Name: design, synthesis, and photochemical properties of clickable caged compounds
Uploaded: 2019-10-15T13:00:00
Duration: 9 min 44 s
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Questo lavoro è stato supportato dal numero di sovvenzione JP16H01282 (TF), un Grant-in-Aid per la ricerca scientifica sulle aree innovative "Memory Dynamism" e JP19H05778 (TF), "MolMovies".

1. Sintesi del gruppo modulare caging paBhc per composti in gabbia cliccabili28,41
<ol><li>
Preparazione del cloruro metile (Bhc-CH2 Cl)
	<ol>
<li>Mettere 4 bromoresorcinol (9,742 g, 51,5 mmol) in una fiaschetta a fondo rotondo da 100 ml dotata di una barra stirrer.</li>
		<li>Aggiungere il conc. H2SO4 (98%, 30 mL) al pallone e mescolare il composto per sciogliere.</li>
		<li>Aggiungere gocciolare a 4 cloroacetoaceati (10 mL, 74 mmol).</li>
		<li>Continuare a mescolare la miscela a temperatura ambiente per 5 giorni.</li>
		<li>Separatamente, mettere cubetti di ghiaccio tritati (200 mL) in una fiaschetta Erlenmeyer da 500 mL.</li>
		<li>Versare la miscela di reazione nel ghiaccio e mescolare vigorosamente per 30 min fino a ottenere un precipitato finemente in polvere.</li>
		<li>Raccogliere il precipitato tramite filtrazione sottovuoto. Lavare il precipitato marrone chiaro con acqua cinque volte.</li>
		<li>Asciugare il precipitato sotto vuoto durante la notte per produrre BhcCH2Cl come polvere marrone chiaro (13,57 g, 46,9 mmol).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di (6-bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl)metanolo (BhcCH2OH)
	<ol>
<li>Collocare il BhcCH2Cl preparato (1,1440 g, 3,95 mmol) e 1 M HCl (300 mL) in una fiaschetta a fondo rotondo da 1 L L dotata di un condensatore Dimroth. Mescolare il composto a 140 gradi centigradi per 5 giorni. Dopo questo tempo, raffreddare la miscela a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere l'acqua dalla reazione evaporazione rotante sotto vuoto per produrre BhcCH2OH (1) come polvere marrone chiaro (1.0359 g, 3.82 mmol, 97% resa). NOTA: L'uso di 250 mL di 1 M HCl per 1 g di BhcCH2Cl dà un risultato soddisfacente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del paBhcCH2OH (2) tramite la reazione di Mannich
	<ol>
<li>Posizionare la paraformaldeide (446,4 mg, 14,9 mmol) in una fiaschetta a fondo rotondo da 50 mL. Aggiungere l'anidriolo (5 mL) e N-metilparpargylamine (1,25 mL, 14,8 mmol) al flacone.</li>
		<li>Mescolare il composto a temperatura ambiente per 1 h sotto un'atmosfera Ar.</li>
		<li>Aggiungere BhcCH2OH (1) (1.367 g, 5.04 mmol) al pallone. Riscaldare il composto a 80 gradi centigradi con un apparato riscaldatore a blocchi e continuare a mescolare la miscela a 80 gradi centigradi per 2 h sotto un'atmosfera Ar.</li>
		<li>Fermare il riscaldatore a blocchi e raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente.</li>
		<li>Raccogliere il precipitato chiaro-giallo chiaro risultante con filtrazione sottovuoto. Lavare il precipitato due volte con una piccola quantità di etanolo anidroso (1 mL ogni volta).</li>
		<li>Rimuovere l'etanolo in eccesso sotto vuoto per produrre paBhcCH2OH (2) (1.393 g, 3.96 mmol).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione di composti in gabbia selezionabili
NOTA: le seguenti procedure possono essere applicate alla preparazione di altri composti in gabbia cliccabili contenenti gruppi funzionali idrossili, aminoacidi e carboxili.
<ol><li>
Procedura generale 1: Preparazione di un'ammina in gabbia cliccabile
	<ol>
<li>Posizionare paBhcCH2OH (2) (709,6 mg, 2,02 mmol) eN'-carbonyl diimidazole (CDI, 397,6 mg, 2.455l) in una flacone dal fondo rotondo da 30 mL. Aggiungere CH2Cl2 (6 mL) e mescolare la soluzione a temperatura ambiente per 1 h.</li>
		<li>Aggiungere 4-dimetilaminopyridina (4-DMAP, 324.8 mg, 2.66 mmol) e tert-butyl(6-aminohexyl)carbamate (533.1 mg, 2.46 mmol). Mescolare la soluzione a temperatura ambiente per 3 h.</li>
		<li>Rimuovere il solvente e altri materiali volatili utilizzando un evaporatore rotante sotto vuoto. Purificare il residuo direttamente utilizzando la cromatografia a colonna flash di silice.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedura generale 2: Preparazione di un alcool in gabbia cliccabile
	<ol>
<li>Colloca il paclitaxel (PTX, 48,7 mg, 0,057 mmol) in un flacone dal fondo rotondo da 30 mL dotato di un pallone a tre vie e di un palloncino Ar. Aggiungere il cloroformato secco CH2Cl2 (1 mL), 4-DMAP (17,1 mg, 0,14 mmol) e il cloroformato 4-nitrophenyl (26,0 mg, 0,13 mmol).</li>
		<li>Mescolare la soluzione a temperatura ambiente per 2,5 h sotto un'atmosfera Ar.</li>
		<li>Aggiungere 4-DMAP (15,7 mg, 0,13 mmol) e paBhcCH2OH (2) (39,1 mg, 0,111 mmol) alla soluzione. Continuare a mescolare la miscela a temperatura ambiente per 17 h.</li>
