Name: design, synthesis, and photochemical properties of clickable caged compounds
Uploaded: 2019-10-15T13:00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI Grant Number JP16H01282 (TF), en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på innovative områder "Memory dynamikk," og JP19H05778 (TF), "MolMovies."

1. syntese av den modulære caging paBhc gruppe for klikkbare bur forbindelser28,41
<ol><li>
Fremstilling av (6-bromo-7-hydroksykumarin-4-YL) methyl klorid (Bhc-CH2CL)
	<ol>
<li>Plasser 4-bromoresorcinol (9,742 g, 51,5 mmol) i en 100 mL rund bunn kolbe utstyrt med en stirrer bar.</li>
		<li>Legg til CONC. H2så4 (98%, 30 ml) til flasken og rør blandingen å oppløse.</li>
		<li>Tilsett etanol 4-chloroacetoacetate (10 mL, 74 mmol) dråpevis.</li>
		<li>Fortsett omrøring av blandingen ved omgivelsestemperatur i 5 dager.</li>
		<li>Separat, Legg knust isbiter (~ 200 mL) i en 500 mL Erlenmeyer kolbe.</li>
		<li>Hell reaksjonen blandingen i isen og rør kraftig i 30 min til en fint pulverisert utfelling er innhentet.</li>
		<li>Samle inn utfelling via vakuum filtrering. Vask lyset brune utfelling med vann fem ganger.</li>
		<li>Tørk utfelling under vakuum over natten for å gi BhcCH2CL som et lett brunt pulver (13,57 g, 46,9 mmol).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utarbeidelse av (6-bromo-7-hydroksykumarin-4-YL) metanol (BhcCH2Oh)
	<ol>
<li>Plasser den tilberedte BhcCH2Cl (1,1440 g, 3,95 mmol) og 1 M HCl (300 ml) i en kolbe på 1 L bunn som er utstyrt med en Dimroth-kondensator. Rør blandingen ved 140 ° c i 5 dager. Etter denne tid, kjøle blandingen til omgivelsestemperatur.</li>
		<li>Fjern vannet fra reaksjonen ved roterende fordampning under vakuum for å gi BhcCH2Oh (1) som et lett brunt pulver (1,0359 g, 3,82 mmol, 97% yield). Merk: bruk av 250 mL 1 M HCl per 1 g BhcCH2CL gir et tilfredsstillende resultat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utarbeidelse av paBhcCH2Oh (2) via Mannich reaksjon
	<ol>
<li>Sted paraformaldehyde (446,4 mg, 14,9 mmol) i en 50 mL rund bunn kolbe. Tilsett vannfri etanol (5 mL) og N-methylpropargylamine (1,25 mL, 14,8 mmol) til flasken.</li>
		<li>Rør blandingen ved omgivelsestemperatur i 1 time under en AR-atmosfære.</li>
		<li>Legg BhcCH2Oh (1) (1,367 g, 5,04 mmol) til flasken. Varm opp blandingen til 80 ° c med et blokk varmer apparat, og Fortsett å røre ved blandingen ved 80 ° c i 2 timer under en AR-atmosfære.</li>
		<li>Stopp blokk varmeren og Avkjøl reaksjonsblandingen til romtemperatur.</li>
		<li>Samle den resulterende lys brun-gul utfelling av vakuum filtrering. Vask utfelling to ganger med en liten mengde vannfri etanol (1 mL hver gang).</li>
		<li>Fjern overflødig etanol under vakuum å gi paBhcCH2Oh (2) (1,393 g, 3,96 mmol).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. utarbeidelse av klikkbare bur forbindelser
Merk: følgende prosedyrer kan brukes til utarbeidelse av andre klikkbare bur forbindelser som inneholder hydroksyl, amino, og carboxylat funksjonelle grupper.
<ol><li>
Generell prosedyre 1: utarbeidelse av en klikkbar bur Amin
	<ol>
<li>Place paBhcCH2Oh (2) (709,6 mg, 2,02 mmol) og n,n '-karbonyl diimidazole (CDI, 397,6 mg, 2,45 mmol) i en 30 ml rund bunn kolbe. Tilsett tørr CH2CL2 (6 ml) og rør oppløsningen ved omgivelsestemperatur i 1 time.</li>
		<li>Tilsett 4-dimethylaminopyridine (4-DMAP, 324,8 mg, 2,66 mmol) og tert-butyl (6-aminohexyl) carbamate (533,1 mg, 2,46 mmol). Rør oppløsningen ved omgivelsestemperatur i 3 timer.</li>
		<li>Fjern løsemiddel og andre flyktige materialer ved hjelp av en roterende fordamper under vakuum. Rens rester direkte ved hjelp av silica gel Flash kolonne kromatografi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generell prosedyre 2: utarbeidelse av en klikkbar bur alkohol
	<ol>
<li>Plasser paklitaksel (PTX, 48,7 mg, 0,057 mmol) i en flaske med 30 mL rund bunn utstyrt med en treveis stopcock og en AR-ballong. Tilsett tørr CH2CL2 (1 ml), 4-DMAP (17,1 mg, 0,14 mmol), og 4-nitrophenyl chloroformate (26,0 mg, 0,13 mmol).</li>
		<li>Rør løsningen ved omgivelsestemperatur for 2,5 h under en AR-atmosfære.</li>
		<li>Legg til 4-DMAP (15,7 mg, 0,13 mmol) og paBhcCH2Oh (2) (39,1 mg, 0,111 mmol) til løsningen. Fortsett omrøring av blandingen ved omgivelsestemperatur i 17 timer.</li>
		<li>Tilsett CHCl3 (10 ml) og 15% vandig NaHCO3 (5 ml) til blandingen. Rør blandingen kraftig i ca 3 min. Fjern det vandige laget med en pipette.</li>
		<li>Tilsett 0,5 M sitronsyre (5 mL) til flasken som inneholder det organiske laget. Rør blandingen og fjern det vandige laget som ovenfor.</li>
		<li>Skill det organiske laget ved hjelp av en fase skille kolonne. Fjern løsemidler med en roterende fordamper under vakuum. Rens produktet ved hjelp av standard silica gel Flash kolonne kromatografi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generell prosedyre 3: utarbeidelse av en klikkbar bur kar bok syls syre
