Name: quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation
Uploaded: 2019-08-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

يرغب المؤلفون في الاعتراف بـ Tessa Davis لمساهماتها الهامة في تطوير تحليل QMI، والأعضاء الحاليين والسابقين في مختبرات سميث وشروم للتوجيه التقني والمدخلات الفكرية. تم تمويل هذا العمل من خلال منح NIMH R01 MH113545 و R00 MH 102244.

1. تصميم الساي
<ol><li>إعداد الأجسام المضادة المرشح<ol>
<li>لكل بروتين من الفائدة، اختر 3 إلى 5 أجسام مضادة للشاشة. عند الإمكان، استخدم الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي تعترف بالإبالعامة المختلفة. وتشمل أيضا واحد الأجسام المضادة عنصر تحكم غير محددة.</li>
		<li>لإزالة Tris، قم بإجراء تبادل المخزن الم...

<ol>
	<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rodr&#237;guez-Jorge, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+T+cell+receptor+and+Toll-like+receptor+5+signaling+for+CD4.">Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4.</a> Science Signaling. 12 (577), (2019).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), (2018).</li><li>Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+signaling+by+modular+adaptor+proteins.">Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).</li><li>Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+G+protein+signaling.">The many faces of G protein signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).</li><li>Lohse, M. J., Hofmann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Aspects+of+Signaling+by+G-Protein-Coupled+Receptors.">Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors.</a> Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).</li><li>Eltschinger, S., Loewith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOR+Complexes+and+the+Maintenance+of+Cellular+Homeostasis.">TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis.</a> Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).</li><li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theoretical+framework+for+specificity+in+cell+signaling.">A theoretical framework for specificity in cell signaling.</a> Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+and+Specificity+in+Signal+Transduction+via+Physiologic+Protein+Interaction+Networks.">Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks.</a> Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).</li><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+essentials:+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks.">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).</li><li>Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+in+the+endoplasmic+reticulum+unfolded+protein+response.">Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).</li><li>Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Iron+Homeostasis:+New+Players+in+Metabolism,+Cell+Death,+and+Disease.">Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+matrix+network+analysis+of+protein+complexes+in+the+human+TCR+signalosome.">Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome.</a> Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).</li><li>Schrum, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Science's STKE. 2007 (389), (2007).</li><li>Brown, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+the+autisms+using+glutamate+synapse+protein+interaction+networks+from+cortical+and+hippocampal+tissue+of+seven+mouse+models.">Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models.</a> Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).</li><li>Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+induces+input-specific+rearrangements+in+a+targeted+synaptic+protein+interaction+network.">Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network.</a> Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+protein+complexes+isolated+from+primary+human+skin-resident+T+cells+can+be+analysed+by+Multiplex+IP-FCM.">Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM.</a> Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).</li><li>Neier, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+proximal+&#945;&#946;+TCR+signalosome+specifies+thymic+selection+outcome+through+a+quantitative+protein+interaction+network.">The early proximal &#945;&#946; TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network.</a> Science Immunology. 4 (32), (2019).</li><li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM:+immunoprecipitation+detected+by+flow+cytometry.">IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM+measures+physiologic+protein-protein+interactions+modulated+by+signal+transduction+and+small-molecule+drug+inhibition.">IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition.</a> PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).</li><li>Lautz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+changes+in+synaptic+protein+complex+composition+are+consistent+in+different+detergents+despite+differential+solubility.">Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility.</a> BioRXiv. , (2019).</li><li>Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WGCNA:+an+R+package+for+weighted+correlation+network+analysis.">WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis.</a> BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+bivalency+observed+among+TCR/CD3+complexes+isolated+from+primary+T+cells.">Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells.</a> Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).</li></ol>

يتطلب اختبار QMI استثمارات كبيرة في تطوير لوحة الأجسام المضادة والمعدات والكواشف، ولكن بمجرد إنشاء الفحص، يمكن للمرء جمع بيانات عالية الأبعاد لمراقبة شبكات التفاعل البروتينية لأنها تستجيب للرقابة التجريبية المحفزات. من الناحية الفنية، QMI يتطلب الأنابيب الدقيقة وتتبع مواقع العينة والأجس...