		<li>Aggiungere CHCl3 (10 mL) e 15% acquoso NaHCO3 (5 mL) alla miscela. Mescolare vigorosamente il composto per circa 3 min.</li>
		<li>Aggiungere al flacone lo strato organico 0,5 M di acido citrico (5 mL). Mescolare il composto e rimuovere lo strato acquoso come sopra.</li>
		<li>Separare lo strato organico utilizzando una colonna di separazione di fase. Rimuovere i solventi con un evaporatore rotante sotto vuoto. Purificare il prodotto utilizzando la cromatografia standard a colonna gel di silice.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedura generale 3: Preparazione di un acido carboxillico in gabbia cliccabile
	<ol>
<li>Sciogliere l'acido aracidico (33,0 l, 0,100 mmol), paBhcCH2OH (2) (39,6 mg, 0,112 mmol) e 4-DMAP (14,1 mg, 0,115 mmol) in asciutto CH2Cl2 (2 mL). Aggiungete N, N -diisopropylcarbodiimide (DIPC, 17,0 ll, 0,110 mmol) e mescolate la soluzione a temperatura ambiente per 140 min.</li>
		<li>Rimuovere il solvente sotto vuoto. Purificare il residuo direttamente utilizzando la cromatografia a colonna flash di silice.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Installazione di un'unità funzionale nei composti in gabbia selezionabili
<ol><li>Sciogliere rame (II) solfato pentaidrato (249 mg) in acqua scambiata dagli ioni (IEW, 10 mL) per dare una soluzione cuSO4 da 0,1 M.</li>
	<li>Sciogliere 2 s-paBhcmoc-PTX (8,0 mg, 6,5 zmol), tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA, 17,5 mg, 40,3 smol), l-ascorbate di sodio (162,4 mg, 0,825 mmol) e 15-cloro-3,6,9-trioxapentadecyl azide (3,1 mg, 11 zmol) in un solvente misto di 0,1 M fosfato (2,5 mL, pH 7,2) e solforosi dimetilo (DMSO, 0,5 mL).</li>
	<li>Aggiungere la soluzione CuSO4 da 0,1 M (81,2 , 8,1 ml) alla miscela di reazione. Mescolare la miscela a temperatura ambiente per 80 min. Monitorare l'avanzamento della reazione utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).</li>
	<li>Sciogliere i precipitati aggiungendo una soluzione acetonitrile/acqua del 75% (3,5 mL). Applicare la soluzione risultante direttamente al sistema HPLC semi-preparativo per purificare il prodotto desiderato. NOTA: La solubilizzazione della miscela di reazione con l'aggiunta di tert-butanol può accelerare la progressione della reazione.</li>
</ol>4. Reazione fotolitica disfacimento dei composti in gabbia
<ol><li>Preparazione delle soluzioni azionarie
	<ol>
<li>Sciogliere il composto in gabbia desiderato (5 ml) nel DMSO (500 oL) per preparare una soluzione di riserva di 10 mM. Distribuisci una aliquota di ogni soluzione (10 l) in un tubo di microcentrifuga di 1,5 mL e conservalo in un congelatore (20 gradi centigradi) fino a poco prima dell'uso.</li>
		<li>6 mM K3[Fe(C2O4)3] (100 mL): Sciogliere il ferrioxalate di potassio ricristallizzato (0,295 g, 0,675 mmol) in 80 mL di acqua. Aggiungere 0,5 M H2SO4 (10 mL) e una quantità appropriata di IEW per fare il volume a 100 mL. NOTA: Il ferrioxalato di potassio deve essere purificato tramite la ricristallizzazione dall'acqua calda e conservato al buio. Il ferrioxalato di potassio ricristallista si ottiene come triidrato; pertanto, la sua formula è K3[Fe(C2O4)3] , 3H2O e un peso della formula di 491,24 deve essere considerato durante la preparazione della soluzione stock. Controllare la purezza della soluzione da 6 mM misurandone l'assorbimento a 510 nm. Se l'assorbimento è <0.02, è adatto per l'utilizzo nell'esperimento.</li>
		<li>0,1% Buffer-phen (30 mL): Dissolvere NaOAc-3H2O (7,35 g), 1,10-fenantroline (phen) H2O (30 mg)e conc. Aggiungere IEW per fare il volume a 30 mL. NOTA: La soluzione contiene 1,8 M NaOAc, 0,54 M H2SO4e 0,1% 1,10-fenantroline.</li>
	</ol></li>
	<li>Misurazione del numero di fotoni che utilizzano l'attivita ferrioxalate
	<ol>
<li>Mettere 6 mM K3[Fe(C2O4)3] (V1 L) in una cuvette al quarzo. Irradiare la soluzione con 350 nm luce per 5 s.</li>
		<li>Trasferire la soluzione irradiata in una cuvette Pyrex con una lunghezza del percorso l [cm].</li>
		<li>Aggiungere lo 0,1% Buffer-phen (V2 L) alla soluzione campione irradiato e mescolare bene con la pipettatura. Misurare l'assorbimento del campione a 510 nm. Calcolare il cambio di assorbimento medio per unità di tempo (z.510 [ss s )).</li>
		<li>Calcolare il numero di talpe di generazione fe 2 ioni Fe2 o più per unità di tempo secondo la seguente equazione: nFe2s [mol ss s n. 1] - ((Medio1 - V2) [L] - - A510 [s-1])/(l [cm] - s510 [L mol- 1 cm - 1 cm]), dove (V1 - V2) è il volume del campione per la misurazione dell'assorbimento, l è la lunghezza ottica del percorso della cuvette, e510 è l'absorptivity molare del Fe2 phen complex a 510 nm. NOTA: Nelle condizioni sperimentali tipiche, i valori di V1 , 2,0 , 10 ,3 L, V2 , 0,33 , 10 x3 L, l , 1,0 cm, e s.510 - 1,1 x 104 ln cmn. 1 sono stati utilizzati.</li>
