Name: quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation
Uploaded: 2019-08-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

De auteurs willen tessa Davis erkennen voor belangrijke bijdragen aan de ontwikkeling van QMI Assay, en aan huidige en voormalige leden van de laboratoria Smith en Schrum voor technische begeleiding en intellectuele input. Dit werk werd gefinancierd door NIMH subsidies R01 MH113545 en R00 MH 102244.

1. ontwerp van de assay
<ol><li>Voorbereiding van kandidaat-antilichamen<ol>
<li>Voor elk eiwit van belang, kies 3 tot en met 5 antilichamen op het scherm. Gebruik indien mogelijk monoklonale antilichamen die verschillende epitopes herkennen. Ook een niet-specifieke controle antilichamen bevatten.</li>
		<li>Om tris te verwijderen, voert u buffer uitwisseling uit door het antilichaam toe te voegen aan een 30 kDa-spin filter, te draaien tot het minimum volume, 500 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe te voegen ...

<ol>
	<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rodr&#237;guez-Jorge, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+T+cell+receptor+and+Toll-like+receptor+5+signaling+for+CD4.">Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4.</a> Science Signaling. 12 (577), (2019).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), (2018).</li><li>Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+signaling+by+modular+adaptor+proteins.">Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).</li><li>Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+G+protein+signaling.">The many faces of G protein signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).</li><li>Lohse, M. J., Hofmann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Aspects+of+Signaling+by+G-Protein-Coupled+Receptors.">Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors.</a> Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).</li><li>Eltschinger, S., Loewith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOR+Complexes+and+the+Maintenance+of+Cellular+Homeostasis.">TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis.</a> Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).</li><li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theoretical+framework+for+specificity+in+cell+signaling.">A theoretical framework for specificity in cell signaling.</a> Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+and+Specificity+in+Signal+Transduction+via+Physiologic+Protein+Interaction+Networks.">Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks.</a> Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).</li><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+essentials:+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks.">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).</li><li>Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+in+the+endoplasmic+reticulum+unfolded+protein+response.">Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).</li><li>Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Iron+Homeostasis:+New+Players+in+Metabolism,+Cell+Death,+and+Disease.">Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+matrix+network+analysis+of+protein+complexes+in+the+human+TCR+signalosome.">Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome.</a> Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).</li><li>Schrum, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Science's STKE. 2007 (389), (2007).</li><li>Brown, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+the+autisms+using+glutamate+synapse+protein+interaction+networks+from+cortical+and+hippocampal+tissue+of+seven+mouse+models.">Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models.</a> Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).</li><li>Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+induces+input-specific+rearrangements+in+a+targeted+synaptic+protein+interaction+network.">Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network.</a> Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+protein+complexes+isolated+from+primary+human+skin-resident+T+cells+can+be+analysed+by+Multiplex+IP-FCM.">Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM.</a> Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).</li><li>Neier, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+proximal+&#945;&#946;+TCR+signalosome+specifies+thymic+selection+outcome+through+a+quantitative+protein+interaction+network.">The early proximal &#945;&#946; TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network.</a> Science Immunology. 4 (32), (2019).</li><li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM:+immunoprecipitation+detected+by+flow+cytometry.">IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM+measures+physiologic+protein-protein+interactions+modulated+by+signal+transduction+and+small-molecule+drug+inhibition.">IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition.</a> PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).</li><li>Lautz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+changes+in+synaptic+protein+complex+composition+are+consistent+in+different+detergents+despite+differential+solubility.">Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility.</a> BioRXiv. , (2019).</li><li>Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WGCNA:+an+R+package+for+weighted+correlation+network+analysis.">WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis.</a> BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+bivalency+observed+among+TCR/CD3+complexes+isolated+from+primary+T+cells.">Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells.</a> Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).</li></ol>

De QMI-test vereist substantiële investeringen in de ontwikkeling, apparatuur en reagentia van het antilichaam paneel, maar zodra de test is vastgesteld, kan men hoogdimensionale gegevens verzamelen die de proteïne-interactie netwerken observeren terwijl ze reageren op experimentaal gecontroleerde stimuli. Technisch vereist QMI zorgvuldige Pipetteer-en traceer controle van monster-en antilichaam goed locaties. Zorgvuldig labelen van de test platen is nuttig, zoals het maken van een gedetailleerd sjabloon van goed locat...

