Name: quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation
Uploaded: 2019-08-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

作者希望感谢 Tessa Davis 对 QMI 测定开发做出的重要贡献，以及史密斯和施鲁姆实验室的现任和前任成员的技术指导和智力投入。这项工作由NIMH赠款R01 MH113545和R00 MH 102244资助。

1. 测试设计
<ol><li>候选抗体制备<ol>
<li>对于每个感兴趣的蛋白质，选择3到5个抗体进行筛选。如果可能，使用识别不同表位的单克隆抗体。还包括一种非特异性控制抗体。</li>
		<li>要去除Tris，请通过将抗体添加到30 kDa自旋过滤器中，向下旋转至最小体积，加入500μL的磷酸盐缓冲盐水（PBS），并重复3次，从而进行缓冲液交换。要去除载体蛋白，请根据制造商的协议执行抗体纯化（有关特定纯化建?...

<ol>
	<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rodr&#237;guez-Jorge, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+T+cell+receptor+and+Toll-like+receptor+5+signaling+for+CD4.">Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4.</a> Science Signaling. 12 (577), (2019).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), (2018).</li><li>Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+signaling+by+modular+adaptor+proteins.">Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).</li><li>Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+G+protein+signaling.">The many faces of G protein signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).</li><li>Lohse, M. J., Hofmann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Aspects+of+Signaling+by+G-Protein-Coupled+Receptors.">Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors.</a> Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).</li><li>Eltschinger, S., Loewith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOR+Complexes+and+the+Maintenance+of+Cellular+Homeostasis.">TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis.</a> Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).</li><li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theoretical+framework+for+specificity+in+cell+signaling.">A theoretical framework for specificity in cell signaling.</a> Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+and+Specificity+in+Signal+Transduction+via+Physiologic+Protein+Interaction+Networks.">Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks.</a> Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).</li><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+essentials:+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks.">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).</li><li>Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+in+the+endoplasmic+reticulum+unfolded+protein+response.">Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).</li><li>Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Iron+Homeostasis:+New+Players+in+Metabolism,+Cell+Death,+and+Disease.">Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+matrix+network+analysis+of+protein+complexes+in+the+human+TCR+signalosome.">Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome.</a> Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).</li><li>Schrum, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Science's STKE. 2007 (389), (2007).</li><li>Brown, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+the+autisms+using+glutamate+synapse+protein+interaction+networks+from+cortical+and+hippocampal+tissue+of+seven+mouse+models.">Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models.</a> Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).</li><li>Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+induces+input-specific+rearrangements+in+a+targeted+synaptic+protein+interaction+network.">Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network.</a> Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+protein+complexes+isolated+from+primary+human+skin-resident+T+cells+can+be+analysed+by+Multiplex+IP-FCM.">Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM.</a> Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).</li><li>Neier, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+proximal+&#945;&#946;+TCR+signalosome+specifies+thymic+selection+outcome+through+a+quantitative+protein+interaction+network.">The early proximal &#945;&#946; TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network.</a> Science Immunology. 4 (32), (2019).</li><li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM:+immunoprecipitation+detected+by+flow+cytometry.">IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM+measures+physiologic+protein-protein+interactions+modulated+by+signal+transduction+and+small-molecule+drug+inhibition.">IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition.</a> PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).</li><li>Lautz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+changes+in+synaptic+protein+complex+composition+are+consistent+in+different+detergents+despite+differential+solubility.">Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility.</a> BioRXiv. , (2019).</li><li>Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WGCNA:+an+R+package+for+weighted+correlation+network+analysis.">WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis.</a> BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+bivalency+observed+among+TCR/CD3+complexes+isolated+from+primary+T+cells.">Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells.</a> Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).</li></ol>

QMI 测定需要在抗体面板开发、设备和试剂方面投入大量资金，但一旦建立了检测，就可以收集高维数据来观察蛋白质相互作用网络，因为它们对实验控制的反应刺激。从技术上讲，QMI 需要仔细移液和跟踪样品和抗体井位置。仔细标记化片是有用的，就像在纸上制作井位的详细模板一样，然后保存该模板进行数据分析。在任何时候保持珠子和流源性冷的重要性，包括在流式细胞仪微孔板载体中（?...