		<li>Calcolare il numero di talpe di fotoni che raggiungono il campione (I0) utilizzando la seguente formula: I 0 [einstein cms 2 ss s s 1] dove 350 è l'efficienza quantistica della fotoriduzione del ferrioxalato a 350 nm. NOTA: Anche se l'efficienza quantistica dell'actinometro del ferratodio di potassio a 350 nm non è riportata, è stato impiegato il valore riportato di 1,2542 a 358 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Misurazioni dell'efficienza quantistica a 350 nm
	<ol>
<li>Diluire la soluzione di stock di campioni (in DMSO, 10 ) con buffer K-MOPS (pH 7,2, 10 mL) per dare una soluzione da 10 M in K-MOPS contenente 0,1% DMSO. NOTA: il buffer K-MOPS consisteva di 100 mM KCl e 10 mM 3-( N-morpholino)acido propanefonico (mop) titolato a pH 7.2 con KOH.</li>
		<li>Trasferire un'aliquota della soluzione (V1 L) nella stessa cuvette utilizzata nella fotoreazione dell'actinometro chimico. Irradiare la soluzione di esempio utilizzando la stessa configurazione descritta nel passaggio 4.2.1.</li>
		<li>Rimuovere periodicamente un'aliquota (50 -L) dalla soluzione irradiata e analizzarla utilizzando HPLC.</li>
		<li>Determinare il tempo di irradiazione, in secondi, in cui il 90% del materiale di partenza ha reagito (t90%) montando appezzamenti della scomparsa dipendente dal tempo del materiale di partenza. NOTA: l'assorbimento del campione irradiato deve essere mantenuta a <0.1 in modo che il filtraggio interno delle radiazioni possa essere trascurato. È auspicabile che il consumo fotolitico del materiale di partenza possa essere approssimato da un decadimento singolo-esponenziale in modo che non vi sia alcun effetto secondario indesiderato che interferisca con il processo di fotolisi.</li>
		<li>Calcolare la resa quantica della scomparsa (:diss) utilizzando la seguente equazione28: -dis : 1/(t90% , I0 , 350) dove t90% [s] è il tempo di irradiazione in cui il 90% del materiale di partenza è stato consumato, I0 [einsteins s-1] è il numero di talpe di fotoni, e350 [cm 2 moln. 1] è il coefficiente di estinzione decadico del campione a 350 nm. N.B.:350 [cm2 mol-1] : 103x350 [M.1 cm- 1cm ]. </li>
	</ol></li>
</ol>5. Targeting di un composto in gabbia cliccabile con un ligando HaloTag
NOTA: Prima dell'uso, mantenere le cellule HeLa nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM, glucosio basso, pyruvate di sodio, l-glutamina) integrato con 10% siero bovino fetale (FBS) contenente 1% antibiotici (streptomicina solfato, penicillina G e anforfetae) a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2.
<ol><li>Togliere il mezzo e provare le cellule trattando con l'acido trisellenediaminetracetraacetico (EDTA, 1 mL) a 37 ml per 1 min. Aggiungere DMEM (4 mL) alle cellule e ri-sospendere le cellule pipetando delicatamente. Semina circa 5 x 105 celle per piatto in piatti di fondo in vetro da 35 mm in DMEM (2 mL) 24 h prima della trasfezione.</li>
	<li>Per quattro piatti, in un tubo di microcentrismo da 1,5 ml, diluire il DNA plasmide (pcDNA3-Halo-EGFR, 14 g) nel mezzo siero ridotto (700 . Separatamente, diluire il reagente di lipofection (5 ll) nel mezzo siero ridotto (150 ) in ciascuno dei quattro tubi e lasciarli riposare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
	<li>Aggiungere una porzione del DNA diluito del plasmide (150 oL) a ciascuno dei campioni di reagente dilatazione diluito. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
	<li>Dopo aver mantenuto le cellule a 37 e 5% CO2 per 24 h, aspirare il DMEM e risciacquare le cellule con salina tamponata di fosfato (PBS, 2 mL). Aggiungere il supporto siero ridotto (1,5 mL).</li>
	<li>Aggiungere il reagente di plasmidezione (150 l) complesso ad ogni piatto. Mantenere le cellule a 37 e 5% CO2 per 48 h.</li>
	<li>Aspirare il mezzo, aggiungere una porzione di DMEM appena preparato (1 mL) contenente 2 m paBhc-hexC/Halo, e incubare le cellule a 37 e 5% di CO2 per 30 min.</li>
	<li>Aspirare il mezzo contenente il composto in gabbia e risciacquare le cellule due volte con PBS (1 mL per risciacquo) per rimuovere eventuali composti non legati. Aggiungere il siero medio ridotto (500 o L) e incubare le cellule a 37 e 5% DI CO2 per 30 min per rimuovere i composti che sono entrati nelle cellule. NOTA: PBS è salina con buffer fosfato integrata da 2 mM CaCl2 e 1 mM MgCl2.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo e sciacquare le celle due volte con PBS (1 mL). Aggiungere una porzione di un supporto (1 mL) che non contiene fenolo rosso. Registrare le immagini a fluorescenza mediante microscopia a fluorescenza confocale a scansione laser.</li>
</ol>6. Modulazione fotomediata di una localizzazione di chinasi utilizzando un composto in gabbia cliccabile
NOTA: Prima dell'uso, mantenere le cellule CHO-K1 nel mezzo F-12 di Ham integrate con 10% FBS a 37 e 5% CO2.
