Name: quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation
Uploaded: 2019-08-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Forfatterne ønsker at anerkende Tessa Davis for vigtige bidrag til QMI assay udvikling, og nuværende og tidligere medlemmer af Smith og Schrum Labs for teknisk vejledning og intellektuelle input. Dette arbejde blev finansieret af NIMH Grants R01 MH113545 og r00 MH 102244.

1. analyse design
<ol><li>Forberedelse af kandidat antistof<ol>
<li>For hvert protein af interesse, Vælg 3 til 5 antistoffer til skærmen. Når det er muligt, skal du bruge monoklonale antistoffer, der genkender forskellige epitoper. Også omfatte et ikke-specifikt kontrol-antistof.</li>
		<li>For at fjerne Tris, udføre buffer udveksling ved at tilføje antistoffet til en 30 kDa spin filter, spinning ned til sin mindste volumen, tilføje 500 μL fosfat-bufferet saltvand (PBS), og gentage 3 gange. For at fjerne Carrie...

<ol>
	<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rodr&#237;guez-Jorge, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+T+cell+receptor+and+Toll-like+receptor+5+signaling+for+CD4.">Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4.</a> Science Signaling. 12 (577), (2019).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), (2018).</li><li>Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+signaling+by+modular+adaptor+proteins.">Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).</li><li>Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+G+protein+signaling.">The many faces of G protein signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).</li><li>Lohse, M. J., Hofmann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Aspects+of+Signaling+by+G-Protein-Coupled+Receptors.">Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors.</a> Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).</li><li>Eltschinger, S., Loewith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOR+Complexes+and+the+Maintenance+of+Cellular+Homeostasis.">TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis.</a> Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).</li><li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theoretical+framework+for+specificity+in+cell+signaling.">A theoretical framework for specificity in cell signaling.</a> Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+and+Specificity+in+Signal+Transduction+via+Physiologic+Protein+Interaction+Networks.">Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks.</a> Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).</li><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+essentials:+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks.">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).</li><li>Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+in+the+endoplasmic+reticulum+unfolded+protein+response.">Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).</li><li>Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Iron+Homeostasis:+New+Players+in+Metabolism,+Cell+Death,+and+Disease.">Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+matrix+network+analysis+of+protein+complexes+in+the+human+TCR+signalosome.">Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome.</a> Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).</li><li>Schrum, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Science's STKE. 2007 (389), (2007).</li><li>Brown, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+the+autisms+using+glutamate+synapse+protein+interaction+networks+from+cortical+and+hippocampal+tissue+of+seven+mouse+models.">Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models.</a> Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).</li><li>Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+induces+input-specific+rearrangements+in+a+targeted+synaptic+protein+interaction+network.">Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network.</a> Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+protein+complexes+isolated+from+primary+human+skin-resident+T+cells+can+be+analysed+by+Multiplex+IP-FCM.">Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM.</a> Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).</li><li>Neier, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+proximal+&#945;&#946;+TCR+signalosome+specifies+thymic+selection+outcome+through+a+quantitative+protein+interaction+network.">The early proximal &#945;&#946; TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network.</a> Science Immunology. 4 (32), (2019).</li><li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM:+immunoprecipitation+detected+by+flow+cytometry.">IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM+measures+physiologic+protein-protein+interactions+modulated+by+signal+transduction+and+small-molecule+drug+inhibition.">IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition.</a> PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).</li><li>Lautz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+changes+in+synaptic+protein+complex+composition+are+consistent+in+different+detergents+despite+differential+solubility.">Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility.</a> BioRXiv. , (2019).</li><li>Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WGCNA:+an+R+package+for+weighted+correlation+network+analysis.">WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis.</a> BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+bivalency+observed+among+TCR/CD3+complexes+isolated+from+primary+T+cells.">Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells.</a> Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).</li></ol>

QMI-analysen kræver betydelige investeringer i udvikling af antistof paneler, udstyr og reagenser, men når analysen er etableret, kan man indsamle højdimensionale data, der observerer protein interaktions netværk, når de reagerer på eksperimentelt kontrollerede Stimuli. Teknisk set kræver QMI omhyggelig pipettering og sporing af prøve-og antistof brønd placeringer. Omhyggeligt mærkning af analyse plader er nyttig, som gør en detaljeret skabelon af godt steder på papiret, som derefter gemmes til dataanalyse. B...