التفاعلات الديناميكية بين البروتين والبروتين تشكل سلاسل الإشارات الجزيئية والهياكل motile التي هي الأساس الوظيفي لمعظم علم وظائف الأعضاء الخلوية1. وغالبا ما تصور هذه العمليات على أنها مسارات الإشارات الخطية التي تحول بين الدول الثابتة على أساسمدخلات واحدة، ولكن البيانات التجريبية والنمذجة تبين بوضوح أنها تعمل كشبكات متكاملة 2،3، 4.في حالة البروتينات G, مستقبلات مختلفة غالبا ما يكون القدرة على تنشيط نفس البروتين G, ومستقبلات واحدة يمكن أيضا تنشيط أكثر من نوع واحد من البروتين G5,6. من أجل عدد صغير نسبيا من فئات البروتين G لتعديل على وجه التحديد مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية مثل انتقال متشابك, تنظيم هرمون, وهجرة الخلايا, الخلايا يجب على حد سواء دمج وتمييز هذه الإشارات4 , 5.وقد أظهرت الأدلة أن هذه الخصوصية إشارة، للبروتينات G وغيرها، وتستمد في المقام الأول على أساس التفاعلات البروتين البروتين ضبطها بدقة ودينامياتها الزمنية 1،3، 4 , 5 , 6 , 7.لأن شبكات الإشارات تتكون من مجمعات البروتين الديناميكي مع مدخلات متعددة، والمخرجات، وحلقات التغذية المرتدة، اضطراب واحد لديه الفرصة لتغيير التوازن المنزلي العام من علم وظائف الأعضاء الخلية4 ،7. ومن المتفق عليه الآن على نطاق واسع أنه ينبغي فحص الإشارات من منظور الشبكة من أجل فهم أفضل لكيفيةدمج المدخلات المتعددة يتحكم في الوظائف الخلوية المنفصلة في الصحة والمرض 7،8، 9،10،11،12،13. في ضوء ذلك، تم تطوير الكم ّي متعددة المناعة (QMI) لجمع متوسطة الإنتاجية، والبيانات الكمية حول التغيرات أضعاف في شبكات التفاعل البروتين الديناميكي.
QMI هو فحص يستند إلى الأجسام المضادة حيث يتم احتضان الليسات الخلية مع لوحة من الأجسام المضادة لهون الأمطار المناعية التي تقترن بشكل مشترك إلى الخرز المغناطيسي التي تحتوي على نسب متميزة من الأصباغ الفلورية. وجود أجسام مضادة محددة إلى جانب فئات حبة المغناطيسي متميزة يسمح لمتزامنة co-immunoprecipitation من البروتينات المستهدفة متعددة من نفس lysate. بعد هطول الأمطار المناعية (IP)، يتم احتضان الخرز المغناطيسي مع ثاني، جسم مضاد للمسبار الفلوري المترافق (أو الأجسام المضادة biotinylated جنبا إلى جنب مع streptavidin الفلوروفوري المترافق). ثم يتم الكشف عن الارتباطات المشتركة بين البروتينات المعترف بها من قبل كل زوج الأجسام المضادة للأجسام IP، أو PiSCES (البروتينات في المجمعات المشتركة التي تم الكشف عنها من قبل epitopes السطح المكشوفة)، عن طريق قياس التدفق ويمكن مقارنتها كميا بين مختلف عينة الشروط14. تُظهر الرسوم التوضيحية في الشكل 1 الخطوات التي ينطوي عليها إجراء فحص QMI، بما في ذلك رسم تخطيطي للحبات المغناطيسية مع مجمعات البروتين المُعفية المناعية التي تحمل هالاً مضادة للمسبار المترافق بشكل فلوري (الشكل1C).
حساسية QMI يعتمد على تركيز البروتين من lysate نسبة إلى عدد من الخرز المغناطيسي المستخدمة لمناعة الترسيب، وتحقيق قرار للكشف عن 10٪ أضعاف التغييرات يتطلب سوى كمية صغيرة من المواد البداية بالمقارنة مع غيرها من أساليب الملكية الفكرية المشتركة14،15. على سبيل المثال، كمية المواد الأولية المستخدمة في QMI مشابهة لتلك المطلوبة لشطيرة مرتبطة بالإنزيم المناعيSorbent الفحص (ELISA)، ولكن يتم الكشف عن تفاعلات متعددة في الفحص QMI واحد. تم إجراء فحص QMI باستخدام 20 نقطة IPs و20 هدف مسبار باستخدام 1-5 × 105 خلايا T الأولية معزولة عن خزعة الجلد 4 مم، والاستعدادات متشابك P2 من قسم الإكليل 3 مم من القشرة الأمامية للماوس، أو 3 × 106 الماوس المستزرع الابتدائي الخلايا العصبية القشرية14،16،17. هذه الحساسية تجعل QMI مفيدة لتحليل الخلايا أو الأنسجة ذات التوافر المحدود، مثل العينات السريرية.
