-(4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl) -2-butyl] (dmnpb)18,19, et calcium følsomt 2-nitrobenzyl photocage20, substitueret coumarinylmethyls (DEAC45021 , Deadccm22, 7-azetidinyl-4-methylcoumarin23, og styryl coumariner24), cyanine derivater (cyet-pan)25, og bodipy derivater26,27.
Derudover har vi tidligere udviklet (6-Bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl) methyl (BHC) gruppe og med succes syntetiseret forskellige bur forbindelser af neurotransmittere28, anden budbringere29,30, og oligonukleotider31,32,33 udviser store en-og to-foton excitation tværsnit. Hvis yderligere egenskaber kan installeres nemt i anbringelse grupper uden at kompromittere deres lysfølsomhed, så repertoiret af bur forbindelser kan udvides34,35,36, 37,38,39. Vi designede derfor modulære bur-forbindelser, der består af tre dele, nemlig BHC-gruppen som en foto lydhør kerne, kemiske håndtag til installation af yderligere funktionaliteter og de molekyler, der skal maskeres40, 41.
Således indeholder denne artikel en praktisk metode til fremstilling af bur forbindelser af biologisk relevante molekyler. Denne protokol beskriver metoder til udarbejdelse af en klikbar platform for foto-caging grupper, indførelse af yderligere funktionaliteter til at udvide repertoiret af bur forbindelser, måling af deres fysiske og foto kemiske egenskaber, og den celle-type selektiv målretning af en klikbart bur sammensatte for yderligere cellulære applikation.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>acetonitrile, EP</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>00404-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile, super dehydrated</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>010-22905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic, 100X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-bromoresorcinol</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>B0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-carbonyldiimidazole</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>034-10491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Kanto</td>
			<td>07278-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) Sulfate Pentahydrate, 99.9%</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>032-12511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichloromethane, dehydrated</td>
			<td>Kanto</td>
			<td>11338-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-Diisopropylcarbodiimide (DIPC)</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-dimethylaminopyridine</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D1450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylsulfoxide, dehydrated -super-</td>
			<td>Kanto</td>
			<td>10380-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual light source fluorescence illuminator, IX2-RFAW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5)</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>054-07225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 4-Chloroacetoacetate</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>C0911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 with L-Glutamine and Phenol Red</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>087-08335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>087-01076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted fluorescent microscope IX-71</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOLUTE Phase Separator, 15 mL</td>
			<td>Biotage</td>
			<td>120-1906-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>196-01252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning fluorescence confocal microscopy, FLUOVIEW FV1200/IX-81</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668027</td>
			<td>lipofection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>345-01804</td>
			<td>MOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-nitrophenylchloroformate (4-NPC)</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>C1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11058021</td>
			<td>reduced serum medium contains no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,10&#8208;Phenanthroline Monohydrate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26707-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps</td>
			<td>Rayonet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>W01SRM19-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31115-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>199-05985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid, 96-98%</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>190-04675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA)</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>762342-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tri&#8208;Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31404-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon light source, MAX-303</td>
			<td>Asahi Spectra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design, synthesis, and photochemical properties of clickable caged compounds

Caged forbindelser muliggør foto-medieret manipulation af celle fysiologien med høj spatiotemporale opløsning. Den begrænsede strukturelle diversitet i de aktuelt tilgængelige anbringelse-grupper og vanskelighederne i forbindelse med syntetisk modifikation uden at ofre deres fotolyse effektivitet er imidlertid hindringer for at udvide det repertoire af bur forbindelser til levende celle Programmer. Da den kemiske modifikation af coumarin-typen foto-caging grupper er en lovende tilgang til fremstilling af bur forbindelser med forskellige fysiske og kemiske egenskaber, rapporterer vi en metode til syntese af klikbare bur forbindelser, der kan ændres let med forskellige funktionelle enheder via kobber (I)-katalyseret Huisgen cyklisering. Den modulære platform molekyle indeholder en (6-Bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl) methyl (BHC) gruppe som en foto-caging gruppe, som udviser en høj fotolyse effektivitet i forhold til de konventionelle 2-nitrobenzyls. Der fremlægges generelle procedurer for tilberedning af klikbare bur-forbindelser indeholdende aminer, alkoholer og carboxylater. Yderligere egenskaber såsom vandopløselighed og celle målretning evne kan let inkorporeres i klikbar bur forbindelser. Desuden blev de fysiske og foto kemiske egenskaber, herunder fotolyse kvante udbyttet, målt og fandtes at være overlegne i forhold til de tilsvarende BHC-bur-forbindelser. Den beskrevne protokol kan derfor betragtes som en potentiel løsning på manglen på strukturel diversitet i de tilgængelige bur-forbindelser.