Dynamisk protein-protein interaktioner udgør de molekylære signalering kaskader og motile sædceller strukturer, der er det funktionelle grundlag for de fleste cellulære fysiologi1. Disse processer er ofte afbildet som lineære signalerings veje, der skifter mellem stabile tilstande baseret på enkelte indgange, men eksperimentelle og modellerings data viser tydeligt, at de fungerer som integrerede netværk2,3, 4. i tilfælde af G-proteiner har forskellige receptorer ofte evnen til at aktivere det samme G-protein, og en enkelt receptor kan også aktivere mere end én type g-protein5,6. For at det relativt lille antal G protein klasser specifikt moduere en bred vifte af cellulære funktioner såsom synaptisk transmission, hormon regulering, og celle migration, celler skal både integrere og differentiere disse signaler4 , 5. dokumentation har vist, at dette signal specificitet for G-proteiner såvel som andre primært er afledt på grundlag af finjusterede protein-protein interaktioner og deres tidsmæssige dynamik1,3, 4 , 5 , 6 , 7. da signalerings netværk består af dynamiske protein komplekser med flere indgange, udgange og feedback-sløjfer, har en enkelt forstyrrelse mulighed for at ændre den samlede homeostatiske balance i en celles fysiologi4 ,7. Det er nu almindeligt aftalt, at signalering skal undersøges fra et netværk perspektiv for bedre at forstå, hvordan integrationen af flere indgange styrer diskrete cellulære funktioner i sundhed og sygdom7,8, 9,10,11,12,13. I lyset af dette, kvantitative multiplex Immunoprecipitation (QMI) blev udviklet til at indsamle medium-gennemløb, kvantitative data om fold ændringer i dynamiske protein interaktion netværk.
QMI er en antistof baseret analyse, hvor celle lysat inkuberet med et panel af immunopræcipitation antistoffer, der er kovalent koblet til magnetiske perler, der indeholder forskellige forhold af fluorescerende farvestoffer. At have specifikke antistoffer koblet til forskellige magnetiske perle klasser giver mulighed for samtidige Co-immunoprecipitation af flere målproteiner fra det samme lysat. Efter immun præcipitation (IP) inkuberet magnetiske perler med et sekund, fluorophore-konjugeret Probe-antistof (eller biotinyleret antistof i forbindelse med fluorophore-konjugeret streptavidin). Co-associationer mellem de proteiner, der genkendes af hvert IP-antistof-Probe-antistofpar eller fiskene (proteiner i delte komplekser, der påvises ved eksponerede overflade epitoper), detekteres derefter ved flowcytometri og kan kvantitativt sammenlignes mellem forskellige prøvebetingelser14. Illustrationerne i figur 1 viser de trin, der er forbundet med at køre en QMI-analyse, herunder et diagram af magnetiske perler med immunopræcipiterede protein komplekser mærket med fluorescently konjugeret Probe antistoffer (figur 1C).
Følsomheden af QMI afhænger af den proteinkoncentration af lyset i forhold til antallet af magnetiske perler, der anvendes til immunoprecipitation, og opnåelse af en opløsning til at opdage 10% fold ændringer kræver kun en lille mængde af udgangsmateriale i forhold til andre Co-IP-metoder14,15. For eksempel svarer mængden af udgangsmateriale, der anvendes i QMI, til det, der kræves til en sandwich enzym-forbundet ImmunoSorbent assay (ELISA), men der påvises flere interaktioner i en enkelt QMI-analyse. QMI assays ved hjælp af 20 IPs og 20 sonde mål er blevet udført ved hjælp af 1-5 x 105 primære T-celler isoleret fra en 4 mm hudbiopsi, P2 synaptosomale præparater fra en 3 mm koronal del af mus præfrontal cortex, eller 3 x 106 kulturperler mus primære kortikale neuroner14,16,17. Denne følsomhed gør QMI nyttig til analyse af celler eller væv med begrænset tilgængelighed, såsom kliniske prøver.
QMI kan tilpasses til enhver tidligere defineret protein interaktion netværk (forudsat at antistoffer er tilgængelige), og til dato er blevet udviklet til at analysere T-celle antigen receptor (TCR) signalosome og en delmængde af proteiner på glutamaterge synapser i neuroner 17 , 18. i studier af T-celle receptor signalering blev QMI først brugt til at identificere stimulations inducerede ændringer i fiskene, og derefter til at skelne autoimmune patienter fra en kontrolgruppe, detektere endogene autoimmune signalering og til sidst at generere en hypotese, der involverer et ubalanceret sygdoms associeret under netværk af interaktioner14. For nylig blev det samme QMI-panel anvendt til at bestemme, at thymocyt-selektion bestemmes af kvantitative snarere end kvalitative forskelle i TCR-associeret protein signalering19. I neuroner blev QMI brugt til at beskrive input-specifik omorganisering af et protein interaktions netværk for forskellige typer indgangssignaler på en måde, der understøtter nye modeller af synaptisk plasticitet17. Desuden, denne synaptisk QMI panel blev brugt til at identificere forskelle i syv musemodeller af autisme, klynge modellerne i undergrupper baseret på deres fiskene biosigna turer, og præcist hypotese en fælles molekylære underskud, der tidligere var ukendt i en af modellerne16. En lignende fremgangsmåde kan bruges til at screene for andre undergrupper, der kan reagere på forskellige lægemidler behandlinger, eller tildele narkotika til specifikke Responsive undergrupper. QMI har potentielle anvendelser i diagnostik, patient sub-Typing, og narkotika udvikling, ud over grundlæggende videnskab.
For at samle et QMI-antistof panel beskrives de indledende antistof screenings-og udvælgelses protokoller i afsnit 1 nedenfor. Når der er identificeret antistof paneler, er der i punkt 2 beskrevet protokoller for konjugering af de valgte antistoffer mod magnetiske perler for IP og for biotinylering af de valgte Probe antistoffer. Protokollen for at køre QMI-analysen på celle-eller vævs lysater er beskrevet i punkt 3. Endelig, da et enkelt eksperiment kan generere ~ 5 x 105 individuelle datapoint, instruktioner og edb-koder til at hjælpe med databehandling, analyse og visualisering er angivet i afsnit 4. En oversigt over arbejdsprocessen, der er beskrevet i afsnit 2-4, er vist i figur 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well flat bottomed plates</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171025001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well PCR plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82006-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bioplex 200 System with HTF</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171000205</td>
			<td>modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bio-Plex Pro Wash Station</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">30034376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">BSA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">CML beads</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C37481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EDTA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">MagPlex Microspheres</td>
			<td style="width:121px;">Luminex</td>
			<td style="width:119px;">MC12xxx-01</td>
			<td>xxx is the 3 digit bead region</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Melon Gel IgG Spin Purification Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45206</td>
			<td>used for antibody purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:237px;">MES</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Microplate film, non-sterile</td>
			<td style="width:121px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2920-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Phosphotase inhibitor cocktail #2</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sandwich Prep Refrigerator</td>
			<td style="width:121px;">Norlake</td>
			<td>SMP 36 15</td>
			<td>for custom refrigeration of Bioplex 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Streptavidin-PE</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">405204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sulfo NHS</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Tris</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation

Dynamiske protein-protein interaktioner kontrol cellulære adfærd, fra motilitet til DNA-replikation til at signalere transduktion. Det er imidlertid teknisk vanskeligt at overvåge dynamiske interaktioner mellem flere proteiner i et protein interaktions netværk. Her præsenterer vi en protokol for kvantitativ multiplex Immunopræcipitation (QMI), som giver mulighed for kvantitativ vurdering af fold ændringer i protein interaktioner baseret på relative fluorescens målinger af proteiner i delte komplekser detekteret af eksponerede Overflade epitoper (fiskene). I QMI, protein komplekser fra celle lysater er immunoprecipitated på mikrosfærer, og derefter probed med et mærket antistof for et andet protein for at kvantificere den overflod af fiskene. Immunopræcipitation antistoffer er konjugeret til forskellige MagBead spektral regioner, som tillader et flow flowcytometer at differentiere flere parallelle immunopræcipitationer og samtidig kvantificere mængden af Probe antistof forbundet med hver. QMI kræver ikke genetisk mærkning og kan udføres ved hjælp af minimal biomaterialet sammenlignet med andre immunopræcipitation metoder. QMI kan tilpasses til enhver defineret gruppe af interagerende proteiner, og har hidtil været brugt til at karakterisere signalering netværk i T-celler og neuronal glutamat synapser. Resultater har ført til ny hypotese generation med potentielle diagnostiske og terapeutiske anvendelser. Denne protokol indeholder instruktioner til at udføre QMI, fra den oprindelige antistof panel udvælgelse til at køre assays og analysere data. Den indledende samling af en QMI-analyse omfatter screening antistoffer til at generere et panel, og empirisk bestemmelse af en passende lysis buffer. Det efterfølgende reagens præparat omfatter kovalent tilkobling af chromatinimmunpræcipitation antistoffer mod magbeads og biotinylerende Probe antistoffer, så de kan mærkes med en streptavidin-konjugeret fluorophore. For at køre analysen blandes lysat med magbeads natten over, og derefter opdeles perler og inkuberet med forskellige Probe antistoffer, og derefter en fluoroforet etiket og læses af flowcytometri. To statistiske tests udføres for at identificere fiskene, der afviger betydeligt mellem eksperimentelle forhold, og resultaterne visualiseres ved hjælp af Heatmaps eller node-Edge diagrammer.