<ol><li>Preparare una soluzione di lavoro di 100 (1 mM) di paBhc-AA (5)in DMSO. NOTA: Una soluzione di riserva di 10 mM del composto viene preparata e conservata in un congelatore (-20 gradi centigradi).</li>
	<li>Semina circa 5 x 105 celle per piatto in piatti di fondo in vetro da 35 mm in DMEM (2 mL) 24 h prima della trasfezione.</li>
	<li>Cellule transfetate CHO-K1 con codifica plasmide per GFP-DGK 48 h prima degli esperimenti di dicaging. NOTA: la trasfezione viene eseguita secondo i passaggi 5.2–5.5.</li>
	<li>Sostituire il supporto con un supporto siero ridotto (2 mL). Aggiungete la soluzione di lavoro paBhc-AA (20 gradi centigradi) e incubate le cellule a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per un valore compreso tra 5 e 1 h. NOTA: il tempo di caricamento dipende dal composto impiegato.</li>
	<li>Posizionare le cellule sullo stadio oggettivo di un microscopio fluorescente invertito dotato di un illuminatore a fluorescenza a doppia sorgente luminosa.</li>
	<li>Prendere un'immagine fluorescente ogni 10 s. Irradiare le cellule con 330-385 nm luce attraverso un obiettivo al microscopio per un tempo adeguato. In alternativa, irradiare le cellule con luce a 405 nm utilizzando una lampada Xe attraverso fibre di quarzo flessibili.</li>
	<li>Continuare a registrare immagini fluorescenti per 10 min.</li>
</ol>

Non abbiamo niente da rivelare.

In precedenza abbiamo sviluppato composti in gabbia Bhc di varie molecole biologicamente attive che presentano elevate efficienze fotolitiche28,45,46,47. Con l'obiettivo di ampliare il repertorio dei gruppi di caging Bhc, abbiamo anche segnalato piattaforme di composti modulari in gabbia che possono essere modificati facilmente con l'introduzione di varie unità funzionali32,40,41. Il presente protocollo rappresenta quindi un metodo per la sintesi di un precursore cliccabile dei gruppi di caging Bhc che possono essere modificati tramite la ciclizzazione Huisgen catalizzata in rame (I). La sintesi del precursore cliccabile, paBhcCH2OH (2), è stata ottenuta tramite una sequenza di reazione in quattro fasi a partire dal 4-bromoresorcinol disponibile in commercio (Figura 1A). Il vantaggio dell'attuale protocollo è che non sono necessarie laboriose fasi di purificazione (ad esempio, separazioni cromatografiche a colonne).
Come precursore cliccabile paBhcCH2OH (2) può essere utilizzato per mascherare vari gruppi funzionali, composti in gabbia cliccabili di ammine, alcoli, e acidi carboxylicsono stati sintetizzati utilizzando 2 come precursore (Figura 1B). Gli ammine sono stati modificati come i loro carbamate, mentre gli alcoli sono stati modificati come i loro carbonati. Nelle procedure generali 1 e 2, CDI è stato utilizzato per la preparazione di carbamate cliccabili, mentre 4-nitrophenyl cloroformate è stato utilizzato per la preparazione di carbonati. Come indicato dal meccanismo di reazione, entrambi i reagenti possono essere utilizzati per la preparazione di carbamate e carbonati. Va anche notato che la resa del composto in gabbia desiderato dipende dalla struttura chimica della molecola da in gabbia. Altri esempi possono essere visti nei nostri rapporti precedenti28,30,33,48.
La modifica dei clic è stata quindi eseguita utilizzando una leggera modifica della procedura riportata49. L'aggiunta di tris (triazolylmethyl) ligando a base di ammina è necessaria per ottenere i prodotti desiderati in buono per le alte rese. Poiché una varietà di atti di azoto sono facilmente disponibili sia da fonti commerciali che da procedure letterarie, possiamo preparare vari composti in gabbia modulari con proprietà aggiuntive come la solubilità dell'acqua e la capacità di targeting cellulare (Figura 2).
Il rendimento quantico della fotolisi è stato poi misurato secondo una procedura riportata28,50. La figura 3 mostra che il consumo fotolitico di 2 o-glc-paBhcmoc-PTX e il rilascio di PTX sono stati approssimati rispettivamente dal decadimento e dall'aumento a immagine singola esponenziale, suggerendo che non è possibile filtrare internamente la radiazione o effetti secondari indesiderati. Sono state osservate migliori rese quantiche di fotolisi (-) e efficienze fotolisi ()per i composti in gabbia paBhc cliccabili rispetto a quelli dei composti in gabbia Bhc precedentemente segnalati (Tabella 1)41, 43. Dal momento che le efficiencies fotolisi ()di composti in gabbia Bhc sono più di cento volte superiore a quelli di 2-nitrobenzyl-tipo composti in gabbia48, il netto miglioramento dovuto alla presenza di gruppi di caging paBhc è chiaramente un vantaggio per questo sistema.
Come esperimento proof-of-concept, è stata introdotta una moiety idrofila nel 2 -paBhcmoc-PTX (4) e un ligando di puntamento cellulare è stato introdotto nel composto 3 (Figura 2). La solubilità dell'acqua di 2 s-glc-paBhcmoc-PTX era 650 volte superiore a quella del PTX padre (Tabella 1). Il targeting cellulare selettivo è stato ottenuto utilizzando un sistema di sonda di tag, e paBhcmoc-hex-FITC/Halo (8) recante il ligando HaloTag è stato indirizzato con successo alla membrana cellulare delle cellule di mammiferi coltivate che esprimono la proteina di fusione HaloTag/EGFR ( Figura 4). La modulazione fotomediata della localizzazione subcellulare di una chinasi è stata ottenuta anche utilizzando un composto in gabbia cliccabile 5 (Figura 5).