	<ol>
<li>Løs opp arachidonic yre (33,0 μL, 0,100 mmol), paBhcCH2Oh (2) (39,6 mg, 0,112 mmol), og 4-DMAP (14,1 mg, 0,115 MMOL) i tørr ch2CL2 (2 ml). Tilsett n,n gepatotoksičnost-diisopropylcarbodiimide (DIPC, 17,0 μL, 0,110 mmol) og rør oppløsningen ved omgivelsestemperatur i 140 min.</li>
		<li>Fjern løsemiddel under vakuum. Rens rester direkte ved hjelp av silica gel Flash kolonne kromatografi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. installasjon av en funksjonell enhet i klikkbare bur forbindelser
<ol><li>Løs opp kobber (II) sulfat-pentahydrate (249 mg) i ion-utvekslet vann (IEW, 10 mL) for å gi en 0,1 M CuSO4 -løsning.</li>
	<li>Løs opp 2 gepatotoksičnost-paBhcmoc-PTX (8,0 mg, 6,5 mikromol), Tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl) Amin (THPTA, 17,5 mg, 40,3 mikromol), natrium l-ascorbate (162,4 mg, 0,825 mmol), og 15-klor-3, 6, 9-trioxapentadecyl Natriumazid (3,1 mg, 11 mikromol) i et blandet løsemiddel av 0,1 M fosfat buffer (2,5 mL, pH 7,2) og dimethyl sulfoxide (DMSO, 0,5 mL).</li>
	<li>Tilsett 0,1 M CuSO4 -oppløsning (81,2 μL, 8,1 mikromol) i reaksjonsblandingen. Rør blandingen ved omgivelsestemperatur i 80 min. Overvåk fremdriften til reaksjonen ved hjelp av høyytelses flytende kromatografi (HPLC).</li>
	<li>Løs opp precipitates ved å tilsette en 75% acetonitril/vannoppløsning (3,5 mL). Påfør den resulterende løsningen direkte på semi-preparativ HPLC system for å rense det ønskede produktet. Merk: Oppløseliggjøringen av reaksjonsblandingen ved tilsetning av tert-butanol kan akselerere progresjonen av reaksjonen.</li>
</ol>4. photolytic uncaging reaksjon av bur forbindelser
<ol><li>Utarbeidelse av aksjen løsninger
	<ol>
<li>Oppløse den ønskede bur sammensatte (5 mikromol) i DMSO (500 μL) for å forberede en 10 mM lagerløsning. Dispensere en alikvot av hver løsning (10 μL) i et 1,5 mL mikrosentrifugen rør og oppbevares i en fryser (− 20 ° c) inntil like før bruk.</li>
		<li>6 mM K3[fe (C2O4)3] (100 ml): løs opp recrystallized kalium ferrioxalate (0,295 g, 0,675 mmol) i 80 ml vann. Tilsett 0,5 M H2så4 (10 ml) og en passende mengde IEW som utgjør volumet til 100 ml. Merk: kalium ferrioxalate bør renses via omkrystallisering fra varmt vann og oppbevares i mørket. Recrystallized kalium ferrioxalate oppnås som trihydrat; Derfor er dens formel K3[fe (C2O4)3] · 3t2o og en formel vekt på 491,24 bør vurderes under utarbeidelse av lagerløsning. Kontroller renheten på 6 mM-løsningen ved å måle dens absorpsjon ved 510 NM. Hvis absorbansen er < 0.02, er den egnet for bruk i eksperimentet.</li>
		<li>0,1% buffer-Phen (30 mL): oppløse NaOAc · 3t2O (7,35 g), 1, 10-fenantrolin (Phen) · H2O (30 mg), og CONC. h2så4 (0,9 mL) i IEW (20 ml). Legg til IEW for å gjøre volumet til 30 mL. Merk: løsningen inneholder 1,8 M NaOAc, 0,54 M H2så4, og 0,1% 1, 10-fenantrolin.</li>
	</ol></li>
	<li>Måling av antall fotoner ved hjelp av ferrioxalate actinometry
	<ol>
<li>Plasser 6 mM K3[fe (C2O4)3] (V1 L) i en kvarts Cuvette. Irradiate løsningen med 350 Nm lys for 5 s.</li>
		<li>Overfør den bestrålt løsningen til en Pyrex-Cuvette med banelengde på l [cm].</li>
		<li>Legg 0,1% buffer-Phen (V2 L) til bestrålt prøve løsning og bland godt med pipettering. Mål absorbansen av prøven ved 510 NM. Beregn gjennomsnittlig absorpsjons endring per enhets tid (ΔA510 [s− 1]).</li>
		<li>Beregn antall føflekker av genererte Fe2 + ioner per enhet tid i henhold til følgende ligning: nFe2 + [mol s− 1] = ((v1 + V2) [L] × ΔA510 [s− 1])/(L [cm] × ε510 [l mol− 1 cm− 1]), hvor (v1 + V2) er volumet av prøven for absorpsjon måling, l er den optiske banen lengden på Cuvette, og ε510 er molar absorptivitet av Fe2 +- Phen kompleks ved 510 NM. Merk: i typiske eksperimentelle forhold, verdier av v1 = 2,0 × 10− 3 l, V2 = 0,33 × 10− 3 l, l = 1,0 cm, og ε510 = 1,1 × 104 L mol− 1 cm− 1 ble brukt.</li>
		<li>Beregn antall føflekker av fotoner som når prøven (i0) ved hjelp av følgende formel: I0 [Einstein cm− 2 s− 1] = nFe2 +/Φ350 der Φ 350 er Quantum effektiviteten til photoreduction av ferrioxalate ved 350 NM. Merk: selv om Quantum effektiviteten til kalium ferrioxalate actinometer ved 350 Nm ikke rapporteres, ble den rapporterte verdien av 1,2542 ved 358 NM ansatt.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantum effektivitets målinger ved 350 Nm
	<ol>
<li>Fortynne prøven lagerløsning (i DMSO, 10 μL) med K-MOPPER buffer (pH 7,2, 10 mL) for å gi en 10 μM løsning i K-MOPPER som inneholder 0,1% DMSO. Merk: K-MOPPER buffer besto av 100 mM KCl og 10 mM 3-(N-morpholino) propanesulfonic syre (mopper) titrert til pH 7,2 med Koh.</li>