Antistof screening Figur 2 B viser resultaterne af en skærm for proteinet Connexin36. De fleste IP_probe kombinationer giver ikke signal over IgG-kontrolelementer. IP med det monoklonale antistof 1E5 og sonde med enten 1E5 eller polyklonal antistof 6200 producerer et højre Skift i perle fordelingen sammenlignet med IgG-kontroller. Her blev IP 1E5 og Probe 6200poly udvalgt til at undgå at bruge det samme antistof som IP og sonde, både for at reducere s...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantitativ multiplex Immunoprecipitation (QMI) bruger flow cytometri til følsom påvisning af forskelle i den overflod af målrettede protein-protein interaktioner mellem to prøver. QMI kan udføres ved hjælp af en lille mængde biomateriale, kræver ikke genetisk manipulerede Tags, og kan tilpasses til alle tidligere definerede protein interaktion netværk.

Kvantificering af protein interaktions netværk dynamik ved hjælp af Multiplexed Co-Immunopræcipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Kvantitativ multiplexed co-immunoprecipitation, eller QMI, giver brugerne mulighed for samtidig at måle hundredvis af binære interaktioner i et foruddefineret protein interaktion netværk. Ved at udføre flere co-IPs samtidig i samme lysat, bioinformatik teknikker kan derefter undersøge, hvordan grupper af co-foreninger ændre sig på en koordineret måde. Analysen er tidskrævende at udvikle, men når QMI panelet er i hånd netværk skala data kan indsamles om signal transduktionssystemer i en relativt enkelt natten assay.QMI kræver nøjagtig pipettering af forskellige prøver og reagenser i 96 brøndplader. Omhyggelige noter bør tages, når du konfigurerer og kører hver analyse for at undgå fejl. Ved prøvepræparat og immunudgivelse påbegyndes prøven i et egnet vaskemiddel med protease- og fosfatasehæmmere i en 15 minutters inkubation på is.Ved inkubationens afslutning drejes prøven ned for at fjerne membraner og snavs og udføre en BCA-analyse på supernatanten for at bestemme proteinkoncentrationen i henhold til standardprotokollerne. Efter normalisering af proteinkoncentrationerne forberedes en magnetisk perlemasterblanding, der indeholder ca. 250 magnetiske perler af hver klasse pr. brønd. Brug magnetisk adskillelse til at vaske den magnetiske perleblanding to gange i Fly P-buffer, før perlerne resuspenderes i 20 mikroliter Fly P-buffer pr. prøve.Efter en grundig pipettering, aliquot 20 mikroliter af perler i en iskold mikrocentrifuge rør pr prøve og tilsæt lige store mængder lysate med normaliserede protein koncentrationer til hvert rør for immunoprecipitation. Derefter opdeles hver lysatprøve i et rør for hver plade, der køres, og immunoprecipitat prøverne på en rotator ved fire grader Celsius natten beskyttet mod lys. Den næste morgen bruge en magnetisk perle rack til at fjerne lysatet fra det første sæt af rør og vaske perlerne to gange i 500 mikroliter af iskold Flyve P buffer per vask.Efter beregning af resuspension volumen, resuspendrer immunoprecipitates i den beregnede mængde iskold Fly P buffer. Grundigt resuspend de magnetiske perler ved blid pipettering og distribuere 25 mikroliter af perler pr godt over en flad bund 96 godt plade på is. I en anden 96 brøndplade fortyndes af attinilerede sondeantistoffer til en to gange arbejdskoncentration.Brug en multikanalpipette til at fordele 25 mikroliter af hver sondeantistoffortynding i de relevante brønde i den magnetiske perle, der indeholder analyseplade, og ryst med høj hastighed på en vandret pladeryser for at blande og opslænke de magnetiske perler. Efter blanding, reducere hastigheden for en time inkubation ved fire grader Celsius beskyttet mod lys. Ved slutningen af inkubationen vaskes pladen tre gange med frisk Fly P-buffer pr. vask på en magnetisk pladevasker ved fire grader Celsius.Efter den sidste vask, resuspend perlerne i 50 mikroliter af streptavidin PE fortyndet en til 200 i Fly P buffer. Ryst blandingen og resuspend perlerne før inkubering af pladen ved fire grader Celsius i 30 