Name: quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation
Uploaded: 2019-08-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

המחברים רוצים להכיר את טסה דיוויס לתרומות חשובות לפיתוח שיטת QMI, וחברים נוכחיים ולשעבר של מעבדות סמית ' ו-Schrum להדרכה טכנית ולקלט אינטלקטואלי. עבודה זו ממומנת על ידי NIMH מענקים R01 MH113545 ו R00 MH 102244.

1. עיצוב שיטת התכנון
<ol><li>הכנת נוגדן המועמד<ol>
<li>עבור כל חלבון של עניין, לבחור 3 כדי 5 נוגדנים למסך. במידת האפשר, השתמשו בנוגדנים חד-שבטיים המכירים באפיסקופים שונים. כלול גם נוגדן אחד שאינו ספציפי לפקד.</li>
		<li>כדי להסיר טריס, לבצע חילופי מאגר על ידי הוספת נוגדן למסנן 30 kDa ספין, מסתחרר למטה לנפח ה...

<ol>
	<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rodr&#237;guez-Jorge, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+T+cell+receptor+and+Toll-like+receptor+5+signaling+for+CD4.">Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4.</a> Science Signaling. 12 (577), (2019).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), (2018).</li><li>Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+signaling+by+modular+adaptor+proteins.">Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).</li><li>Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+G+protein+signaling.">The many faces of G protein signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).</li><li>Lohse, M. J., Hofmann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Aspects+of+Signaling+by+G-Protein-Coupled+Receptors.">Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors.</a> Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).</li><li>Eltschinger, S., Loewith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOR+Complexes+and+the+Maintenance+of+Cellular+Homeostasis.">TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis.</a> Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).</li><li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theoretical+framework+for+specificity+in+cell+signaling.">A theoretical framework for specificity in cell signaling.</a> Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+and+Specificity+in+Signal+Transduction+via+Physiologic+Protein+Interaction+Networks.">Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks.</a> Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).</li><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+essentials:+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks.">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).</li><li>Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+in+the+endoplasmic+reticulum+unfolded+protein+response.">Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).</li><li>Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Iron+Homeostasis:+New+Players+in+Metabolism,+Cell+Death,+and+Disease.">Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+matrix+network+analysis+of+protein+complexes+in+the+human+TCR+signalosome.">Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome.</a> Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).</li><li>Schrum, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Science's STKE. 2007 (389), (2007).</li><li>Brown, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+the+autisms+using+glutamate+synapse+protein+interaction+networks+from+cortical+and+hippocampal+tissue+of+seven+mouse+models.">Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models.</a> Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).</li><li>Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+induces+input-specific+rearrangements+in+a+targeted+synaptic+protein+interaction+network.">Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network.</a> Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+protein+complexes+isolated+from+primary+human+skin-resident+T+cells+can+be+analysed+by+Multiplex+IP-FCM.">Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM.</a> Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).</li><li>Neier, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+proximal+&#945;&#946;+TCR+signalosome+specifies+thymic+selection+outcome+through+a+quantitative+protein+interaction+network.">The early proximal &#945;&#946; TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network.</a> Science Immunology. 4 (32), (2019).</li><li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM:+immunoprecipitation+detected+by+flow+cytometry.">IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM+measures+physiologic+protein-protein+interactions+modulated+by+signal+transduction+and+small-molecule+drug+inhibition.">IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition.</a> PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).</li><li>Lautz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+changes+in+synaptic+protein+complex+composition+are+consistent+in+different+detergents+despite+differential+solubility.">Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility.</a> BioRXiv. , (2019).</li><li>Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WGCNA:+an+R+package+for+weighted+correlation+network+analysis.">WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis.</a> BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+bivalency+observed+among+TCR/CD3+complexes+isolated+from+primary+T+cells.">Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells.</a> Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).</li></ol>

השקאת QMI דורש השקעה ניכרת בפיתוח פאנל הנוגדן, ציוד ריאגנטים, אבל ברגע שהנתון נקבע, ניתן לאסוף נתונים בעלי ממדים גבוהים התבוננות ברשתות אינטראקציה חלבון כפי שהם מגיבים ניסויים בשליטת גירויים. מבחינה טכנית, QMI דורש ליטוף זהיר ומעקב של דגימת ומיקומים היטב נוגדן. תיוג בזהירות של לוחיות הנתונים...