		<li>Overfør en alikvot av oppløsningen (V1 L) inn i samme Cuvette som brukes i photoreaction av den kjemiske actinometer. Irradiate eksempel løsningen med samme oppsett som beskrevet i trinn 4.2.1.</li>
		<li>Fjern en alikvot (50 μL) fra den bestrålt løsningen med jevne mellomrom og analyser ved hjelp av HPLC.</li>
		<li>Bestem bestråling tid, i sekunder, der 90% av Start materialet reagerte (t90%) ved å tilpasse tomter i den tidsavhengige forsvinningen av Start materialet. Merk: absorbansen av bestrålt prøven må opprettholdes ved < 0.1 slik at den indre filtreringen av strålingen kan bli neglisjert. Det er ønskelig at photolytic forbruket av utgangsmaterialet kan bli rundet av enkelt-eksponentiell forfall, slik at det er ingen uønsket sekundær effekt som forstyrrer photolysis prosessen.</li>
		<li>Beregn kvante utbyttet av forsvinning (Φdis) ved hjelp av følgende ligning28: Φdis = 1/(t90% × I0 × σ350) der t90% [s] er bestråling tiden der 90% av Start materialet ble konsumert, jeg0 [Einstein cm− 2 s− 1] er antall føflekker av fotoner, og σ350 [cm 2 mol− 1] er den decadic utryddelse koeffisienten i prøven ved 350 NM. Merk: σ350 [cm2 mol− 1] = 103ε350 [M− 1 cm− 1].</li>
	</ol></li>
</ol>5. målretting av en klikkbar bur sammensatte med en HaloTag ligand
Merk: før bruk, opprettholde jakten cellene i Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM, lav glukose, natrium pyruvat, l-glutamin) supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS) inneholder 1% antibiotika (Streptomycin sulfat, penicillin G, og amfotericin) på 37 ° c og 5% CO2.
<ol><li>Fjern mediet og trypsinize cellene ved å behandle med Trypsin-ethylenediaminetetraacetic yre (EDTA, 1 mL) ved 37 ° c i 1 min. Legg DMEM (4 mL) til cellene og re-suspendere cellene ved pipettering forsiktig. Seed ca 5 × 105 celler per tallerken i 35 mm glassbunn RETTER i DMEM (2 ml) 24 h før transfeksjoner.</li>
	<li>For fire retter, i et 1,5 mL mikrosentrifugen rør, fortynne plasmider DNA (pcDNA3-Halo-EGFR, 14 μg) i det reduserte serum mediet (700 μL). Separat, fortynne lipofection reagens (5 μL) i det reduserte serum mediet (150 μL) i hver av fire rør og la dem stå ved omgivelsestemperatur i 5 min.</li>
	<li>Tilsett en del av det fortynnede plasmider DNA (150 μL) til hver av de fortynnede lipofection reagens prøvene. Ruge ved omgivelsestemperatur i 5 min.</li>
	<li>Etter å ha opprettholdt cellene ved 37 ° c og 5% CO2 for 24 h, aspirer DMEM og skyll cellene med fosfat-bufret saltvann (PBS, 2 ml). Tilsett det reduserte serum mediet (1,5 mL).</li>
	<li>Tilsett plasmider-lipofection reagens (150 μL) kompleks på hver tallerken. Oppretthold cellene ved 37 ° c og 5% CO2 for 48 h.</li>
	<li>Aspirer mediet, tilsett en del av ferskt tilberedte DMEM (1 mL) som inneholder 2 μM paBhc-hex-FITC/Halo, og ruge cellene ved 37 ° c og 5% CO2 i 30 min.</li>
	<li>Aspirer mediet som inneholder den bur sammensatte og skyll cellene to ganger med PBS + (1 mL per skylling) for å fjerne eventuelle ubundne forbindelser. Tilsett det reduserte serum mediet (500 μL) og ruge cellene ved 37 ° c og 5% CO2 i 30 min for å fjerne forbindelsene som kom inn i cellene. Merk: PBS + er fosfat-bufret saltvann supplert med 2 mM CaCl2 og 1 mm MgCl2.</li>
	<li>Fjern mediet og skyll cellene to ganger med PBS + (1 mL). Legg til en del av et medium (1 mL) som ikke inneholder fenol rødt. Record fluorescens bilder av laserskanning konfokalmikroskopi fluorescens mikroskopi.</li>
</ol>6. Photomediated modulering av en kinase lokalisering ved hjelp av en klikkbar bur sammensatte
Merk: før bruk, opprettholde CHO-K1 cellene i ham ' s F-12 medium supplert med 10% FBS ved 37 ° c og 5% CO2.
<ol><li>Forbered en 100 × arbeids løsning (1 mM) av paBhc-AA (5) i DMSO. Merk: en 10 mM lagerløsning av forbindelsen tilberedes og oppbevares i en fryser (-20 ° c).</li>
	<li>Seed ca 5 × 105 celler per tallerken i 35 mm glassbunn RETTER i DMEM (2 ml) 24 h før transfeksjoner.</li>
	<li>Transfect CHO-K1 celler med en plasmider koding for GFP-DGKγ 48 h før uncaging eksperimenter. Merk: Transfeksjoner utføres i henhold til trinn 5.2 – 5.5.</li>
	<li>Skift ut mediet med et redusert serum medium (2 mL). Tilsett 100 × paBhc-AA arbeids løsning (20 μL) og ruge cellene ved 37 ° c og 5% CO2 for mellom 5 min og 1 time. Merk: innlastingstiden avhenger av sammensatt ansatt.</li>
	<li>Plasser cellene på den objektive fasen av et invertert fluorescerende mikroskop utstyrt med en dobbel lyskilde fluorescens belysning.</li>
	<li>Ta et fluorescerende bilde hver 10 s. irradiate cellene med 330 – 385 NM lys gjennom et mikroskop objektiv for et passende tidspunkt. Alternativt, irradiate cellene med 405 NM lys ved hjelp av en XE lampe gjennom fleksible kvarts fibre.</li>
	<li>Fortsett å ta opp fluorescerende bilder i 10 minutter.</li>
</ol>