Klikbare bur forbindelser af nogle biologisk interessante molekyler, herunder arachidonsyre og paclitaxel, blev med succes syntetiseret (figur 1)28,41. Yderligere egenskaber såsom vandopløselighed og cellulære målretnings evne blev introduceret i paBhcmoc-PTX via kobber (I)-katalyseret Huisgen cyklisering ("Click"-reaktion) (figur 2). Disse klikbare bur ptxs blev derefter photolyzed til at producere deres forælder ptxs ved bestråling ved 350 nm (figur 3), og de fysiske og foto kemiske egenskaber af de klikbare bur forbindelser er opsummeret i tabel 1. Quantum-udbyttet af klikbare bur-forbindelser 2-GLC-pabhcmoc-PTX(φDIS 0,14) og pabhc-AA(φDIS 0,083) var mere end dobbelt så meget som de konventionelle BHC-bur-forbindelser 2-bhcmoc-PTX (φDIS 0,040) og BHC-AA (Φdis 0,038)43. Desuden blev der observeret en forbedret vandopløselighed for 2-GLC-paBhcmoc-PTX, som indeholder en glucoseparthed.
I levende celle eksperimenter blev målretningen af paBhc-hex-FITC/Halo til de dyrkede pattedyrsceller, der transitivt udtrykker et fusionsprotein af et HaloTag-protein og epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), opnået med succes. Grøn fluorescens af fluorescein delen af paBhc-hex-FITC/Halo blev observeret på cellemembranen (figur 4). Der blev opnået foto medieret graduering af den subcellulære lokalisering af en kinase ved hjælp af en pabhc-bur-forbindelse. Translokation af diacylglycerinkinase γ (DGKγ) er blevet rapporteret til at være aktiveret ved tilstedeværelse af arachidonsyre (AA)44. CHO-K1-celler, der i forbigående udtrykker GFP-DGKγ, blev behandlet med enten AA eller paBhc-AA (5). Tilsætning af AA forårsagede modulationen af den subcellulære lokalisering af DGKγ (figur 5A, B). Tilsvarende ændringer i lokaliseringen af DGKγ blev observeret for de paBhc-AA-behandlede celler efter udsættelse for UV-lys (figur 5C, D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig01.jpg"> Figur 1: klargøring af de klikbare bur forbindelser. A) reagenser og betingelser: a. ethyl 4-chloracetoacetat/conc. H2so4/rt/7 dage/91% afkast, b. 1 M HCL/reflux/3 dage/97% udbytte. c. N-methylpropargylamin/HCHO/EtOH, tilsæt derefter (1) og Opvarm ved refluks for 17 t/79% udbytte. (B) synteser af de klikbare bur Amin, PTX, og arachidonsyre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig01large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig02.jpg"> Figur 2: installation af funktionelle enheder i klikbare bur forbindelser. A) syntese af et vandopløseligt, bur PTX via kobber (i)-katalyseret huisgen-cyklisering. (B) strukturer af klikbare bur forbindelser, der indeholder halotag ligand for cellulær målretning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig02large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig03.jpg"> Figur 3: Photolyse af 2-GLC-paBhcmoc-PTX (6). Prøver (10 μM) i K-MOPS opløsning (pH 7,2) blev bestrålet ved 350 nm. A) typiske HPLC-spor for fotolysen på 6 (målt ved 254 nm). Prøverne blev analyseret ved den specificerede bestrålings tid. B) tidsforløb for fotolysen af 6. Blå cirkler viser forbruget af 6. Den solide linje viser den mindste kvadraters kurve, der passer til en simpel rådnende eksponentiel for 6. Røde firkanter viser udbyttet af PTX. Fejllinjerne repræsenterer standardafvigelsen (± SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig03large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig04.jpg"> Figur 4: fluorescensbilleder af dyrkede pattedyrsceller inkuberet med paBhc-hex-FITC/Halo (8). Celler transficeret med pcDNA3-Halo-EGFR blev inkuberet med en 2 μM opløsning af sammensatte 8 ved 37 °c i 30 min. Billederne blev opnået efter gentagen vask med PBS +. Mock-behandlede HEK293T celler (A: differential interferens kontrast (dic) billede og D: fluorescens billede). HEK293T celler (b og e) og Hela celler (C og F) transitivt udtrykker Halo-EGFR (b og C: dic billeder og e og F: fluorescensbilleder). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig04large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig05.jpg"> Figur 5: fluorescensbilleder efter UV-bestråling af Cho-K1-cellerne inkuberet med BHC bur arachidonsyre. CHO-K1-celler blev transficeret med et fusionsprotein DGKγ-EGFP. A) et fluorescens billede af de transficeret celler. B) 100 s efter tilsætning af en 10 μM opløsning af arachidonsyre. C) cellerne blev inkuberet med en 10 μM-opløsning af pabhc-AA (5) ved 37 °c i 5 min. (D) 100 s efter 20-s UV-bestråling (330 – 385 nm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig05large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Forbindelser</td>
			<td>λMax (nm)a
</td>
			<td>εMax (M-1 cm-1)b
</td>
			<td>φDISc
</td>
			<td>εφDISd
</td>
			<td>Opløselighed (μM)e
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ptx</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,0</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-bhcmoc-PTX</td>
			<td>340</td>
			<td>10500</td>
			<td>0,040</td>
			<td>400</td>
			<td>55</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-paBhcmoc-PTX</td>
			<td>359</td>
			<td>9300</td>
			<td>0,059</td>
			<td>670</td>
			<td>8,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-GLC-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>373</td>
			<td>12300</td>
			<td>0,14</td>
			<td>1280</td>
			<td>650</td>
		</tr>
<tr>
<td>BHC-AA</td>
			<td>341</td>
			<td>10800</td>
			<td>0,038</td>
			<td>390</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>paBhc-AA</td>
			<td>366</td>
			<td>10300</td>
			<td>0,083</td>
			<td>750</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: fysiske og foto kemiske egenskaber af de klikbare bur forbindelser. a. absorptionsmaksimum (nm), b. molær absorptionsevne ved λMax (M− 1 cm− 1), c. kvanteudbytte af råvarernes forsvinden ved 350 nm, d. Produktet af molær absorptivitet og Quantum udbyttet af forsvinden ved 350 nm, e. Koncentrationen af den mættede opløsning i K-MOPS (pH 7,2) (μg mL− 1).