动态蛋白质-蛋白质相互作用构成分子信号级联和移动结构，是大多数细胞生理学的功能基础。这些过程通常被描述为线性信号通路，在基于单个输入的稳定状态之间切换，但实验和建模数据清楚地显示它们作为集成网络2、3、 4.就G蛋白而言，不同的受体通常具有激活同一G蛋白的能力，而单个受体也可以激活多种类型的G蛋白5，6。为了使相对较少的G蛋白类专门调节大量的细胞功能，如突触传输，激素调节和细胞迁移，细胞必须集成和区分这些信号4,5.有证据表明，对于G蛋白和其他蛋白质来说，这种信号特异性主要是基于精细调整的蛋白质-蛋白质相互作用及其时间动力学1，3。4,5,6,7.由于信令网络由具有多个输入、输出和反馈回路的动态蛋白质复合物组成，因此单个扰动有机会改变细胞生理的整体静时平衡4 ，7.现在人们普遍认为，信号应从网络的角度来研究，以便更好地了解多个输入的集成如何控制健康和疾病7、8、离散细胞功能。 9，10，11，12，13.鉴于此，开发了定量多路免疫沉淀 （QMI）， 以收集有关动态蛋白质相互作用网络中折叠变化的中等通量定量数据。
QMI 是一种基于抗体的测定，其中细胞解结物与一组免疫沉淀抗体进行孵育，这些抗体与含有不同比例荧光染料的磁珠共价耦合。将特定的抗体耦合到不同的磁珠类别，可以同时从同一致莱沙中同时对多个靶蛋白进行共免疫沉淀。在免疫沉淀 （IP） 之后，用第二种荧光荧光结合探针抗体（或与荧光磷结合链球菌联合剂联合的亲化抗体）孵育磁珠。每个 IP 抗体-探针抗体对或 PiSCES（暴露表面表位检测到的共享复合物中的蛋白质）之间的共结，然后通过流式细胞测定检测，并可在不同之间定量比较样本条件14.图1中的插图显示了运行QMI测定的步骤，包括由荧光结合探针抗体标记的带有免疫沉淀蛋白复合物的磁珠图（图1C）。
QMI 的灵敏度取决于赖酸与用于免疫沉淀的磁珠数量的蛋白质浓度，与其他基质相比，要检测 10% 折叠变化的分辨率只需要少量的起始材料共同知识产权方法14，15 。例如，QMI 中使用的起始材料量与三明治酶链接免疫吸附测定 （ELISA） 所需的原料量类似，但在单个 QMI 检测中检测到多个相互作用。使用 20 个 IP 和 20 个探针靶点进行的 QMI 测定使用从 4 mm 皮肤活检中分离的 1-5 x 105初级 T 细胞、从小鼠前额皮质的 3 mm 日冕部分或 3 x 106培养小鼠原发性小鼠原发性中分离的 P2 突触体制剂皮质神经元14，16，17。这种敏感性使 QMI 可用于分析可用性有限的细胞或组织，如临床样本。
QMI 可以适用于任何先前定义的蛋白质相互作用网络（前提是有抗体可用），并且到目前为止已经开发用于分析 T 细胞抗原受体 （TCR） 信号体和神经元谷氨酸突触中的蛋白质子集17,18.在T细胞受体信号的研究中，QMI首先用于识别PiSCES中的刺激引起的变化，然后区分自体免疫患者与对照组，检测内源性自身免疫信号，最后产生假说涉及一个不平衡的疾病相关的相互作用的子网络14。最近，同一个QMI面板被用来确定胸腺细胞的选择是由定量而不是质量差异在TCR相关蛋白质信号19。在神经元中，QMI用于描述不同类型的输入信号的蛋白质相互作用网络的输入特定重新排列，以支持新出现的突触可塑性模型17。此外，这个突触QMI面板用于识别七个自闭症小鼠模型的差异，根据PiSCES生物特征将模型聚集到子组中，并准确假设以前未识别的共享分子缺陷在一个模型16。类似的方法可用于筛选可能对不同药物治疗作出反应的其他子组，或将药物分配给特定反应的子组。除了基础科学之外，QMI在诊断、患者分型和药物开发方面也有潜在的应用。
为了组装QMI抗体面板，下面第1节描述了初始抗体筛选和选择方案。一旦确定抗体面板，第 2 节将所选抗体与磁性磁珠的偶联方案与 IP 磁珠结合，以及所选探针抗体的生物仿当。第 3 节描述了在细胞或组织莱沙上运行 QMI 测定的协议。最后，由于单个实验可以生成 +5 x 105个单个数据点，因此第 4 节提供了有助于数据处理、分析和可视化的说明和计算机代码。第 2-4 节中描述的工作流概述如图1所示。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well flat bottomed plates</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171025001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well PCR plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82006-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bioplex 200 System with HTF</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171000205</td>
			<td>modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bio-Plex Pro Wash Station</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">30034376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">BSA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">CML beads</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C37481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EDTA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">MagPlex Microspheres</td>
			<td style="width:121px;">Luminex</td>
			<td style="width:119px;">MC12xxx-01</td>
			<td>xxx is the 3 digit bead region</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Melon Gel IgG Spin Purification Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45206</td>
			<td>used for antibody purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:237px;">MES</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Microplate film, non-sterile</td>
			<td style="width:121px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2920-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Phosphotase inhibitor cocktail #2</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sandwich Prep Refrigerator</td>
			<td style="width:121px;">Norlake</td>
			<td>SMP 36 15</td>
			<td>for custom refrigeration of Bioplex 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Streptavidin-PE</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">405204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sulfo NHS</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Tris</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation

动态蛋白-蛋白质相互作用控制细胞行为，从运动到DNA复制到信号转导。然而，监测蛋白质相互作用网络中多种蛋白质之间的动态相互作用在技术上是困难的。在这里，我们提出了定量多路复用免疫沉淀 （QMI） 的协议，它允许根据暴露检测到的共享复合物中蛋白质的相对荧光测量，定量评估蛋白质相互作用的褶皱变化表面表位（PiSCES）。在QMI中，来自细胞解物的蛋白质复合物被免疫沉淀到微球上，然后用标记的抗体探测不同的蛋白质，以量化PiSCES的丰度。免疫沉淀抗体与不同的 MagBead 光谱区域结合，使流式细胞仪能够区分多个平行免疫沉淀，同时量化与每个光谱抗体相关的量。与其他免疫沉淀方法相比，QMI不需要遗传标记，可以使用最少的生物材料进行。QMI可以适应任何定义的相互作用蛋白组，到目前为止已经用于描述T细胞和神经元谷氨酸突触中的信号网络。研究结果产生了新的假说，具有潜在的诊断和治疗应用。该协议包括执行 QMI 的指令，从初始抗体面板选择到运行检测和分析数据。QMI测定的初始组装涉及筛选抗体以生成面板，并实证确定适当的莱沙缓冲液。随后的试剂制备包括共价耦合免疫沉淀抗体与MagBeads，以及生物仿菌探针抗体，以便它们可以被链球菌-结合荧光剂标记。为了运行测定，裂解物与MagBeads在一夜之间混合，然后用不同的探针抗体分珠和孵育，然后贴上荧光度标签，然后通过流式细胞仪读取。执行两个统计测试，以识别在实验条件之间差异很大的 PiSCES，并使用热图或节点边缘图对结果进行可视化。

抗体筛查 图 2B显示蛋白质 Connexin36 的屏幕结果。大多数 IP-probe 组合在 IgG 控制装置上不产生信号。与 IgG 对照组相比，具有单克隆抗体 1E5 和 1E5 或多克隆抗体 6200 的探针的 IP 在珠子分布中产生右移。在这里，选择 IP 1E5 和探针 6200poly 是为了避免使用与 IP 和探针相同的抗体，同时降低非特异性蛋白质被两个独立抗体识别的可能性，并增加使用不同...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

定量多路复用免疫沉淀 （QMI） 使用流式细胞测定技术，灵敏地检测两个样本之间靶向蛋白-蛋白质相互作用的丰度差异。QMI可以使用少量的生物材料进行，不需要基因工程标签，并可以适应任何先前定义的蛋白质相互作用网络。