Vi har ingenting å avsløre.

Vi har tidligere utviklet Bhc bur forbindelser av ulike biologisk aktive molekyler som viser høy photolytic effektivitet28,45,46,47. Med sikte på å utvide repertoaret av Bhc caging grupper, har vi også rapportert plattformer av modulære bur forbindelser som kan endres enkelt ved innføringen av ulike funksjonelle enheter32,40,41. Den nåværende protokollen representerer derfor en metode for syntese av en klikkbar forløper for Bhc caging grupper som kan endres via kobber (I)-katalysert Huisgen syklisering. Syntesen av klikkbare forløper, paBhcCH2Oh (2), ble oppnådd via en fire-trinns reaksjons sekvens som starter fra den kommersielt tilgjengelige 4-bromoresorcinol (figur 1a). Fordelen med denne protokollen er at ingen arbeidskrevende rensing trinn (for eksempel kolonne kromatografiske separasjoner) er nødvendig.
Som klikkbar forløper paBhcCH2Oh (2) kan brukes til å maskere ulike funksjonelle grupper, klikkbare bur forbindelser av aminer, alkoholer, og kar bok syls syrer ble syntetisert med 2 som forløperen (figur 1B). Aminer ble modifisert som deres karbamater mens alkoholer ble modifisert som deres karbonater. I de generelle prosedyrene 1 og 2 ble CDI brukt til utarbeidelse av klikkbare karbamater, mens 4-nitrophenyl chloroformate ble benyttet for utarbeidelse av karbonater. Som indikert av reaksjons mekanismen, kan begge reagensene brukes til fremstilling av karbamater og karbonater. Det bør også bemerkes at avkastningen av ønsket bur sammensatte avhenger av den kjemiske strukturen av molekylet som skal bur. Andre eksempler kan sees i våre tidligere rapporter28,30,33,48.
Klikk modifikasjon ble deretter utført ved hjelp av en liten endring av den rapporterte prosedyren49. Tillegg av Tris (triazolylmethyl) Amin-basert ligander er nødvendig for å oppnå de ønskede produkter i god til høy avkastning. Siden en rekke azider er lett tilgjengelig både fra kommersielle kilder og fra litteratur prosedyrer, kan vi forberede ulike modulære bur forbindelser med flere egenskaper som vannløselighet og cellulære målretting evne (figur 2).
Kvantum utbyttet av photolysis ble deretter målt i henhold til en rapportert prosedyre28,50. Figur 3 viser at photolytic forbruket av 2 gepatotoksičnost-Glc-PABHCMOC-PTX og UTGIVELSEN av PTX ble rundet av enkelt-eksponentiell forfall og vekst, henholdsvis antyder ingen indre filtrering av stråling eller uønskede sekundære effekter. Forbedret photolysis Quantum rentene (Φ) og photolysis effektivitet (εΦ) ble observert for klikkbare paBhc bur forbindelser i forhold til de av tidligere rapporterte Bhc bur forbindelser (tabell 1)41, 43. siden photolysis effektivitet (εΦ) av Bhc bur forbindelser er mer enn 100 ganger høyere enn for 2-nitrobenzyl-type bur forbindelser48, den markerte forbedringen på grunn av tilstedeværelsen av paBhc caging grupper er klart en fordel for dette systemet.
Som et proof-of-Concept eksperiment, en hydrofile moiety ble innført i 2 gepatotoksičnost-paBhcmoc-PTX (4) og en mobil målretting ligand ble innført i sammensatte 3 (figur 2). VANNLØSELIGHET på 2 gepatotoksičnost-glc-paBhcmoc-PTX var 650 ganger høyere enn for den overordnede PTX (tabell 1). Selektiv mobilnettet målretting ble oppnådd ved hjelp av en tag-sonde system, og paBhcmoc-hex-FITC/Halo (8) bærer HaloTag ligand ble vellykket rettet mot cellemembranen av kultivert pattedyrceller uttrykker HALOTAG/EGFR Fusion protein ( Figur 4). Foto-mediert modulering av subcellulære lokalisering av en kinase ble også oppnådd ved hjelp av en klikkbar bur sammensatte 5 (figur 5).
Avslutningsvis har vi med hell demonstrert en metode for utarbeidelse av klikkbare plattformer for foto-bur forbindelser av biologisk interessante molekyler som kan endres enkelt med flere egenskaper, for eksempel vannløselighet og en mobil målretting evne. Siden paBhc caging-gruppen kan brukes til å klargjøre alle molekyler med funksjonsgrupper som kunne endres, er anvendelsen av den foreliggende protokollen ikke begrenset til molekylene som beskrives her. Ved hjelp av en modulær plattform, nemlig paBhc caging gruppen, den ønskede bur forbindelser kan lett forberedt, og deres fysiske og kjemiske egenskaper kan være modulert via Klikk modifikasjon.