Dynamische eiwit-eiwit interacties vormen de moleculaire signalering Cascades en beweeglijke structuren die de functionele basis van de meeste cellulaire fysiologie zijn1. Deze processen worden vaak afgebeeld als lineaire signalerings trajecten die schakelen tussen stabiele toestanden op basis van enkelvoudige ingangen, maar experimentele en modellerings gegevens tonen duidelijk aan dat ze functioneren als geïntegreerde netwerken2,3, 4. in het geval van G-eiwitten hebben verschillende receptoren vaak de mogelijkheid om hetzelfde g-eiwit te activeren, en een enkele receptor kan ook meer dan één type g-eiwit5,6activeren. Om het relatief kleine aantal G eiwit klassen specifiek te moduleren een breed scala van cellulaire functies zoals synaptische transmissie, hormoon regulatie, en Celmigratie, cellen moeten beide integreren en differentiëren deze signalen4 , 5. uit bewijsmateriaal is gebleken dat de specificiteit van dit signaal, zowel voor G-eiwitten als voor anderen, primair wordt afgeleid op basis van fijn afgestemde eiwit-eiwit interacties en hun temporele dynamiek1,3, 4 , 5 , 6 , 7. omdat signalerings netwerken bestaan uit dynamische eiwitcomplexen met meerdere ingangen, outputs en feedbacklussen, heeft één enkele perturbatie de mogelijkheid om het algemene homeostatische evenwicht van de Fysiologie van een cel te veranderen4 ,7. Het is nu algemeen overeengekomen dat signalering vanuit een netwerk perspectief moet worden onderzocht om beter te begrijpen hoe de integratie van meerdere ingangen discrete cellulaire functies regelt in gezondheid en ziekte7,8, 9,10,11,12,13. In het licht hiervan werd kwantitatieve multiplex Immunoprecipitation (QMI) ontwikkeld om middelmatige doorvoer te verzamelen, kwantitatieve gegevens over vouw veranderingen in dynamische proteïne-interactie netwerken.
QMI is een op antilichamen gebaseerde test waarbij cellysaat wordt geïnineerd met een panel van immunoprecipitatie-antilichamen die covalent zijn gekoppeld aan magnetische kralen met duidelijke verhoudingen van fluorescerende kleurstoffen. Het hebben van specifieke antilichamen gekoppeld aan verschillende magnetische kraal klassen zorgt voor gelijktijdige co-immunoprecipitatie van meerdere doel eiwitten uit hetzelfde lysaat. Na immunoprecipitatie (IP) worden magnetische kralen geïnfiltreerd met een tweede, fluorophore-geconjugeerd sonde antilichaam (of biotinyleerd antilichaam in combinatie met fluorophore-geconjugeerde streptavidin). Co-associaties tussen de eiwitten die worden herkend door elk IP-antilichaam-sonde antilichaam paar, of vissen (eiwitten in gedeelde complexen gedetecteerd door blootgestelde oppervlak Epitopes), worden vervolgens gedetecteerd door Flowcytometrie en kunnen kwantitatief worden vergeleken tussen verschillende voorwaarden14. Illustraties in Figuur 1 tonen de stappen die betrokken zijn bij het uitvoeren van een QMI-test, waaronder een diagram van magnetische parels met immunoprecipitated proteïne complexen gelabeld door fluorescently geconjugeerde sonde-antilichamen (Figuur 1C).