In conclusione, abbiamo dimostrato con successo un metodo per la preparazione di piattaforme cliccabili per composti foto-incagliati di molecole biologicamente interessanti che possono essere modificati facilmente con proprietà aggiuntive, come la solubilità dell'acqua e una cellulare capacità di targeting. Poiché il gruppo di caging paBhc può essere utilizzato per preparare qualsiasi molecola con gruppi funzionali modificabili, l'applicazione del presente protocollo non è limitata alle molecole descritte nel presente. Utilizzando una piattaforma modulare, vale a dire il gruppo di caging paBhc, i composti in gabbia desiderati possono essere facilmente preparati, e le loro proprietà fisiche e chimiche possono essere modulate tramite modifica del clic.

I composti in gabbia sono molecole sintetiche progettate le cui funzioni originali sono mascherate temporaneamente da gruppi di protezione foto-rimovibili collegati covalentmente. È interessante notare che i composti in gabbia di molecole biologicamente rilevanti forniscono un metodo indispensabile per il controllo spatiotemporale della fisiologia cellulare1,2,3,4,5 ,6. Nel 1977, Engels e Schlaeger riportarono l'esteriello 2-nitrobenzyl di cAMP come un derivato permeabile a membrana e fotolabile del cAMP7. L'anno successivo, Kaplan ha riferito il 1-(2-nitrophenyl)ethyl ester di ATP (NPE-ATP) e chiamato questo composto "caged" ATP8. Da allora, una serie di gruppi di protezione fotochimicamente rimovibili come 2-nitrobenzyls, p-hydroxyphenacyls9, 2-(2-nitrophenyl)ethyls10,11, 7-nitroindolin-1-yls12, 13, e (cumarina-4-yl)metili14,15,16 sono stati utilizzati per la preparazione di composti in gabbia.
La sintesi di composti in gabbia con proprietà aggiuntive desiderabili come la permeabilità della membrana, la solubilità dell'acqua e la capacità di targeting cellulare dovrebbe facilitare le applicazioni biologiche delle cellule. Poiché le proprietà fisiche e fotochimiche di queste molecole dipendono principalmente dalla struttura chimica dei gruppi di protezione fotochimicamente rimovibili utilizzati per prepararle, è necessario un repertorio diversificato di gruppi fotocaging. Tuttavia, la diversità strutturale dei gruppi attualmente disponibili che presentano elevate efficienze di fotolisi è limitata. Questo potrebbe essere un ostacolo per aumentare l'uso di composti in gabbia.
Per affrontare questo problema, il repertorio dei gruppi fotocaging è stato ampliato dalla modifica chimica dei gruppi di protezione fotorimoviziali esistenti o dalla progettazione di nuovi cromofori fotolabili con proprietà fotofisiche e fotochimiche superiori. Esempi includono nitrodibenzofuran (NDBF)17, [3-(4-5-dimethoxy-2-nitrophenyl)-2-butyl] (DMNPB)18,19, una fotocage 2-nitrobenzyl sensibile al calcio20, coumarinylmethyls sostituito (DEAC45021 , DEAdcCM22, 7-azetidinyl-4-methylcoumarin23, e styryl coumarins24), derivati di cianina (CyEt-pan)25e derivati BODIPY26,27.
Inoltre, abbiamo precedentemente sviluppato il gruppo (6-bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl)methyl (Bhc) e sintetizzato con successo vari composti in gabbia di neurotrasmettitori28, secondi messaggeri29,30, e oligonucleotidi31,32,33 che esibiscono grandi sezioni trasversali di eccitazione a uno e due fotoni. Se ulteriori proprietà possono essere installate facilmente nei gruppi di caging senza compromettere la loro fotosensibilità, allora il repertorio di composti in gabbia può essere espanso34,35,36, 37,38,39. Abbiamo quindi progettato composti modulari in gabbia che comprendono tre parti, vale a dire il gruppo Bhc come nucleo foto-reattivo, maniglie chimiche per l'installazione di funzionalità aggiuntive e le molecole che devono essere mascherate40, 41.
Pertanto, questo articolo fornisce un metodo pratico per la preparazione di composti in gabbia di molecole biologicamente rilevanti. Il presente protocollo descrive i metodi per la preparazione di una piattaforma cliccabile per i gruppi foto-caging, l'introduzione di funzionalità aggiuntive per espandere il repertorio dei composti in gabbia, la misurazione del loro fisico e fotochimico proprietà e il targeting selettivo di tipo cella di un composto in gabbia cliccabile per un'ulteriore applicazione cellulare.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>acetonitrile, EP</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>00404-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile, super dehydrated</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>010-22905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic, 100X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-bromoresorcinol</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>B0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-carbonyldiimidazole</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>034-10491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Kanto</td>
			<td>07278-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) Sulfate Pentahydrate, 99.9%</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>032-12511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichloromethane, dehydrated</td>
			<td>Kanto</td>
			<td>11338-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-Diisopropylcarbodiimide (DIPC)</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-dimethylaminopyridine</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D1450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylsulfoxide, dehydrated -super-</td>
			<td>Kanto</td>
			<td>10380-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual light source fluorescence illuminator, IX2-RFAW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5)</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>054-07225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 4-Chloroacetoacetate</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>C0911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 with L-Glutamine and Phenol Red</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>087-08335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>087-01076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted fluorescent microscope IX-71</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOLUTE Phase Separator, 15 mL</td>