يمكن تكييف QMI لأي شبكة تفاعل بروتين محددة مسبقًا (شريطة أن تكون الأجسام المضادة متوفرة)، وقد تم تطويرها حتى الآن لتحليل مستقبلات مستضد الخلايا T (TCR) الإشارة ومجموعة فرعية من البروتينات في نقاط الاشتباك العصبي الجلوتاساتفية في الخلايا العصبية 17 سنة , 18.في دراسات إشارات مستقبلات الخلايا T، تم استخدام QMI لأول مرة لتحديد التغيرات الناجمة عن التحفيز في PiSCES، ومن ثم للتمييز بين مرضى المناعة الذاتية من مجموعة التحكم، والكشف عن إشارات المناعة الذاتية الذاتية، وأخيرا لتوليد فرضية تنطوي على شبكة فرعية غير متوازنة المرتبطة بالمرض من التفاعلات14. في الآونة الأخيرة، تم استخدام نفس لوحة QMI لتحديد أن يتم تحديد الخلايا الصعترية من خلال الاختلافات الكمية بدلا من النوعية في البروتين المرتبط بـ TCR مما يشيرإلى 19. في الخلايا العصبية، تم استخدام QMI لوصف إعادة ترتيب المدخلات المحددة لشبكة تفاعل البروتين لأنواع متميزة من إشارات الإدخال بطريقة تدعم النماذج الناشئة حديثا من اللدونة متشابك17. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام لوحة QMI متشابك لتحديد الاختلافات في سبعة نماذج الماوس من التوحد، وتجميع النماذج في مجموعات فرعية على أساس التوقيعات الحيوية PiSCES الخاصة بهم، ويفترض بدقة العجز الجزيئي المشترك الذي لم يتم التعرف عليه سابقا في واحدة من النماذج16. ويمكن استخدام نهج مماثل لفحص المجموعات الفرعية الأخرى التي قد تستجيب لمختلف علاجات المخدرات، أو لتعيين عقاقير لمجموعات فرعية متجاوبة محددة. QMI لديها تطبيقات محتملة في التشخيص، والكتابة الفرعية للمرضى، وتطوير المخدرات، بالإضافة إلى العلوم الأساسية.
لتجميع لوحة الأجسام المضادة QMI، يتم وصف البروتوكولات الأولية لفحص الأجسام المضادة واختيارها في القسم 1 أدناه. وبمجرد تحديد ألواح الأجسام المضادة، يتم وصف بروتوكولات لاقتران الأجسام المضادة المختارة للحبات المغناطيسية للملكية الفكرية، وللتحلل الحيوي للأجسام المضادة المسبارية المختارة، في القسم 2. ويرد وصف بروتوكول تشغيل فحص QMI على الخلايا أو الأنسجة lysates في القسم 3. وأخيراً، بما أن تجربة واحدة يمكن أن تولد حوالي 5 x 105 نقاط بيانات فردية، يتم توفير التعليمات ورموز الكمبيوتر للمساعدة في معالجة البيانات وتحليلها والتصور في القسم 4. وترد في الشكل 1نظرة عامة على سير العمل الوارد وصفه في الأبواب من 2 إلى 4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well flat bottomed plates</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171025001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well PCR plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82006-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bioplex 200 System with HTF</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171000205</td>
			<td>modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bio-Plex Pro Wash Station</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">30034376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">BSA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">CML beads</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C37481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EDTA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">MagPlex Microspheres</td>
			<td style="width:121px;">Luminex</td>
			<td style="width:119px;">MC12xxx-01</td>
			<td>xxx is the 3 digit bead region</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Melon Gel IgG Spin Purification Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45206</td>
			<td>used for antibody purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:237px;">MES</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Microplate film, non-sterile</td>
			<td style="width:121px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2920-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Phosphotase inhibitor cocktail #2</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sandwich Prep Refrigerator</td>
			<td style="width:121px;">Norlake</td>
			<td>SMP 36 15</td>
			<td>for custom refrigeration of Bioplex 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Streptavidin-PE</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">405204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sulfo NHS</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Tris</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation

تتحكم التفاعلات الديناميكية بين البروتين والبروتين في السلوك الخلوي، من الحركة إلى النسخ المتماثل للحمض النووي إلى تحويل الإشارة. ومع ذلك، فإن رصد التفاعلات الديناميكية بين البروتينات المتعددة في شبكة تفاعل البروتين أمر صعب من الناحية التقنية. هنا، نقدم بروتوكول اتونى الكمية متعددة المناعة (QMI)، والذي يسمح بالتقييم الكمي للتغيرات أضعاف في تفاعلات البروتين على أساس قياسات الفلورة النسبية من البروتينات في المجمعات المشتركة التي تم الكشف عنها من قبل يتعرض الepitopes السطحية (PiSCES). في QMI، يتم تسريع مجمعات البروتين من الليسات الخلوية المناعية على الميكروسفيرات، ومن ثم يتم فحصها بجسم مضاد مسمى لبروتين مختلف من أجل تحديد كمية وفرة PiSCES. يتم الجمع بين الأجسام المضادة الترسيب المناعي إلى مناطق الطيفية MagBead مختلفة، مما يسمح لمقياس التدفق للتمييز بين الترسيب المناعي الموازي المتعدد وتحديد كمية الأجسام المضادة للمسبار المرتبطة بكل منها في نفس الوقت. لا يتطلب QMI وضع علامات وراثية ويمكن القيام به باستخدام الحد الأدنى من المواد الحيوية مقارنة بأساليب الترسيب المناعي الأخرى. يمكن تكييف QMI لأي مجموعة محددة من البروتينات المتفاعلة، وقد استخدمت حتى الآن لوصف شبكات الإشارات في الخلايا T ونقاط الاشتباك العصبية الغلوتامات. وقد أدت النتائج إلى توليد فرضية جديدة مع التطبيقات التشخيصية والعلاجية المحتملة. يتضمن هذا البروتوكول إرشادات لتنفيذ QMI، من التحديد الأولي للوحة الأجسام المضادة حتى تشغيل الاختبارات وتحليل البيانات. التجميع الأولي لفحص QMI ينطوي على فحص الأجسام المضادة لإنشاء لوحة، وتحديد تجريبيا ً المخزن المؤقت للlysis المناسب. ويشمل إعداد الكاشف اللاحق اقتران الأجسام المضادة لهطول الأمطار المناعية إلى MagBeads، والأجسام المضادة التحقيق biotinylating بحيث يمكن وصفها من قبل الفلوروفور مترافق streptavidin. لتشغيل فحص، يتم خلط lysate مع MagBeads بين عشية وضحاها، ومن ثم يتم تقسيم الخرز وحضانة مع الأجسام المضادة التحقيق مختلفة، ومن ثم تسمية فلوروفور، وقراءة من قبل قياس التدفق. يتم إجراء اختبارين إحصائيين لتحديد PiSCES التي تختلف بشكل كبير بين الظروف التجريبية، ويتم تصور النتائج باستخدام خرائط الحرارة أو الرسومات التخطيطية على حافة العقدة.