De gevoeligheid van QMI is afhankelijk van de eiwitconcentratie van het lysaat ten opzichte van het aantal magnetische kralen dat wordt gebruikt voor immunoprecipitatie, en het bereiken van een resolutie voor het detecteren van 10% vouw veranderingen vereist slechts een kleine hoeveelheid startmateriaal in vergelijking met andere Co-IP-methoden14,15. De hoeveelheid uitgangsmateriaal die wordt gebruikt in QMI is bijvoorbeeld vergelijkbaar met die welke vereist is voor een sandwich-enzym-linked ImmunoSorbent assay (ELISA), maar er worden meerdere interacties gedetecteerd in één QMI-test. QMI assays met behulp van 20 IPs en 20 sonde targets zijn uitgevoerd met behulp van 1-5 x 105 primaire T-cellen geïsoleerd uit een 4 mm huid biopsie, P2 synaptosomale preparaten uit een 3 mm coronale sectie van muis prefrontale cortex, of 3 x 106 gekweekte muis primaire corticale neuronen14,16,17. Deze gevoeligheid maakt QMI nuttig voor analyse van cellen of weefsel met beperkte beschikbaarheid, zoals klinische monsters.
QMI kan worden aangepast voor elk eerder gedefinieerd proteïne-interactie netwerk (op voorwaarde dat antilichamen beschikbaar zijn), en tot op heden is ontwikkeld om de T Cell antigen receptor (TCR) signalosome te analyseren en een subset van eiwitten bij glutamaterge synapsen in neuronen 17 , 18. in studies van T Cell receptor signalering werd QMI voor het eerst gebruikt om stimulatie veroorzaakte veranderingen in vissen te identificeren, en vervolgens om auto-immuunpatiënten van een controlegroep te onderscheiden, endogene auto-immuunsigna lering te detecteren en tot slot een hypothese met betrekking tot een onevenwichtige ziekte-geassocieerde subnetwerk van interacties14. Meer recentelijk werd hetzelfde QMI-panel gebruikt om te bepalen dat de selectie van thymocyte wordt bepaald door kwantitatieve, in plaats van kwalitatieve verschillen in TCR-geassocieerde proteïne-signalering19. In neuronen werd QMI gebruikt om input-specifieke herschikking van een proteïne-interactie netwerk te beschrijven voor verschillende typen ingangssignalen op een manier die nieuwe opkomende modellen van synaptische plasticiteit17ondersteunt. Bovendien, dit synaptische QMI panel werd gebruikt om de verschillen in zeven Muismodellen van autisme identificeren, cluster de modellen in subgroepen op basis van hun vissen biosignatures, en nauwkeurig veronderstellen een gedeeld moleculair tekort dat voorheen niet werd herkend in een van de modellen16. Een soortgelijke benadering kan worden gebruikt om te schermen voor andere subgroepen die kunnen reageren op verschillende medicamenteuze behandelingen, of om drugs toe te wijzen aan specifieke responsieve subgroepen. QMI heeft potentiële toepassingen in diagnostiek, het ondertypen van patiënten en de ontwikkeling van geneesmiddelen, naast de basiswetenschap.