Watch this Scientific Journal Video about Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds at JoVE.com

Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds

En protokol til syntese og måling af de foto kemiske egenskaber af modulære bur forbindelser med klikbare fugt præsenteres.

Design, syntese, og foto kemiske egenskaber af klikbare Caged forbindelser

Caged compounds enable the photo-mediated manipulation of the cell physiology with high spatiotemporal resolution. However, the limited structural ...

Det overordnede mål med denne procedure er at give en praktisk metode til fremstilling af fotokagede forbindelser med yderligere egenskaber såsom vandopløselighed eller cellulære målretning evne. Ved hjælp af en simpel syntetisk procedure, denne teknik kan bruges til at udvide laboratoriet over bur forbindelser og til at gøre bur forbindelser med yderligere egenskaber uden at gå på kompromis med deres lysfølsomhed. Denne syntese kan udføres i et standardlaboratorium, da vores klikbare burforbindelser er stabile for fotobestråling, når de opløses i ikke-nukleofile organiske opløsningsmidler såsom dichlormethan eller dimethylsulfoxid.Demonstration af proceduren med Hirona Sasaki vil være Akinobu Suzuki, en post-doc, Hanami Aoki og Rei Watahiki, grad studerende fra laboratoriet. Begynd med at tilsætte 709,6 milligram paBhc methanol og 397,6 milligram n-carbonyldiimidazol i en 30-milliliter rundbundet kolbe. Der tilsættes seks milliliter dichlormethan til kolben, og opløsningen omrøres ved omgivelsestemperatur i en time.Ved slutningen af inkubationen tilsættes 342,8 mg 4-Dimethylaminopyridin og 552 mikroliter tert-butyl seks-amino hexylcarbamat, og rør opløsningen ved omgivelsestemperatur i yderligere tre timer. Brug derefter en roterende fordamper under vakuum til at fjerne opløsningsmidlet og andre flygtige materialer, og brug silica gel flash kolonne kromatografi til at rense restproduktet direkte. For at installere en funktionel enhed i klikbare bur sammensatte, opløse 249 milligram kobber to sulfat pentahydrat i 10 milliliter ion-vekslet vand til at give en 0,1 kindtand kobbersulfat opløsning.Opløs otte milligram to prime paBhc mock paclitaxel, 7,5 milligram tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine, 162,4 milligram natrium-l-ascorbat og 3,1 mg 15-chloro-3, 6, 9-trioxypentyldecyl azide i et blandet opløsningsmiddel på 2,5 milliliter 0,1 molarphosphat buffer og 0,5 milliliter dimethylsulfoxid. Dernæst tilsættes 81,2 mikroliter af 0,1 kindtand kobbersulfatopløsning til reaktionsblandingen og rør blandingen ved omgivelsestemperatur i 80 minutter, hvilket overvåger reaktionens forløbet med HPLC. Ved reaktionens afslutning skal bundfaldsansættene løses med 3,5 milliliter af en 75%acetylnitylvandopløsning, og den resulterende opløsning påføres direkte på det semi-præparative HPLC-system for at rense det ønskede produkt.Til kvanteeffektivitetsmålinger fortyndes prøvebestandsopløsningen under lysstofrør, der er dækket med UV-lysafskåret filter, i 10 mikroliter dimethylsulfoxid med 10 milliliter KMOPS-buffer. Opløsningen overføres til det samme reagensglas, der anvendes i det kemiske aktinometers fotoreaktion. Bestråling prøveopløsningen med 350 nanometerlys i fem sekunder og fjerner 50 mikroliter aliquots fra den bestrålede opløsning med jævne mellemrum til analyse af HPLC.Bestrålingstiden bestemmes derefter i sekunder, hvor 90 % af udgangsmaterialet reagerede ved montering af observationsområder af udgangsmaterialets tidsafhængige forsvinden. For HaloTag ligand målretning af en klikbar bur sammensatte, høste målcellen population af interesse med en passende celle dissociation reagens og re-suspendere cellerne i en 2,5 gange 10 til den femte celler pr milliliter DMEM koncentration. Derefter frø ca 10 til den femte celler pr fad i 35 milliliter glas bund retter til en overnatning inkubation ved 37 grader celsius og 5% kuldioxid.Næste morgen fortyndes 14 mikrogram pc-DNA tre halo epidermal vækstfaktor receptor plasma DNA i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør indeholdende 700 mikroliter reduceret serummedium. Dernæst