Bur forbindelser er utformet syntetiske molekyler som opprinnelige funksjoner er timelig maskert av covalently vedlagt Foto-flyttbare beskytte grupper. Interessant, bur forbindelser av biologisk relevante molekyler gir en uunnværlig metode for spatiotemporal kontroll av cellulære fysiologi1,2,3,4,5 ,6. I 1977 rapporterte Engels og Schlaeger 2-nitrobenzyl Ester fra leiren som en membran gjennomtrengelig og photolabile derivat av cAMP7. Året etter, rapporterte Kaplan 1-(2-nitrophenyl) etanol Ester av ATP (NPE-ATP) og navngitt denne forbindelsen "bur" ATP8. Siden da, en rekke photochemically flyttbare beskytte grupper som 2-nitrobenzyls, p-hydroxyphenacyls9, 2-(2-nitrophenyl) ethyls10,11, 7-nitroindolin-1-yls12, 13, og (kumarin-4-YL) methyls14,15,16 har blitt brukt for utarbeidelse av bur forbindelser.
Syntesen av bur forbindelser med ønskelig ekstra egenskaper som membran permeabilitet, vannløselighet, og cellulære målretting evne ville være forventet å lette celle biologiske applikasjoner. Siden de fysiske og fotokjemisk egenskapene til disse molekylene først og fremst avhenger av den kjemiske strukturen til photochemically som er flyttbare, og beskytter grupper som brukes til å forberede dem, kreves det et mangfoldig repertoar av foto caging grupper. Imidlertid er det strukturelle mangfoldet i tiden tilgjengelige caging grupper som utviser høy photolysis effektivitet begrenset. Dette kan være et hinder for å øke bruken av bur forbindelser.
For å løse dette problemet, har repertoaret av foto-caging grupper blitt utvidet ved kjemisk modifisering av eksisterende photoremovable beskytte grupper eller utformingen av nye photolabile chromophores med overlegen photophysical og fotokjemisk egenskaper. Eksempler inkluderer nitrodibenzofuran (NDBF)17, [3-(4, 5-dimethoxy-2-nitrophenyl) -2-butyl] (DMNPB)18,19, en kalsium-følsom 2-nitrobenzyl photocage20, erstattet coumarinylmethyls (DEAC45021 , DEAdcCM-azetidinyl-4-methylcoumarin23, og styryl kumariner24), cyanine derivater (CyEt-Pan)25, og BODIPY derivater26,27.
I tillegg har vi tidligere utviklet (6-bromo-7-hydroksykumarin-4-YL) metyl (Bhc) gruppe og med hell syntetisert ulike bur forbindelser av nevrotransmittere28, andre Messengers29,30, og oligonukleotider31,32,33 utstilling stor en-og to-Foton eksitasjon tverrsnitt. Hvis flere egenskaper kan installeres lett inn i caging grupper uten å svekke deres foto, så repertoaret av bur forbindelser kan utvides34,35,36, 37,38,39. Vi har derfor designet modulære bur forbindelser som består av tre deler, nemlig Bhc gruppen som en foto-responsive kjerne, kjemiske håndtak for installasjon av ekstra funksjonalitet, og molekyler som skal være maskert40, i 41.
Dermed gir denne artikkelen en praktisk metode for utarbeidelse av bur forbindelser av biologisk relevante molekyler. Den nåværende protokollen beskriver metoder for utarbeidelse av en klikkbar plattform for foto-caging grupper, innføring av ytterligere funksjonalitet for å utvide repertoaret av bur forbindelser, måling av deres fysiske og fotokjemisk egenskaper, og cellen-type selektiv målretting av en klikkbar bur sammensatte for videre mobilnettet programmet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>acetonitrile, EP</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>00404-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile, super dehydrated</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>010-22905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic, 100X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-bromoresorcinol</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>B0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-carbonyldiimidazole</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>034-10491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Kanto</td>
			<td>07278-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) Sulfate Pentahydrate, 99.9%</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>032-12511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichloromethane, dehydrated</td>
			<td>Kanto</td>
			<td>11338-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-Diisopropylcarbodiimide (DIPC)</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-dimethylaminopyridine</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D1450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylsulfoxide, dehydrated -super-</td>
			<td>Kanto</td>
			<td>10380-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual light source fluorescence illuminator, IX2-RFAW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5)</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>054-07225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 4-Chloroacetoacetate</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>C0911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 with L-Glutamine and Phenol Red</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>087-08335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>087-01076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted fluorescent microscope IX-71</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOLUTE Phase Separator, 15 mL</td>
			<td>Biotage</td>
			<td>120-1906-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>196-01252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning fluorescence confocal microscopy, FLUOVIEW FV1200/IX-81</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668027</td>
			<td>lipofection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>345-01804</td>
			<td>MOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-nitrophenylchloroformate (4-NPC)</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>C1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11058021</td>
			<td>reduced serum medium contains no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,10&#8208;Phenanthroline Monohydrate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26707-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps</td>
			<td>Rayonet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>W01SRM19-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31115-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>199-05985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid, 96-98%</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>190-04675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA)</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>762342-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tri&#8208;Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31404-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon light source, MAX-303</td>
			<td>Asahi Spectra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design, synthesis, and photochemical properties of clickable caged compounds

Bur forbindelser aktivere Foto-mediert manipulering av cellen fysiologi med høy spatiotemporal oppløsning. Men den begrensede strukturelle mangfoldet av tiden tilgjengelig caging grupper og vanskelighetene i syntetisk modifikasjon uten å ofre sine photolysis effektivitet er hindringer for å utvide repertoaret av bur forbindelser for levende celle Programmer. Som kjemisk modifisering av kumarin-type Foto-caging grupper er en lovende tilnærming for utarbeidelse av bur forbindelser med ulike fysiske og kjemiske egenskaper, rapporterer vi en metode for syntese av klikkbare bur forbindelser som kan endres enkelt med ulike funksjonelle enheter via kobber (I)-katalysert Huisgen syklisering. Den modulære plattform molekylet inneholder en (6-bromo-7-hydroksykumarin-4-YL) metyl (Bhc) gruppe som en foto-caging gruppe, som viser en høy photolysis effektivitet i forhold til de av konvensjonelle 2-nitrobenzyls. Generelle prosedyrer for utarbeidelse av klikkbare bur forbindelser som inneholder aminer, alkoholer, og carboxylates presenteres. Ytterligere egenskaper som vannløselighet og celle målretting evne kan lett innlemmes i klikkbare bur forbindelser. Videre ble den fysiske og fotokjemisk egenskaper, inkludert photolysis Quantum yield, målt og ble funnet å være overlegen de tilsvarende Bhc bur forbindelser. Den beskrevne protokollen kan derfor betraktes som en potensiell løsning for mangelen på strukturell mangfold i de tilgjengelige bur forbindelser.