			<td>Biotage</td>
			<td>120-1906-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>196-01252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning fluorescence confocal microscopy, FLUOVIEW FV1200/IX-81</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668027</td>
			<td>lipofection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>345-01804</td>
			<td>MOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-nitrophenylchloroformate (4-NPC)</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>C1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11058021</td>
			<td>reduced serum medium contains no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,10&#8208;Phenanthroline Monohydrate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26707-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps</td>
			<td>Rayonet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>W01SRM19-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31115-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>199-05985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid, 96-98%</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>190-04675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA)</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>762342-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tri&#8208;Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31404-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon light source, MAX-303</td>
			<td>Asahi Spectra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design, synthesis, and photochemical properties of clickable caged compounds

I composti in gabbia consentono la manipolazione fotomediata della fisiologia cellulare ad alta risoluzione spatiotemporale. Tuttavia, la limitata diversità strutturale dei gruppi di caging attualmente disponibili e le difficoltà nella modifica sintetica senza sacrificare le loro efficienze di fotolisi sono ostacoli all'espansione del repertorio dei composti in gabbia per le cellule vive Applicazioni. Poiché la modifica chimica dei gruppi fotocaging di tipo cumarina è un approccio promettente per la preparazione di composti in gabbia con diverse proprietà fisiche e chimiche, riportiamo un metodo per la sintesi di composti in gabbia cliccabili che possono essere modificati facilmente con varie unità funzionali tramite la ciclicizzazione di Huisgen in rame (I). La molecola modulare della piattaforma contiene un gruppo (6-bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl)methyl (Bhc) come gruppo fotocaging, che presenta un'elevata efficienza fotolisi rispetto a quelle dei convenzionali 2-nitrobenzyls. Vengono presentate procedure generali per la preparazione di composti in gabbia selezionabili contenenti ammine, alcole e carboxylati. Ulteriori proprietà come la solubilità dell'acqua e la capacità di targeting delle cellule possono essere facilmente incorporate in composti in gabbia cliccabili. Inoltre, le proprietà fisiche e fotochimiche, compresa la resa quantistica della fotolisi, sono state misurate e sono risultate superiori a quelle dei corrispondenti composti in gabbia Bhc. Il protocollo descritto potrebbe quindi essere considerato una potenziale soluzione per la mancanza di diversità strutturale nei composti in gabbia disponibili.

Composti in gabbia cliccabili di alcune molecole biologicamente interessanti, tra cui acido aracidonico e paclitaxel, sono stati sintetizzati con successo (Figura 1)28,41. Ulteriori proprietà come la solubilità dell'acqua e la capacità di targeting cellulare sono state introdotte in paBhcmoc-PTX tramite la ciclizzazione Huisgen in rame (I)-catalizzato ("reazione "Click") (Figura 2). Questi PTX in gabbia cliccabili sono stati poi fotoliti per produrre i PTX padre al momento dell'irradiazione a 350 nm (Figura 3) e le proprietà fisiche e fotochimiche dei composti in gabbia cliccabili sono riepilogate nella tabella 1. I rendimenti quantici dei composti in gabbia cliccabili 2 -glc-paBhcmoc-PTX (-dis 0.14) e paBhc-AA (s 0.083) erano più del doppio di quelli dei composti convenzionali in gabbia Bhc 2 0.040) e Bhc-AA(dis 0.038)43. Inoltre, è stata osservata una migliore solubilità dell'acqua per 2 s-glc-paBhcmoc-PTX, che contiene una moiety di glucosio.
Negli esperimenti sulle cellule vive, il targeting di paBhc-hex-FITC/Halo alle cellule dei mammiferi coltivate che esprimono transitoriamente una proteina di fusione di una proteina HaloTag e il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) è stato raggiunto con successo. La fluorescenza verde della moiety fluoresceina di paBhc-hex-FITC/Halo è stata osservata sulla membrana cellulare (Figura 4). La modulazione foto-mediata della localizzazione subcellulare di una chinasi è stata ottenuta utilizzando un composto in gabbia paBhc. È stata segnalata l'attivazione della traslocazione della diacylglycerol kinasee - (DGK) in presenza di acido aracidonico (AA)44. Le cellule CHO-K1 che esprimono transitoriamente GFP-DGK sono state trattate con AA o paBhc-AA (5). L'aggiunta di AA ha causato la modulazione della localizzazione subcellulare della DGK(Figura 5A,B). Sono state osservate variazioni simili nella localizzazione della DGK per le cellule trattate con paBhc-AA dopo l'esposizione alla luce UV(Figura 5C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig01.jpg"> Figura 1: Preparazione dei composti in gabbia cliccabili. (A) Reagenti e condizioni: a. ethyl 4-cloroacetoacetate/conc. H2SO4 2/rt/7 giorni/91% rendimento, b. 1 M HCl/reflux/3 giorni/97% resa. c. N-metilpropargylamine /HCHO/EtOH, quindi aggiungere (1) e riscaldare al reflusso per 17 h/79% resa. (B) Sintesi dell'ammina in gabbia cliccabile, PTX e acido aracidonico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig02.jpg"> Figura 2: Installazione di unità funzionali in composti in gabbia selezionabili. (A) Sintesi di un PTX rivestito in acqua tramite la ciclicizzazione di Huisgen in rame (I). (B) Strutture di composti in gabbia cliccabili contenenti il ligando HaloTag per il targeting cellulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig03.jpg"> Figura 3: Fotolisi di 2 s-glc-paBhcmoc-PTX (6). I campioni (10 M) nella soluzione K-MOPS (pH 7.2) sono stati irradiati a 350 nm. (A) Tracce tipiche dell'HPLC per la fotolisi di 6 (misurata a 254 nm). I campioni sono stati analizzati al momento dell'irradiazione specificati. (B) Corso temporale per la fotolisi di 6. I cerchi blu mostrano il consumo di 6. La linea continua mostra la curva dei minimi quadrati adatta per un semplice degrado esponenziale per 6. I quadrati rossi mostrano il rendimento di PTX. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (-SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig04.jpg"> Figura 4: Immagini di fluorescenza di cellule di mammiferi coltivati incubate con paBhc-hex-FITC/Halo (8). Le cellule trafette da pcDNA3-Halo-EGFR sono state incubate con una soluzione di composto di 8 a 37 gradi centigradi per 30 min. Le immagini sono state ottenute dopo il lavaggio ripetuto con PBS. Cellule HEK293T trattate in modo fittizio (A: immagine del contrasto di interferenza differenziale (DIC) e D: immagine a fluorescenza. Cellule HEK293T (B ed E) e cellule HeLa (C e F) esprimono transitoriamente Halo-EGFR (B e C: immagini DIC ed E e F: immagini a fluorescenza). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig05.jpg"> Figura 5: Immagini di fluorescenza dopo l'irradiazione UV delle cellule CHO-K1 incubate con acido aracidonico in gabbia Bhc. Le cellule CHO-K1 sono state trascate con una proteina di fusione DGK - EGFP. (A) Immagine a fluorescenza delle cellule trasfette. (B) 100 s dopo l'aggiunta di una soluzione di 10 M di acido arachidico. (C) Le cellule sono state incubate con una soluzione da 10 M di paBhc-AA (5) a 37 gradi centigradi per 5 min. (( D) 100 s dopo 20-s irradiazione UV (330-385 nm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Composti</td>
			<td>:max (nm)un
</td>
			<td>max (M-1 cm-1)b
</td>
			<td>disc
</td>
			<td>-s-osd
</td>
			<td>Solubilità (M)e
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ptx</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>2'-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>340</td>
			<td>10500</td>
			<td>0.040</td>
			<td>400</td>
			<td>55</td>
		</tr>
<tr>
<td>2'-paBhcmoc-PTX</td>
			<td>359</td>
			<td>9300</td>
			<td>0.059</td>
			<td>670</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>2'-glc-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>373</td>
			<td>12300</td>
			<td>0.14</td>
			<td>1280</td>
			<td>650</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bhc-AA</td>
			<td>341</td>
			<td>10800</td>
			<td>0.038</td>
			<td>390</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>paBhc-AA</td>
			<td>366</td>
			<td>10300</td>
			<td>0.083</td>
			<td>750</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Proprietà fisiche e fotochimiche dei composti in gabbia cliccabili. a. Massimo assorbimento (nm), b. Assorbimento Molare ammax (M.1 cmx 1), c. Resa quantica della scomparsa dei materiali di partenza a 350 nm, d. Il prodotto dell'assorbimento molare e la resa quantistica della scomparsa a 350 nm, e. La concentrazione della soluzione satura in K-MOPS (pH 7.2) (g mLn. 1).

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Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds

Viene presentato un protocollo per la sintesi e la misurazione delle proprietà fotochimiche dei composti modulari in gabbia con moieties cliccabili.

Design, sintesi e proprietà fotochimiche di composti in gabbia cliccabili

Caged compounds enable the photo-mediated manipulation of the cell physiology with high spatiotemporal resolution. However, the limited structural ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire un metodo pratico per la preparazione di composti fotocagedi con proprietà aggiuntive come solubilità in acqua o capacità di targeting cellulare. Utilizzando una semplice procedura sintetica, questa tecnica può essere utilizzata per espandere il laboratorio su composti in gabbia e per realizzare composti in gabbia con proprietà aggiuntive senza compromettere la loro fotosensibilità. Questa sintesi può essere eseguita in un laboratorio standard in quanto i nostri composti a gabbia cliccabili sono stabili alla fotoirradiazione quando vengono sciolti in solventi organici non nucleofili come il diclorometano o il dimetil solfossido.A dimostrare la procedura con Hirona Sasaki saranno Akinobu Suzuki, un post-doc, Hanami Aoki e Rei Watahiki, studenti laureati del laboratorio. Iniziare aggiungendo 709,6 milligrammi di metanolo paBhc e 397,6 milligrammi di n n-carbonildiimidazolo in un pallone a fondo rotondo da 30 millilitri. Aggiungere sei millilitri secchi di diclorometano al pallone e mescolare la soluzione a temperatura ambiente per un'ora.Al termine dell'incubazione, aggiungere 342,8 milligrammi di 4-dimetilaminopiridina e 552 microlitri di carbammato di tert-butil sei-amminoessule e mescolare la soluzione a temperatura ambiente per altre tre ore. Quindi utilizzare un evaporatore rotante sotto vuoto per rimuovere il solvente e altri materiali volatili e utilizzare la cromatografia a colonna flash in gel di silice per purificare direttamente il residuo. Per installare un'unità funzionale nel composto a gabbia cliccabile, sciogliere 249 milligrammi di rame due pentaidrato solfato in 10 millilitri di acqua scambiata con ioni per dare una soluzione di solfato di rame molare 0,1.Sciogliere otto milligrammi di due primi paBhc mock paclitaxel, 7,5 milligrammi di tris(3-idrossipropiltriazolilmetil)ammina, 162,4 milligrammi di sodio-l-ascorbato e 3,1 milligrammi di 15-cloro-3, 6, 9-triossipentildecil azide in un solvente misto di 2,5 millilitri di tampone di fosfato molare 0,1 e 0,5 millilitri di solfossido di dimetile. Successivamente, aggiungere 81,2 microlitri di soluzione di solfato di rame molare 0.1 alla miscela di reazione e mescolare la miscela a temperatura ambiente per 80 minuti, monitorando l'avanzamento della reazione con HPLC. Al termine della reazione, risolvere i precipitanti