Om een QMI-antilichaam paneel samen te stellen, worden de eerste antilichamen screening en selectie protocollen beschreven in sectie 1 hieronder. Wanneer antilichamen worden geïdentificeerd, worden de protocollen voor conjugatie van de geselecteerde antilichamen tegen magnetische kralen voor IP en voor biotinylatie van de geselecteerde antilichamen van de sonde beschreven in rubriek 2. Het protocol voor het uitvoeren van de QMI-test op cel-of weefsel lysaten wordt beschreven in rubriek 3. Ten slotte, omdat een enkel experiment kan genereren ~ 5 x 105 individuele data Points, instructies en computercodes om te helpen bij de verwerking van gegevens, analyse en visualisatie worden gegeven in sectie 4. Een overzicht van de werkstroom die wordt beschreven in secties 2-4 wordt weergegeven in Figuur 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well flat bottomed plates</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171025001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well PCR plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82006-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bioplex 200 System with HTF</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171000205</td>
			<td>modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bio-Plex Pro Wash Station</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">30034376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">BSA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">CML beads</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C37481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EDTA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">MagPlex Microspheres</td>
			<td style="width:121px;">Luminex</td>
			<td style="width:119px;">MC12xxx-01</td>
			<td>xxx is the 3 digit bead region</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Melon Gel IgG Spin Purification Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45206</td>
			<td>used for antibody purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:237px;">MES</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Microplate film, non-sterile</td>
			<td style="width:121px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2920-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Phosphotase inhibitor cocktail #2</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sandwich Prep Refrigerator</td>
			<td style="width:121px;">Norlake</td>
			<td>SMP 36 15</td>
			<td>for custom refrigeration of Bioplex 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Streptavidin-PE</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">405204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sulfo NHS</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Tris</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation

Dynamische eiwit-eiwit interacties beheersen cellulair gedrag, van beweeglijkheid tot DNA-replicatie tot signaaltransductie. Het monitoren van dynamische interacties tussen meerdere eiwitten in een proteïne-interactie netwerk is echter technisch moeilijk. Hier presenteren we een protocol voor kwantitatieve multiplex-immunoprecipitatie (QMI), dat kwantitatieve beoordeling van vouw veranderingen in eiwit interacties mogelijk maakt op basis van relatieve fluorescentie metingen van eiwitten in gedeelde complexen gedetecteerd door blootgestelde Oppervlakte epitopen (vissen). In QMI worden eiwitcomplexen van celllysates op microsferen immunoprecipitated en vervolgens gepropageerd met een gelabeld antilichaam voor een ander eiwit om de overvloed aan vissen te kwantificeren. Immunoprecipitation-antilichamen worden geconjugeerd aan verschillende MagBead-spectrale gebieden, waardoor een flow-cytometer meerdere parallelle immunoprecipitaties kan differentiëren en tegelijkertijd de hoeveelheid sonde-antilichamen die aan elk is gekoppeld, kwantificeren. QMI vereist geen genetische tagging en kan worden uitgevoerd met behulp van minimale biomateriaal in vergelijking met andere immunoprecipitatie-methoden. QMI kan worden aangepast voor elke gedefinieerde groep van de interactie eiwitten, en is tot nu toe gebruikt voor het karakteriseren van signalering netwerken in T-cellen en neuronale glutamaat synapsen. Resultaten hebben geleid tot nieuwe hypothese generatie met potentiële diagnostische en therapeutische toepassingen. Dit protocol bevat instructies voor het uitvoeren van QMI, vanaf de initiële selectie van het antilichaam-panel tot en met het uitvoeren van assays en het analyseren van gegevens. De initiële assemblage van een QMI-test omvat het screenen van antilichamen voor het genereren van een panel en het empirisch bepalen van een geschikte lysisbuffer. Het daaropvolgende reagens preparaat omvat covalent koppelen van immunoprecipitatie antilichamen tegen MagBeads, en biotinylating probe antilichamen, zodat ze kunnen worden gelabeld door een streptavidine-geconjugeerd fluorophore. Om de test uit te voeren, wordt lysaat 's nachts gemengd met magbeads, en vervolgens worden kralen verdeeld en geïntrigeerd met verschillende sonde-antilichamen, en vervolgens een de-label, en gelezen door flow cytometrie. Er worden twee statistische tests uitgevoerd om vissen te identificeren die significant verschillen tussen de experimentele omstandigheden, en de resultaten worden gevisualiseerd met behulp van Heatmaps of node-Edge diagrammen.