tilsættes fem mikroliter af lipofection reagens i 150 mikroliter af reduceret serum medium til hver af fire rør og lad rørene til at stå ved omgivelsestemperatur i fem minutter. Ved inkubationens afslutning tilsættes der 150 mikroliter fortyndet plasma-DNA til hver af de fortyndede lipofection reagensprøver, og prøverne inkuberes ved omgivelsestemperatur i yderligere fem minutter.Ved inkubationens afslutning skylles cellerne med to milliliter PBS pr. skål, og der tilsættes 1,5 milliliter reduceret serummedium til hver dyrkning. Der tilsættes 150 mikroliter af plasmid lipofection reagenskomplekset til hver skål og returnere cellerne til cellekulturinkubatoren i 48 timer. Ved slutningen af inkubationen, aspirere supernatanter og tilsæt en milliliter frisk forberedt DMEM suppleret med to mikromolar paBhc hex fitzi glorie til hver skål.Efter 30 minutter ved 37 grader celsius, aspirere mediet indeholder bur sammensatte og skyl cellerne to gange med en milliliter PBS plus at fjerne eventuelle ubundne forbindelser. Tilsæt 500 mikroliter reduceret serummedium til hver skål og returnere cellerne til cellekulturinkubatoren i yderligere 30 minutter for at fjerne de forbindelser, der kom ind i cellerne. Ved slutningen af inkubationen skylles cellerne to gange med en milliliter PBS plus pr. skål, og der tilsættes en milliliter medium uden fenolrød til hver kultur.Derefter optage florescence billeder ved laser scanning konfokal florescence mikroskopi. Til fotomedieret modulering af kinase lokalisering ved hjælp af en klikbar bur sammensatte, frø ca fem gange 10 til den femte TOC-A-en celler i to milliliter af Ham's F12 medium pr 35 milliliter glas bund skål. Den næste dag, transfect cellerne med plasmid kodning for GFP diacylglycerol kinase gamma i 48 timer som netop påvist.Efter afslutningen af transinfektionen udskiftes transfektionssupernatanten med to milliliter reduceret serummedium. Tilsæt 20 mikroliter af 100 gange paBhcAA arbejdsløsning til cellerne for en fem til 60 minutters inkubation ved 37 grader celsius og 5% kuldioxid. Ved slutningen af inkubationen skal skålen placeres på den objektive fase af et omvendt fluorescerende mikroskop udstyret med en fluorescenslyse i dobbelt lyskilde.Billede cellerne hver 10 sekunder i 10 minutter, mens de bestråler cellerne på de relevante eksperimentelle tidspunkter og bølgelængder i henhold til forsøgsprotokollen. Ved hjælp af denne metode som påvist, klikbare bur forbindelser af nogle biologisk interessante molekyler, herunder paclitaxel og arachidonsyre, kan med held syntetiseres. Yderligere egenskaber såsom vand opløselighed og cellulære målretning evne kan indføres i paBhc mock paclitaxel via kobber en katalyseret cyklisering klik reaktion.Disse klikbare bur paclitaxels kan derefter fotolyses til at producere deres forældreforbindelser ved bestråling ved 350 nanometer. De fysiske og fotokemiske egenskaber af de klikbare burforbindelser er sammenfattet i tabellen. I levende celle eksperimenter, målretning af paBhc hex fitzi glorie til dyrkede pattedyr celler forbigående udtrykke en HaloTagged protein og epidermal vækstfaktor receptor inducerer en grøn florescence signal fra fluorescein moiety PAHBHC hex fitzi glorie på cellemembranen.Endvidere, behandling af CHO-K1 celler forbigående udtrykke GFP diacyl glycerol kinase gamma med arachidonsyre forårsager graduering af den subcellulære lokalisering af diacyl glycerol kinase gamma. Lignende ændringer i diacyl glycerol kinase gamma lokalisering er også observeret i paBhc-AA behandlede celler efter UV-lys eksponering. Når du udfører ca. eksperimenter i vandige løsninger, der øger kulturmediet, skal du altid arbejde under lysstofrør med kortbølgelængde, der er udjævnet filter.Efter denne procedure, Du kan studere bur forbindelser, der har været rigelige til brug i biologiske eksperimenter på grund af manglende vand opløselighed, membran permeabilitet eller cellulære målretning evne.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Synthesis of Antiviral Tetrahydrocarbazole Derivatives by Photochemical and Acid-catalyzed C-H Functionalization via Intermediate Peroxides (CHIPS)