con 3,5 millilitri di una soluzione di acqua nitril di acetil al 75% e applicare la soluzione risultante direttamente al sistema HPLC semi-preparatore per purificare il prodotto desiderato.Per le misurazioni dell'efficienza quantistica, sotto lampade fluorescenti rivestite con filtro di taglio della luce UV, diluire la soluzione del campione in 10 microlitri di solfossido di dimetile con 10 millilitri di tampone KMOPS. Trasferire un'aliquota della soluzione nella stessa provetta utilizzata nella reazione fotografica dell'actinometro chimico. Irradiare la soluzione campione con una luce di 350 nanometri per cinque secondi, rimuovendo periodicamente 50 aliquote di microliter dalla soluzione irradiata per l'analisi da parte dell'HPLC.Determinare quindi il tempo di irradiazione in secondi in cui il 90% della materia prima ha reagito adattando i posti di osservazione della scomparsa dipendente dal tempo della materia prima. Per il targeting del ligando HaloTag di un composto in gabbia cliccabile, raccogliere la popolazione cellulare bersaglio di interesse con un reagente di dissociazione cellulare appropriato e sospendere nuovamente le cellule in un 2,5 per 10 alla quinta cella per millilitro di concentrazione DMEM. Quindi seminare circa 10 alla quinta parte per piatto in 35 millilitri di vetro per un'incubazione notturna a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica.La mattina dopo, diluire 14 microgrammi del DNA del PC tre DNA plasmatici del recettore del fattore di crescita epidermico alo in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri contenente 700 microlitri di mezzo siero ridotto. Successivamente, aggiungere cinque microlitri del reagente di lipofezione in 150 microlitri di mezzo siero ridotto a ciascuno dei quattro tubi e lasciare riposare i tubi a temperatura ambiente per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere 150 microlitri di DNA plasmatico diluito a ciascuno dei campioni diluiti di reagente per lipofezione e incubare i campioni a temperatura ambiente per altri cinque minuti.Al termine dell'incubazione, sciacquare le cellule con due millilitri di PBS per piatto e aggiungere 1,5 millilitri di mezzo siero ridotto ad ogni coltura. Aggiungere 150 microlitri del complesso di reagenti lipofezione plasmide ad ogni piatto e riportare le cellule all'incubatore di coltura cellulare per 48 ore. Al termine dell'incubazione, aspirare i supernaganti e aggiungere un millilitro di DMEM appena preparato integrato con due alo di esagono micromolare per ogni piatto.Dopo 30 minuti a 37 gradi Celsius, aspirare il mezzo contenente il composto in gabbia e sciacquare le cellule due volte con un millilitro di PBS più per rimuovere eventuali composti non abbondati. Aggiungere 500 microlitri di mezzo siero ridotto ad ogni piatto e riportare le cellule all'incubatore di coltura cellulare per altri 30 minuti per rimuovere i composti che sono entrati nelle cellule. Alla fine dell'incubazione, sciacquare le cellule due volte con un millilitro di PBS più per piatto e aggiungere un millilitro di mezzo senza rosso fenolo ad ogni coltura.Quindi registrare le immagini di florescence mediante microscopia a florescence confocale a scansione laser. Per la modulazione foto-mediata della localizzazione della chinasi utilizzando un composto a gabbia cliccabile, seminare circa cinque volte 10 alla quinta cellule TOC-A-one in due millilitri del mezzo F12 di Ham per piatto inferiore in vetro da 35 millilitri. Il giorno dopo, trasfetto le cellule con la codifica plasmide per GFP diacilglycerrolo chinasi gamma per 48 ore come appena dimostrato.Dopo la fine della trasfezione, sostituire il supernatante di trasfezione con due millilitri di mezzo siebro ridotto. Aggiungere 20 microlitri di soluzione di lavoro 100 volte paBhcAA alle cellule per un'incubazione da cinque a 60 minuti a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, posizionare il piatto sullo stadio oggettivo di un microscopio fluorescente invertito dotato di un illuminatore a doppia sorgente luminosa a fluorescenza.Immagini le cellule ogni 10 secondi per 10 minuti mentre irradiano le cellule nei punti di tempo sperimentali appropriati e nelle lunghezze d'onda secondo il protocollo sperimentale. Utilizzando questo metodo come dimostrato, i composti in gabbia cliccabili di alcune molecole biologicamente interessanti, tra cui paclitaxel e acido arachidonico, possono essere sintetizzati con successo. Proprietà aggiuntive come la solubilità in acqua e la capacità di targeting cellulare possono essere introdotte nel paBhc mock paclitaxel attraverso quello in rame catalizzato reazione di clic di ciclizzazione.Questi paclitaxel in gabbia cliccabili possono quindi essere fotolizzati per produrre i loro composti genitori dopo l'irradiazione a 350 nanometri. Le proprietà fisiche e fotochimiche dei composti a gabbia cliccabili sono riassunte nella tabella. Negli esperimenti sulle cellule vive, il targeting dell'esx fitzi halo paBhc verso cellule di mammifero coltivate che esprimono transitoriamente una proteina halotagged e un recettore del fattore di crescita epidermico induce un segnale di florescence verde dalla fluoresceina moiety PAHBHC hex fitzi halo sulla membrana cellulare.Inoltre, il trattamento delle cellule CHO-K1 che esprimono transitoriamente GFP diacil glicerolo chinasi gamma con acido arachidonico provoca la modulazione della localizzazione subcellulare della diacil glicerolo chinasi gamma. Cambiamenti simili nella localizzazione gamma della glicerolo chinasi diacil si osservano anche nelle cellule trattate con paBhc-AA dopo l'esposizione alla luce UV. Quando si eseguono gli esperimenti di permanenza in gabbia in soluzioni acquose aumentando il mezzo di coltura, assicurarsi di lavorare sempre sotto lampada fluorescente con filtro limitato a lunghezza d'onda corta.Seguendo questa procedura, è possibile studiare composti in gabbia che sono stati abbondanti per l'uso in esperimenti biologici a causa della mancanza di solubilità in acqua, permeabilità alla membrana o capacità di targeting cellulare.

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