Screening van antilichamen Figuur 2 B toont de resultaten van een scherm voor de proteïne Connexin36. De meeste IP_probe-combinaties produceren geen signaal over IgG-besturingselementen. IP met het monoklonaal antilichaam 1E5 en sonde met 1E5 of het polyklonale antilichaam 6200 produceert een rechts verschuiving in de kraal verdeling in vergelijking met IgG-besturingselementen. Hier werden IP 1E5 en Probe 6200poly geselecteerd om te voorkomen dat hetzelf...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kwantitatieve multiplex Immunoprecipitation (QMI) gebruikt Flowcytometrie voor gevoelige detectie van verschillen in de overvloed van gerichte eiwit-eiwit interacties tussen twee monsters. QMI kan worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid biomateriaal, vereist geen genetisch gemanipuleerde Tags en kan worden aangepast voor elk eerder gedefinieerd proteïne-interactie netwerk.

Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Kwantitatieve multiplexed co-immunoprecipitatie, of QMI, stelt gebruikers in staat om tegelijkertijd honderden binaire interacties te meten in een vooraf gedefinieerd eiwitinteractienetwerk. Door meerdere co-IP's tegelijk in hetzelfde lysaat uit te voeren, kunnen bioinformaticatechnieken vervolgens op gecoördineerde wijze onderzoeken hoe groepen co-associaties veranderen. De test is tijdrovend om te ontwikkelen, maar zodra het QMI-paneel in de hand netwerk schaal gegevens kunnen worden verzameld over signaal transductie systemen in een relatief eenvoudig 's nachts test.QMI vereist de nauwkeurige pipetting van verschillende monsters en reagentia in 96 putplaten. Bij het instellen en uitvoeren van elke test moeten zorgvuldige opmerkingen worden gemaakt om fouten te voorkomen. Voor monsterbereiding en immunoprecipitatie begint u met het lyseren van het monster in een geschikt wasmiddel met protease- en fosforremmers voor een incubatie van 15 minuten op ijs.Draai aan het einde van de incubatie het monster naar beneden om de membranen en het puin te verwijderen en voer een BCA-test uit op de supernatant om de eiwitconcentratie volgens standaardprotocollen te bepalen. Na het normaliseren van de eiwitconcentraties, bereid een magnetische kraal master mix die ongeveer 250 magnetische kralen van elke klasse per put bevat. Gebruik magnetische scheiding om het magnetische kraalmengsel twee keer te wassen in fly p-buffer voordat u de kralen opnieuw in 20 microliters van fly p-buffer per monster insus.Na een grondige pipetting, aliquot 20 microliter van kralen in een ijskoude microcentrifuge buis per monster en voeg gelijke volumes van lysaat met genormaliseerde eiwitconcentraties aan elke buis voor immunoprecipitatie. Verdeel vervolgens elk lysaatmonster in één buis voor elke plaat die wordt uitgevoerd en immunoprecipitaat de monsters op een rotator bij vier graden Celsius 's nachts beschermd tegen licht. De volgende ochtend gebruik maken van een magnetische kraal rek om het lysaat te verwijderen uit de eerste set van buizen en was de kralen twee keer in 500 microliters van ijskoude Fly P buffer per wasbeurt.Na het berekenen van het resuspensievolume worden de immunoprecipitaten opnieuw opgetrokken in het berekende volume van de ijskoude Fly P-buffer. Grondig resuspend de magnetische kralen door zachte pipetting en distribueren 25 microliter kralen per goed over een platte bodem 96 put plaat op ijs. In een andere 96 putplaat, verdunnen door attiniated sonde antilichamen aan een twee keer werkende concentratie.Gebruik een multichannel pipet om 25 microliter van elke sonde antilichaamverdunning te verdelen in de juiste putten van de magnetische kraal met testplaat en schud met hoge snelheid op een horizontale plaatshaker om de magnetische kralen te mengen en opnieuw te verbouwen. Na het mengen, de snelheid te verlagen voor een uur incubatie op vier graden Celsius beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie was je de plaat drie keer met verse Fly P buffer per wasbeurt op een magnetische plaatwasser op vier graden Celsius.Na de