فحص الأجسام المضادة الشكل 2 B يظهر نتائج شاشة للبروتين Connexin36. معظم تركيبات IP_probe تنتج أي إشارة عبر عناصر التحكم IgG. IP مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة 1E5 والتحقيق مع إما 1E5 أو الأجسام المضادة متعددة النسيلة 6200 تنتج تحولا نحو اليمين في توزيع حبة مقارنة مع ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

يستخدم الترسيب المناعي المتعدد الكمية (QMI) قياس التدفق الخلوي للكشف الحساس عن الاختلافات في وفرة التفاعلات المستهدفة بين البروتين والبروتين بين عينتين. يمكن إجراء QMI باستخدام كمية صغيرة من المواد الحيوية، ولا يتطلب علامات هندسية وراثيا، ويمكن تكييفها لأي شبكة تفاعل البروتين المحددة سابقا.

القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

يمكّن التشبيك المناعي المشترك المضاعف الكمي، أو QMI، المستخدمين من قياس المئات من التفاعلات الثنائية في شبكة تفاعل البروتين المحددة مسبقًا في وقت واحد. من خلال تنفيذ متعددة شارك في IPs في وقت واحد في نفس lysate ، تقنيات المعلوماتية الحيوية يمكن ثم دراسة كيفية تغيير مجموعات من الجمعيات المشتركة بطريقة منسقة. المقايسة تستغرق وقتا طويلا لتطوير، ولكن مرة واحدة لوحة QMI هو في متناول اليد يمكن جمع بيانات نطاق الشبكة حول أنظمة نقل الإشارات في مجرد إجراء تحليل بين عشية وضحاها نسبيا.يتطلب مؤشر قطر قطر لميكون الألواح الدقيق للعينات والكواشف المختلفة في 96 صحن بئر. وينبغي أن تؤخذ الملاحظات الدقيقة عند إعداد وتشغيل كل مُقيّم لمنع الأخطاء. لإعداد العينات والمناعة ، ابدأ من خلال وضع العينة في منظفات مناسبة مع مثبطات البروتياز والفوسفاتاز لاحتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد.في نهاية الحضانة، تدور أسفل العينة لإزالة الأغشية والحطام وإجراء اختبار BCA على اابر لتحديد تركيز البروتين وفقا للبروتوكولات القياسية. بعد تطبيع تركيزات البروتين، إعداد مزيج سيد حبة المغناطيسي الذي يحتوي على ما يقرب من 250 الخرز المغناطيسي من كل فئة في البئر. استخدام فصل المغناطيسي لغسل مزيج حبة المغناطيسي مرتين في Fly P العازلة قبل resuspending الخرز في 20 ميكرولترات من يطير P العازلة لكل عينة.بعد pipetting شامل، aliquot 20 ميكرولترات من الخرز في أنبوب صغير مركز الجليد الجليد واحد لكل عينة وإضافة كميات متساوية من lysate مع تركيزات البروتين تطبيع لكل أنبوب للمناعة. ثم تقسيم كل عينة lysate إلى أنبوب واحد لكل لوحة يجري تشغيلها ومناعةcipitate العينات على دوار في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها محمية من الضوء. في صباح اليوم التالي استخدام رف الخرز المغناطيسي لإزالة lysate من المجموعة الأولى من الأنابيب وغسل الخرز مرتين في 500 ميكروليتر من الجليد الباردة يطير P العازلة في غسل.بعد حساب حجم resuspension ، resuspend مناعية في حجم محسوبة الجليد الباردة ذبابة P العازلة. resuspend بدقة الخرز المغناطيسي عن طريق pipetting لطيف وتوزيع 25 ميكرولترات من الخرز في بئر عبر مسطحة القاع 96 لوحة جيدا على الجليد. في لوحة مختلفة 96 جيدا، تمييع بواسطة الأجسام المضادة التحقيق attinilated إلى تركيز العمل مرتين.استخدام ماصة متعددة القنوات لتوزيع 25 ميكرولترات من كل مسبار التخفيف من الأجسام المضادة في الآبار المناسبة من حبة المغناطيسية التي تحتوي على لوحة المقايسة ويهز بسرعة عالية على لوحة أفقية شاكر لخلط و resuspend الخرز المغناطيسي. بعد الاختلاط، والحد من سرعة لاحتضان ساعة واحدة في أربع درجات مئوية محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل لوحة ثلاث مرات مع الطازجة ذبابة P العازلة لكل غسل على غسالة لوحة المغناطيسي في أربع درجات مئوية.