Klikkbare bur forbindelser av noen biologisk interessante molekyler, inkludert arachidonic syre og paklitaksel, ble vellykket syntetisert (figur 1)28,41. Ytterligere egenskaper som vannløselighet og cellulær målretting evne ble innført i paBhcmoc-PTX via kobber (I)-katalysert Huisgen syklisering ("Klikk" reaksjon) (figur 2). Disse klikkbare bur PTXs ble deretter photolyzed å produsere sine foreldre PTXs upon bestråling på 350 Nm (Figur 3), og den fysiske og fotokjemisk egenskaper av klikkbare bur forbindelser er oppsummert i tabell 1. Quantum rentene av klikkbare bur forbindelser 2 gepatotoksičnost-glc-paBhcmoc-PTX (Φdis 0,14) og PaBhc-AA (Φdis 0,083) var mer enn dobbelt de av konvensjonelle BHC bur forbindelser 2 gepatotoksičnost-Bhcmoc-PTX (Φdis 0,040) og Bhc-AA (Φdis 0,038)43. I tillegg ble det observert en forbedret vannløselighet for 2 gepatotoksičnost-glc-paBhcmoc-PTX, som inneholder en glukose moiety.
I live celle eksperimenter, målrettingen av paBhc-hex-FITC/Halo til kultivert pattedyrceller midlertidig uttrykker en fusjon protein av en HaloTag protein og epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) ble oppnådd vellykket. Grønn fluorescens av fluorescein moiety av paBhc-hex-FITC/Halo ble observert på cellemembranen (Figur 4). Foto-mediert modulering av subcellulære lokalisering av en kinase ble oppnådd ved hjelp av en paBhc bur sammensatte. Translokasjon av diacylglycerol kinase γ (DGKγ) er rapportert å være aktivert i nærvær av arachidonic syre (AA)44. CHO-K1 celler midlertidig uttrykker GFP-DGKγ ble behandlet med enten AA eller paBhc-AA (5). Tilsetting av AA forårsaket modulering av subcellulære lokalisering av DGKγ (figur 5A, B). Lignende endringer i lokalisering av DGKγ ble observert for paBhc-AA-behandlede celler etter eksponering for UV-lys (figur 5C, D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig01.jpg"> Figur 1: utarbeidelse av klikkbare bur forbindelser. (A) reagenser og betingelser: A. etanol 4-chloroacetoacetate/CONC. H2så4/RT/7 dager/91% avkastning, b. 1 M HCL/reflux/3 dager/97% yield. c. N-methylpropargylamine/HCHO/EtOH, deretter legge til (1) og varme på reflux for 17 h/79% yield. (B) synteser av klikkbare bur Amin, PTX, og arachidonic syre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig02.jpg"> Figur 2: installasjon av funksjonelle enheter i klikkbare bur forbindelser. (A) syntese av et VANNLØSELIG bur PTX via kobber (i)-katalysert Huisgen syklisering. (B) strukturer av klikkbare bur forbindelser som inneholder HaloTag ligand for mobilnettet målretting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig03.jpg"> Figur 3: Photolysis av 2 gepatotoksičnost-glc-paBhcmoc-PTX (6). Prøver (10 μM) i K-MOPPER-oppløsning (pH 7,2) ble bestrålt ved 350 NM. (A) typiske HPLC spor for photolysis av 6 (målt ved 254 NM). Prøvene ble analysert på den angitte bestråling tid. (B) tid kurs for photolysis av 6. Blå sirkler viser forbruket av 6. Den solide linjen viser minst kvadrater kurve passer for en enkel råtnende eksponentiell for 6. Røde firkanter viser utbyttet av PTX. Feilfeltene representerer standardavviket (± SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig04.jpg"> Figur 4: fluorescens bilder av kultivert pattedyrceller inkubert med paBhc-hex-FITC/Halo (8). Celler transfekterte med pcDNA3-Halo-EGFR ble inkubert med en 2 μM løsning av sammensatte 8 ved 37 ° c i 30 min. Bildene ble innhentet etter gjentatt vask med PBS +. Mock-behandlet HEK293T celler (A: differensial forstyrrelser kontrast (dic) bilde og D: fluorescens bilde). HEK293T celler (b og E) og jakten celler (C og F) midlertidig uttrykker Halo-EGFR (B og C: dic bilder og e og F: fluorescens bilder). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig05.jpg"> Figur 5: fluorescens bilder etter UV bestråling av CHO-K1 celler inkubert med Bhc bur arachidonic syre. CHO-K1 celler ble transfekterte med en fusjon protein DGKγ-EGFP. (A) et fluorescens bilde av transfekterte celler. (B) 100 s etter tilsetning av en 10 μM løsning av arachidonic syre. (C) celler ble inkubert med en 10 μM løsning av PABHC-AA (5) ved 37 ° c i 5 min. (D) 100 s etter 20-s UV-bestråling (330 – 385 NM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig05large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Forbindelser</td>
			<td>λMax (NM)a
</td>
			<td>εMax (M-1 cm-1)b
</td>
			<td>φdisc
</td>
			<td>εφdisd
</td>
			<td>Løselighet (μM)e
</td>
		</tr>
<tr>
<td>PTX</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,0</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>340</td>
			<td>10500</td>
			<td>0,040</td>
			<td>400</td>
			<td>55</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-paBhcmoc-PTX</td>
			<td>359</td>
			<td>9300</td>
			<td>0,059</td>
			<td>670</td>
			<td>8,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-glc-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>373</td>
			<td>12300</td>
			<td>0,14</td>
			<td>1280</td>
			<td>650</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bhc-AA</td>
			<td>341</td>
			<td>10800</td>
			<td>0,038</td>
			<td>390</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>paBhc-AA</td>
			<td>366</td>
			<td>10300</td>
			<td>0,083</td>
			<td>750</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: fysiske og fotokjemisk egenskaper av klikkbare bur forbindelser. a. maksimal absorpsjon (NM), b. molar absorptivitet ved λMax (M− 1 cm− 1), c. Quantum yield av forsvinningen av Start materialet ved 350 NM, d. Produktet av molar absorptivitet og Quantum yield av forsvinningen på 350 NM, e. Konsentrasjonen av den mettede oppløsningen i K-MOPPER (pH 7,2) (μg mL− 1).