minutter beskyttet mod lys. Ved slutningen af inkubationen vaskes pladen tre gange med Fly P-buffer på en magnetisk pladevasker ved fire grader Celsius og resuspenderede perlerne i 125 mikroliter Fly P-buffer.Ryst pladen i et minut ved 900 omdrejninger for grundigt at opslænke perlerne og lægge pladen i et refridgerated flow cytometer. I flow cytometer software, skal du vælge High RP1 Target indstilling, en stop tilstand på 1, 000 perler pr region, og en prøve volumen på 80 mikroliter. Pause løbet halvvejs igennem og resuspenderede perlerne for at forhindre afregning.Eksporter datafilerne i XML-formatet i slutningen af kørslen. Hvis du vil udføre ANC-analyse, skal du udfylde ANC-inputfilen, så den afspejler detaljerne i det eksperimentelle design og kører programmet, som vil skrive en CSV-fil ind i den aktive mappe. Filen ender i hits.csv vil rapportere de protein co-associationer, der er væsentligt forskellige på et falsk positivt niveau på 0,05 mellem kontrol og eksperimentelle betingelser i mindst tre ud af fire eksperimentelle replikater. Hvis du vil have vægtet korrelationsnetværksanalyse, skal du indsætte kolonnetitlerne for datafiloutputtet ved matlab, der ender i mfi. csv i den første kolonne i et nyt regneark og tilføje kolonnerne Eksperiment for eksperimentnummer og behandling til eksperimentel behandling og andre variabler, der skal analyseres.Gem denne fil som træk. csv og åbne R Studio. Indstil arbejdsmappen til en mappe, der indeholder mfi'en.csv og træk. csv-filer, fremhæv afsnit af kode, og tryk på Kommando Enter for at køre R-kommandoerne som angivet i den kommenterede kommandofil. De vægtede korrelationsnetværksanalysemoduler, der er væsentligt korreleret med hvert eksperimentelt træk, vil blive udoutputeret som en grafisk fil, og sammenhængen mellem hver interaktion med hvert modul vil blive outputtet som en CSV-fil.For hver interaktion i ANC-outputfilen skal du identificere, om denne interaktion også er væsentlig af CNA, og oprette en ny kolonne, der angiver, om hvert ANC-hit også er et CNA-hit. Konverter værdierne for at logge to gange ændring og beregne den gennemsnitlige værdi for alle ANC union CNA hits. Endelig lave et nyt regneark med hver ANC union CNA hit opført af sin immunoprecipitation mål i en kolonne, dens sonde mål i den anden kolonne, og dens fold ændre værdi i tredje kolonne.Importer denne fil til Cytoscape som et netværk for at oprette et nodekantdiagram. Højtillid protein interaktioner identificeret ved de to uafhængige statistiske tilgange visualiseres som node kant diagrammer ved hjælp af open source-software, Cytoscape, eller som heatmaps ved hjælp af R-kode og analyse instruktioner, der indgår i det supplerende materiale. I hele protokollen skal brugerne passe på at pipette nøjagtigt, at føre omhyggelige optegnelser og holde prøverne kolde hele tiden.Vi har brugt QMI til at forstå, hvordan signaltransduktionsveje skelner mellem forskellige inputtyper og integrerer oplysninger fra flere receptorer.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisering af protein-protein interaktion i nukleare og Cytoplasmiske Brøker af Co-immunopræcipitation og<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligeringsassayet

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Undersøgelse Proteinsekvens-struktur-dynamik Forhold med Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantificering af Protein Homo-oligomerisering ved hjælp af kommercielle instrumentering og gratis, Open Source lysstyrke analyse Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Overvågning af protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo ved høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membrane Nanopartikler System for Membran Protein-Protein Interaktion Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Harpiksassisteret indfangning kombineret med isobarisk tandemmassemærkemærkning til multiplekset kvantificering af protein thioloxidation

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...