Synthesis of Antiviral Tetrahydrocarbazole Derivatives by Photochemical and Acid-catalyzed C-H Functionalization via Intermediate Peroxides CHIPS

Syntese af antiviral tetrahydrocarbazol Derivater af fotokemisk og Syre-katalyseret CH Funktionalisering via mellemliggende peroxider (chips)

The direct functionalization of C-H bonds is an important and long standing goal in organic chemistry. Such transformations can be very powerful in order ...

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

Syntese af uensartet Pr-doteret SrTiO<sub&gt; 3</sub&gt; Keramik og deres Termoelektrisk Properties

We demonstrate a novel synthesis strategy for the preparation of Pr-doped SrTiO3 ceramics via a combination of solid state reaction and spark plasma ...

Photochemical Oxidative Growth of Iridium Oxide Nanoparticles on CdSe@CdS Nanorods

Fotokemiske oxidative Vækst af Iridium Oxide Nanopartikler på CdSe @ CdS nanorods

We demonstrate a procedure for the photochemical oxidative growth of iridium oxide catalysts on the surface of seeded cadmium selenide-cadmium sulfide ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntese og karakterisering af supramolekylære Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Syntese af ormelignende Miceller af synligt lys Mediated Dispersion polymerisering Brug Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

Syntese og karakterisering af Fe-doteret aluminiumsilicat nanorør med Enhanced Electron ledende egenskaber

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

Syntese af substrat-bundet Au Nanowires Via en aktiv overflade vækst mekanisme

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a ...

Surface Properties of Synthesized Nanoporous Carbon and Silica Matrices

Overflade egenskaber af syntetiserede Nanoporous kulstof og Silica matricer

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) ...

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

Spatiotemporally kontrolleret nuklear translokation af gæster i levende celler ved hjælp af bur molekylære lim som Photoactivatable Tags

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

Synthesis and Characterization of Amphiphilic Gold Nanoparticles

Syntese og karakterisering af Amphiphilic guld nanopartikler

Gold nanoparticles covered with a mixture of 1-octanethiol (OT) and 11-mercapto-1-undecane sulfonic acid (MUS) have been extensively studied because of ...