Watch this Scientific Journal Video about Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds at JoVE.com

Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds

En protokoll for syntese og måling av fotokjemisk egenskaper av modulære bur forbindelser med klikkbare andeler presenteres.

Design, syntese, og fotokjemisk egenskaper klikkbare bur forbindelser

Caged compounds enable the photo-mediated manipulation of the cell physiology with high spatiotemporal resolution. However, the limited structural ...

Det overordnede målet med denne prosedyren er å gi en praktisk metode for fremstilling av fotokagede forbindelser med flere egenskaper som vannløselighet eller cellulær målrettingsevne. Ved hjelp av en enkel syntetisk prosedyre kan denne teknikken brukes til å utvide laboratoriet over burforbindelser og for å lage burforbindelser med flere egenskaper uten å gå på akkord med deres fotosensitivitet. Denne syntesen kan utføres i et standard laboratorium som våre klikkbare burforbindelser er stabile til fotobestråling når oppløst i ikke-nukleofile organiske løsemidler som diklormetan eller dimetylsulfoksid.Demonstrere prosedyren med Hirona Sasaki vil være Akinobu Suzuki, en post-doc, Hanami Aoki og Rei Watahiki, grad studenter fra laboratoriet. Begynn med å legge til 709,6 milligram paBhc metanol og 397,6 milligram n n-carbonyldiimidazol i en 30-milliliter rundbunnet kolbe. Tilsett tørre seks milliliter diklormetan i kolben og rør oppløsningen ved omgivelsestemperatur i en time.På slutten av inkubasjonen, tilsett 342,8 milligram 4-Dimethylaminopyridine og 552 mikroliter tert-butyl seks-amino hexylkarbamat, og rør løsningen ved omgivelsestemperatur i ytterligere tre timer. Bruk deretter en roterende fordamper under vakuum for å fjerne oppløsningsvæsken og andre flyktige materialer, og bruk silikagel flash kolonne kromatografi for å rense rester direkte. For å installere en funksjonell enhet i den klikkbare burforbindelsen, oppløs 249 milligram kobber to sulfatpentahydrat i 10 milliliter ion-utvekslet vann for å gi en 0,1 molar kobbersulfatløsning.Oppløs åtte milligram to førsteklasses paBhc mock paklitaksel, 7,5 milligram tris (3-hydroksypropyltriazolylmetylmetylmetylmetyl), amin, 162,4 milligram natrium-l-askorbat, og 3,1 milligram 15-klor-3, 6, 9-trioxypentyldecyl azid i et blandet oppløsningsvæske på 2,5 milliliter med 0,1 molarfosfatbuffer og 0,5 milliliter dimetylsulfoksid. Deretter legger du til 81,2 mikroliter med 0,1 molar kobbersulfatløsning til reaksjonsblandingen og rør blandingen ved omgivelsestemperatur i 80 minutter, og overvåker fremdriften av reaksjonen med HPLC. På slutten av reaksjonen, løs bunntrangene med 3,5 milliliter av en 75% acetyl nitryl vannløsning og bruk den resulterende løsningen direkte på det halvforberedende HPLC-systemet for å rense ønsket produkt.For kvanteeffektivitetsmålinger, under lysrør dekket med UV-lys avskåret filter, fortynne prøvelagerløsningen i 10 mikroliter dimetylsulfoksid med 10 milliliter KMOPS-buffer. Overfør en aliquot av løsningen til samme testrør som brukes i fotoreaksjonen av det kjemiske aktinometeret. Bestråle prøveløsningen med 350 nanometer lys i fem sekunder, fjerne 50 mikroliter aliquots fra bestrålte oppløsningen med jevne mellomrom for analyse av HPLC.Deretter bestemme bestråling tid i sekunder der 90% av startmaterialet reagerte ved å montere tomter av tidsavhengig forsvinning av startmaterialet. For HaloTag ligand målretting av en klikkbar bur sammensatte, høste målcellepopulasjonen av interesse med en passende celle dissosiasjon reagens og re-suspendere cellene i en 2,5 ganger 10 til femte celler per milliliter DMEM konsentrasjon. Deretter frø ca 10 til de femte cellene per tallerken i 35 milliliter glass bunnretter for en overnatting inkubasjon ved 37 grader celsius og 5% karbondioksid.Neste morgen, fortynne 14 mikrogram pc DNA tre halo epidermal vekstfaktor reseptor plasma DNA i en 1,5 milliliter mikro sentrifuge rør som inneholder 700 mikroliter av redusert serum medium. Deretter legger du til fem mikroliter av lipofeksjonsreagensen i 150 mikroliter med redusert serummedium til hvert av fire rør og lar rørene stå ved omgivelsestemperatur i fem minutter. På slutten av inkubasjonen, tilsett 150 mikroliter fortynnet plasma-DNA til hver av de fortynnede lipofection reagensprøvene og inkuber prøvene ved omgivelsestemperatur i ytterligere fem minutter.På slutten av inkubasjonen, skyll cellene med to milliliter PBS per tallerken og tilsett 1,5 milliliter med redusert serummedium til hver kultur. Tilsett 150 mikroliter av plasmid lipofection reagenskomplekset til hver tallerken og returner cellene til cellekulturinkubatoren i 48 timer. På slutten av inkubasjonen, aspirere supernativa og tilsett en milliliter nylaget DMEM supplert med to mikromolar paBhc hex fitzi halo til hver tallerken.Etter 30 minutter ved 37 grader celsius, aspirer mediet som inneholder burforbindelsen og skyll cellene to ganger med en milliliter PBS pluss for å fjerne eventuelle ubundne forbindelser. Tilsett 500 mikroliter med redusert serummedium til hver tallerken og returner cellene til cellekulturinkubatoren i ytterligere 30 minutter for å fjerne forbindelsene som kom inn i cellene. På slutten av inkubasjonen, skyll cellene to ganger med en milliliter PBS pluss per tallerken og tilsett en milliliter medium uten fenolrød til hver kultur.Deretter registrerer du florescence-bildene ved laserskanning av konfokal florescence mikroskopi. For fotomediert modulering av kinase lokalisering ved hjelp av en klikkbar bur sammensatte, frø ca fem ganger 10 til den femte TOC-A-one celler i to milliliter av Ham f12 medium per 35 milliliter glass bunnrett. Neste dag, transfect cellene med plasmid koding for GFP diacylglycerol kinase gamma i 48 timer som nettopp demonstrert.Etter slutten av transfection, erstatte transfection supernatant med to milliliter av redusert serum medium. Tilsett 20 mikroliter på 100 ganger paBhcAA arbeidsløsning til cellene for en fem til 60 minutters inkubasjon ved 37 grader celsius og 5% karbondioksid. På slutten av inkubasjonen, plasser parabolen på den objektive fasen av et omvendt fluorescerende mikroskop utstyrt med en dobbel lyskilde fluorescens illuminator.Bilde cellene hvert 10. Ved hjelp av denne metoden som demonstrert, klikkbare burforbindelser av noen biologisk interessante molekyler, inkludert paklitaksel og arachidonic acid, kan syntetiseres. Ytterligere egenskaper som vannløselighet og cellulær målretting evne kan innføres i paBhc mock paklitaksel via kobber en katalysert cyclization klikk reaksjon.Disse klikkbare bur paklitakselene kan deretter fotolyseres for å produsere sine overordnede forbindelser ved bestråling på 350 nanometer. De fysiske og fotokjemiske egenskapene til de klikkbare burforbindelsene oppsummeres i tabellen. I levende celleeksperimenter induserer målrettingen av paBhc hex fitzi halo til kultiverte pattedyrceller som uttrykker et HaloTagged protein og epidermal vekstfaktorreseptor et grønt florescenssignal fra fluorescein moiety PAHBHC hex fitzi halo på cellemembranen.Videre forårsaker behandling av CHO-K1-celler som midlertidig uttrykker GFP diacylglyserol kinase gamma med arakidonsyre modulasjon av subcellulær lokalisering av diacylglyserol kinase gamma. Lignende endringer i diacylenglyserol kinase gamma lokalisering er også observert i paBhc-AA behandlet celler etter UV lyseksponering. Når du utfører caging eksperimenter i vandige løsninger økende kultur medium, sørg for å alltid arbeide under fluorescerende lampe med kort bølge lengde avkortet filter.Etter denne prosedyren, Du kan studere bur forbindelser som har vært rikelig for bruk i biologiske eksperimenter på grunn av mangel på vannløselighet, membran permeabilitet eller cellulær målretting evne.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Synthesis of Antiviral Tetrahydrocarbazole Derivatives by Photochemical and Acid-catalyzed C-H Functionalization via Intermediate Peroxides (CHIPS)