بعد الغسيل الأخير ، resuspend الخرز في 50 ميكرولترات من streptavidin PE المخفف واحد إلى 200 في فلاي بي العازلة. يهز المزيج وإعادة بناء الخرز قبل احتضان لوحة في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل لوحة ثلاث مرات مع يطير P العازلة على غسالة لوحة مغناطيسية في أربع درجات مئوية وإعادة ربط الخرز في 125 ميكروليترس من ذبابة P العازلة.يهز لوحة لمدة دقيقة واحدة في 900 التناوب لإعادة توزيع جيدا الخرز وتحميل لوحة في عداد المقاييس تدفق refridgerated. في برنامج مقياس التدفق، حدد إعداد الهدف RP1 High، وحالة توقف 1000 حبة لكل منطقة، وحجم عينة من 80 ميكرولترات. وقفة تشغيل في منتصف الطريق من خلال وإعادة تعليق الخرز لمنع الاستقرار.في نهاية التشغيل، تصدير ملفات البيانات في تنسيق XML. لإجراء تحليل ANC ، قم بملء ملف الإدخال الخاص بـ ANC ليعكس تفاصيل التصميم التجريبي وتشغيل البرنامج ، والذي سيكتب ملف CSV في الدليل النشط. الملف الذي ينتهي بـ مرات الدخول.سيُبلغ csv عن الارتباطات المشتركة للبروتين التي تختلف بشكل كبير عند مستوى إيجابي زائف يبلغ 0.05 بين ظروف التحكم والتجريبية في ثلاثة على الأقل من أربعة نسخ تجريبية. لتحليل شبكة الارتباط المرجح، قم بلصق عناوين الأعمدة الخاصة بإخراج ملف البيانات بواسطة Matlab الذي ينتهي بالملف mfi. csv في العمود الأول من جدول بيانات جديد وإضافة أعمدة تجربة للتجربة رقم والعلاج للعلاج التجريبي وأي متغيرات أخرى لتحليلها.حفظ هذا الملف كـ سمات. csv وفتح R ستوديو. تعيين دليل العمل إلى مجلد يحتوي على mfi.csv والسمات. CSV ملفات تمييز المقاطع من التعليمات البرمجية، وضرب الأوامر أدخل لتشغيل الأوامر R كما هو مبين في ملف الأوامر المعلقة. وحدات تحليل شبكة الارتباط المرجح المرتبطة بشكل كبير مع كل سمة تجريبية سوف يكون الإخراج كملف رسومية والارتباط من كل تفاعل مع كل وحدة سوف يكون الإخراج كملف CSV.لكل تفاعل في ملف إخراج ANC، تحديد ما إذا كان هذا التفاعل هو أيضا كبيرة من قبل CNA وإنشاء عمود جديد يشير إلى ما إذا كان كل ضربة ANC هو أيضا ضرب CNA. تحويل القيم إلى تسجيل تغيير أضعاف اثنين وحساب متوسط قيمة كافة الزيارات CNA الاتحاد ANC. وأخيراً، قم بعمل جدول بيانات جديد مع كل اتحاد من اتحادات ANC تم إدراجه في العمود الثالث من قبل هدف المناعة في عمود واحد، وهدفه في العمود الثاني، وقيمة تغييره الطي في العمود الثالث.استيراد هذا الملف إلى Cytoscape كشبكة لإنشاء مخطط حافة عقدة. يتم تصور تفاعلات البروتين عالية الثقة التي حددها النهجان الإحصائيان المستقلان على أنها مخططات حافة العقدة باستخدام برنامج المصدر المفتوح ، Cytoscape ، أو كخرائط heatmap باستخدام رمز R وتعليمات التحليل المضمنة في المواد التكميلية. طوال البروتوكول ، يحتاج المستخدمون إلى توخي الحذر من الماصات بدقة ، للحفاظ على سجلات دقيقة ، والحفاظ على العينات باردة في جميع الأوقات.لقد استخدمنا QMI لفهم كيفية التفريق بين مسارات تحويل الإشارات بين أنواع الإدخال المختلفة ودمج المعلومات من مستقبلات متعددة.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

تصور التفاعل البروتين البروتين في هيولي النووية والكسور بواسطة شركة مناعي و<em&gt; في الموقع</em&gt; القرب من ربط الفحص

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

التحقيق البروتين تسلسل-هيكل-ديناميات العلاقات مع Bio3D على شبكة الإنترنت

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

مراقبة ديناميكيات تفاعل البروتين والحمض النووي الريبي في الجسم الحي بدقة زمنية عالية باستخدام χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية لتحليل التفاعل البروتينية الغشاء

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

الالتقاط بمساعدة الراتنج إلى جانب وضع علامات الكتلة الترادفية متساوية الضغط من أجل القياس الكمي المضاعف لأكسدة ثيول البروتين

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...