使用多路复用共免疫沉淀对蛋白质相互作用网络动力学进行量化

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

定量多路复用共免疫沉淀（QMI）使用户能够同时测量预定义的蛋白质相互作用网络中的数百个二元相互作用。通过在同一个酸盐中同时执行多个共体，生物信息学技术可以检查共同关联组如何以协调的方式变化。开发该检测非常耗时，但一旦 QMI 面板在手网络规模中，就可以在相对简单的通宵检测中收集有关信号转导系统的数据。QMI 要求将不同的样品和试剂精确移液到 96 个孔板中。在设置和运行每个检测时，应仔细注意，以防止错误。对于样品制备和免疫沉淀，首先将样品用蛋白酶和磷酸酶抑制剂在合适的洗涤剂中去除，在冰上孵育15分钟。在孵育结束时，将样品旋转以去除膜和碎屑，并在上清液上进行 BCA 测定，根据标准协议确定蛋白质浓度。使蛋白质浓度正常化后，准备一个磁珠主混合物，每井每类包含大约250个磁珠。使用磁分离在 Fly P 缓冲液中清洗磁珠混合两次，然后将磁珠重新悬浮在每个样品的 20 微升 Fly P 缓冲液中。经过彻底的移液后，将20微升珠分到每个样品的一个冰冷微离心管中，并将同等体积的糖酸盐与正常化蛋白质浓度添加到每个管中，用于免疫沉淀。然后将每个赖酸盐样品分成一个管，每个板运行和免疫沉淀样品在旋转器上四摄氏度过夜保护免受光。第二天早上，使用磁珠架从第一组管子中去除落酸，每次洗涤时在500微升的冰冷飞P缓冲液中洗涤珠子两次。计算再增量后，在计算量中重新分配免疫沉淀物的冰冷飞P缓冲液。通过轻轻移液彻底重新悬浮磁珠，并将每井 25 微升珠点分配到冰上平底 96 井板中。在不同的96井板中，通过刺激探针抗体稀释两倍的工作浓度。使用多通道移液器将每个探针抗体稀释的 25 微升分配到包含检测板的磁珠的适当孔中，并在水平板摇床上高速摇动，以混合和重新悬浮磁珠。混合后，在4摄氏度下降低一小时的孵育速度，防止光线。在孵化结束时，在四摄氏度的磁板垫圈上用新鲜飞P缓冲液清洗板三次。上次洗涤后，在飞P缓冲液中重新用50微升的链球菌PE稀释1至200。摇动混合物并重新暂停珠子，然后将板在4摄氏度下孵育30分钟，防止光线。在孵育结束时，在4摄氏度的磁板垫圈上用飞P缓冲器清洗板三次，并在125微升的飞P缓冲器中重新悬浮珠子。在 900 次旋转时摇动板一分钟，以彻底重新释放磁珠，然后将板装入回流流量圆度计中。在流式细胞仪软件中，选择"高RP1目标"设置、每个区域1000个点珠的停止条件以及80微升的采样量。中途暂停运行，并重新暂停珠子，以防止沉降。在运行结束时，导出 XML 格式的数据文件。若要执行 ANC 分析，请填写 ANC 输入文件以反映实验设计的详细信息并运行程序，该程序将 CSV 文件写入活动目录。以命中结尾的文件。csv 将报告在至少四个实验复制中，在对照和实验条件之间在 0.05 的假阳性水平下明显不同的蛋白质关联。对于加权相关网络分析，粘贴 Matlab 以 mfi 结尾的数据文件输出的列标题。csv 进入新电子表格的第一列，并添加实验编号实验列和实验治疗实验治疗列以及要分析的任何其他变量。将此文件另存为特征。csv 和打开 R 工作室。将工作目录设置为包含 mfi 的文件夹。csv 和特征。csv 文件，突出显示代码部分，并点击命令 Enter 以运行 R 命令，如注释的命令文件中所示。与每个实验特性显著相关的加权相关网络分析模块将作为图形文件输出，每个模块的每个交互的相关性将输出为CSV文件。对于 ANC 输出文件中的每一次交互，请确定 CNA 是否也具有该交互意义，并创建一个新列，指示每个 ANC 命中是否也是 CNA 命中。转换值以记录两个折数更改，并计算所有 ANC 联合 CNA 命中的平均值。最后，制作一个新的电子表格，每个 ANC 联合 CNA 在一列中列出其免疫沉淀目标，其探测目标在第二列中，并在第三列中显示其折叠变化值。将此文件作为网络导入 Cytoscape 以创建节点边缘图。两种独立统计方法确定的高置信蛋白相互作用，使用开源软件 Cytoscape 将可视化为节点边缘图，或使用补充材料中包含的 R 代码和分析说明作为热图。在整个协议中，用户需要小心切化移液器，保持细致的记录，并保持样品始终保持冷。我们使用QMI来了解信号转导通路如何区分不同的输入类型，并集成来自多个受体的信息。

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

方法确定HCN1和TRIP8b之间蛋白 - 蛋白相互作用的小分子抑制剂

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

科研

生物化学

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

通过免疫共沉淀在核质馏分蛋白质相互作用的可视化和<em&gt;原位</em&gt;接近结扎分析

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

研究与Bio3D-web的蛋白质序列 - 结构 - 动力学关系

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

利用商用仪器和自由开源亮度分析软件对蛋白质的聚齐聚进行无标定的体外定量化

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

荧光显微镜竞争滴定法测定转录机-dna 结合感的高灵敏度

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

利用体外荧光共振能量转移研究毫秒时间尺度蛋白质配合物的动力学

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

单分子水平标记均匀性的全蛋白质定量

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

使用χCRAC以高时间分辨率监测体内蛋白质-RNA相互作用动力学

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

用于膜蛋白-蛋白质相互作用分析的原生细胞膜纳米粒子系统

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

树脂辅助捕获与同量异位串联质量标签标记相结合，用于蛋白质硫醇氧化的多重定量

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...