laatste wasbeurt, resuspend de kralen in 50 microliters van streptavidin PE verdund een tot 200 in Fly P buffer. Schud de mix en resuspend de kralen voor het uitbroeden van de plaat op vier graden Celsius gedurende 30 minuten beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, was de plaat drie keer met Fly P buffer op een magnetische plaat wasmachine op vier graden Celsius en resuspend de kralen in 125 microliters van Fly P buffer.Schud de plaat gedurende een minuut bij 900 rotaties om de kralen grondig te resuspend en laad de plaat in een refridgerated flow cytometer. Selecteer in de flow cytometersoftware de instelling High RP1 Target, een stopvoorwaarde van 1.000 kralen per regio en een monstervolume van 80 microliters. Pauzeer de run halverwege en resuspend de kralen om te voorkomen dat de afwikkeling.Exporteer aan het einde van de run de gegevensbestanden in de XML-indeling. Als u ANC-analyses wilt uitvoeren, vult u het ANC-invoerbestand in om de details van het experimentele ontwerp weer te geven en voert u het programma uit, waarmee een CSV-bestand in de active directory wordt geschreven. Het bestand eindigt in hits.csv zal de eiwitco-associaties rapporteren die aanzienlijk verschillen op een vals-positief niveau van 0,05 tussen de controle en experimentele omstandigheden in ten minste drie van de vier experimentele replicaties. Plak de kolomtitels van de uitvoer van het gegevensbestand door Matlab die eindigt in mfi voor gewogen correlatienetwerkanalyse. csv in de eerste kolom van een nieuwe spreadsheet en voeg de kolommen Experiment voor experimentnummer en Behandeling voor experimentele behandeling en andere variabelen toe die moeten worden geanalyseerd.Sla dit bestand op als eigenschappen. csv en open R Studio. Stel de werkmap in op een map met de mfi.csv en eigenschappen. csv-bestanden, markeringssecties van code en druk op Opdracht enter om de R-opdrachten uit te voeren zoals aangegeven in het opdrachtbestand met commentaar. De gewogen correlatie netwerk analyse modules aanzienlijk gecorreleerd met elke experimentele eigenschap zal worden uitgevoerd als een grafisch bestand en de correlatie van elke interactie met elke module zal worden uitgevoerd als een CSV-bestand.Voor elke interactie in het ANC-uitvoerbestand moet u bepalen of die interactie ook significant is voor CNA en een nieuwe kolom maken die aangeeft of elke ANC-hit ook een CNA-hit is. Converteer de waarden om tweevoudige wijziging te registreren en bereken de gemiddelde waarde voor alle ANC union CNA-treffers. Tot slot, maak een nieuwe spreadsheet met elke ANC unie CNA hit vermeld door de immunoprecipitatie doel in een kolom, de sonde doel in de tweede kolom, en de vouw verandering waarde in de derde kolom.Importeer dit bestand in Cytoscape als een netwerk om een knooppuntranddiagram te maken. Eiwitinteracties met een hoog vertrouwen die door de twee onafhankelijke statistische benaderingen worden geïdentificeerd, worden gevisualiseerd als node-randdiagrammen met behulp van de open source-software Cytoscape of als heatmaps met behulp van de R-code en analyse-instructies die in het aanvullende materiaal zijn opgenomen. Gedurende het protocol, gebruikers moeten ervoor zorgen om pipet nauwkeurig, om nauwgezette records te houden, en om de monsters koud te houden te allen tijde.We hebben QMI gebruikt om te begrijpen hoe signaaltransductietrajecten onderscheid maken tussen verschillende invoertypen en informatie uit meerdere receptoren integreren.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door Co-immunoprecipitatie en<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Onderzoek naar eiwitsequentie-structuur-dynamiek Relaties met Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membrane Nanodeeltjes Systeem voor Membraan Eiwit-Eiwit Interactie Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Harsondersteunde vangst in combinatie met isobare tandemmassalabellabeling voor multiplexed kwantificering van eiwitthodoxe oxidatie

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...