Synthesis of Antiviral Tetrahydrocarbazole Derivatives by Photochemical and Acid-catalyzed C-H Functionalization via Intermediate Peroxides CHIPS

Syntese av Antiviral Tetrahydrocarbazole Derivater av fotokjemisk og Syrekatalysert CH funksjon via Intermediate Peroxides (CHIPS)

The direct functionalization of C-H bonds is an important and long standing goal in organic chemistry. Such transformations can be very powerful in order ...

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

Syntese av ikke-uniformt Pr-dopet SrTiO<sub&gt; 3</sub&gt; Keramikk og deres Termo Properties

We demonstrate a novel synthesis strategy for the preparation of Pr-doped SrTiO3 ceramics via a combination of solid state reaction and spark plasma ...

Photochemical Oxidative Growth of Iridium Oxide Nanoparticles on CdSe@CdS Nanorods

Fotokjemisk Oksidativt Vekst av Iridium Oxide Nanopartikler på CdSe @ CdS nanorods

We demonstrate a procedure for the photochemical oxidative growth of iridium oxide catalysts on the surface of seeded cadmium selenide-cadmium sulfide ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntese og karakterisering av supra Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Synthesis of Worm-lignende Miceller av synlig lys mediert dispersjonspolymeriseringen Bruke Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

Syntese og karakterisering av Fe-dopet Aluminosilicate nanorør med Enhanced Electron ledende egenskaper

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

Syntese av underlaget-bundet Au Nanowires Via en aktiv overflate vekst mekanisme

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a ...

Surface Properties of Synthesized Nanoporous Carbon and Silica Matrices

Overflateegenskaper av syntetisk Nanoporous karbon og Silica matriser

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) ...

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

Spatiotemporally kontrollert kjernefysiske translokasjon av gjester i levende celler med bur molekylær lim som Photoactivatable Tags

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

Synthesis and Characterization of Amphiphilic Gold Nanoparticles

Syntese og karakterisering av Amfifile Gold nanopartikler

Gold nanoparticles covered with a mixture of 1-octanethiol (OT) and 11-mercapto-1-undecane sulfonic acid (MUS) have been extensively studied because of ...