אינטראקציות חלבונים בחלבון חלבון מהוות מבני איתות מולקולריים ומבנים מורצפת המהווים את הבסיס התפקודי של רוב הפיזיולוגיה התאית1. תהליכים אלה מתוארים לעתים קרובות כמסלולים איתות ליניארי העוברים בין מצבים יציבים המבוססים על תשומות יחיד, אבל נתונים ניסיוניים ומידול מראים בבירור שהם מתפקדים כרשתות משולבות2,3, 4. במקרה של G חלבונים, קולטנים שונים לעתים קרובות יש את היכולת להפעיל את אותו חלבון G, ו קולטן יחיד יכול גם להפעיל יותר מסוג אחד של g חלבון5,6. על מנת מספר קטן יחסית של שיעורי חלבון G לווסת במיוחד מגוון רחב של פונקציות סלולריות כגון שידור סינפטית, רגולציה הורמונלי, ואת הגירה התא, תאים חייבים להשתלב ולהבחין אותות אלה4 , 5. ראיות הראו כי האות הזה ספציפיות, עבור החלבונים של G, כמו גם אחרים, נגזר בעיקר על בסיס של אינטראקציות חלבון חלבונים מכוונים דק ודינמיקה הטמפורלית שלהם1,3, ד , מיכל 5 , מיכל בן 6 , 7. מכיוון רשתות איתות מורכבות של מכלולי חלבון דינאמי עם מספר תשומות, תפוקות, ולולאות משוב, הזדמנות בודדת יש את ההזדמנות לשנות את המאזן הכולל הומסטטי של הפיזיולוגיה של התא4 ,7. כעת מוסכם באופן נרחב כי האיתות צריך להיבדק מנקודת מבט של רשת כדי להבין טוב יותר כיצד השילוב של תשומות מרובות שולט בפונקציות הסלולר הדיסקרטית בבריאות ובמחלות7,8, . תשע,עשר,11,12,13 לאור זה, כמותית מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI) פותחה כדי לאסוף תפוקה בינונית, נתונים כמותיים על שינויים לקפל ברשתות מגע דינמי של חלבון.
QMI הוא שיטת נוגדן מבוססת שבו ליפוסט התא הוא מודבטים עם פאנל של נוגדנים immunoprecipitation כי הם מצמידים מגנטי חרוזים מגנטיים המכילים יחסי צבע שונים של צבעי פלורסנט. לאחר נוגדנים ספציפיים מצמידים לכיתות שונות חרוז מגנטי מאפשר בו co-immunoprecipitation של מספר חלבונים מטרה מתוך ליפוסט זהה. לאחר immunoprecipitation (IP), חרוזים מגנטיים הם מודבטים עם שנייה, fluorophore מעלה באוב נוגדן בדיקה (או נוגדן biotinylated בשילוב עם fluorophore מצועם streptavidin). שיתוף אסוציאציות בין החלבונים המוכרים על ידי כל נוגדן IP בדיקה הצמד, או דגים (חלבונים במערכות משותפות שזוהו על ידי אפיסקופים חשופים משטח), מזוהים אז על ידי הזרמת cy, וניתן לכמת בהשוואה בין שונות תנאים לדוגמה14. איורים באיור 1 להראות את השלבים המעורבים בהפעלת שיטת qmi, כולל דיאגרמה של חרוזים מגנטיים עם immunoprecipitated מתחמי חלבון המסומנים על ידי פלואור בדיקה בדיקת נוגדנים (איור 1ג).
הרגישות של QMI תלוי בריכוז החלבון של ליפוסט ביחס למספר חרוזים מגנטיים המשמשים לimmunoprecipitation, והשגת החלטה לזהות 10% מקפלים שינויים דורש רק כמות קטנה של חומר התחלתי לעומת אחרים שיתוף IP שיטות14,15. לדוגמה, כמות חומר ההתחלה שנעשה בו שימוש QMI דומה לזה הנדרש עבור כריך חיסוני מקושר אנזים (אליסה), אבל אינטראקציות מרובות מזוהים בתוך שיטת QMI אחת. Qmi בחני באמצעות 20 IPs ו 20 מטרות המחקר בוצעו באמצעות 1-5 x 105 הראשי T תאים מבודדים מתוך 4 ביופסיה העור, P2 synaptosomal ההכנות מ 3 מ"מ בסעיף ילתית של קליפת העכבר הקדם, או 3 x 106 העכבר הראשי העיקרי , נוירונים, מ,מאוד. רגישות זו גורמת QMI שימושי ניתוח של תאים או רקמה עם זמינות מוגבלת, כגון דגימות קליניות.
QMI יכול להיות מותאם עבור כל רשת האינטראקציה הקודמת שהוגדרו חלבון (בתנאי שנוגדנים זמינים), ועד היום פותחה כדי לנתח את קולטן האנטיגן של תא T (TCR) מערכת המשנה של חלבונים ב glutamatergic הסינפסות בנוירונים מיכל בן 17 , 18. במחקרים של האיתות קולטן תא T, qmi השתמשו לראשונה לזהות שינויים גירוי המושרה בדגים, ולאחר מכן כדי להבחין חולים אוטואימוניות מקבוצת שליטה, לזהות מאותת אוטואימוניות אנדוסוגני, ולבסוף כדי ליצור השערה מעורבים רשת משנה לא מאוזנת הקשורה למחלה של אינטראקציות14. לאחרונה, את אותו פאנל QMI שימש כדי לקבוע כי thymocyte הבחירה נקבעת על ידי כמותית ולא הבדלים איכותניים ב-TCR-המשויך חלבון איתות19. בנוירונים, QMI שימש לתאר הסדר מחדש הקלט של רשת אינטראקציה חלבון עבור סוגים שונים של אותות קלט באופן התומך מודלים חדשים המתעוררים של הפלסטיות הסינפטית17. בנוסף, זה הפאנל QMI סינפטית שימש כדי לזהות הבדלים שבעה מודלים של העכבר אוטיזם, אשכול את המודלים לקבוצות משנה על בסיס הביוחתימות שלהם דגים, ובמדויק ההשערה גרעון מולקולרי משותף כי היה בעבר לא מוכר באחד מדגמי16. גישה דומה יכולה לשמש לצורך המסך עבור קבוצות מסחר אחרות שעלולות להגיב לטיפולי סמים שונים, או להקצות תרופות לקבוצות מסוימות המגיבים לתגובה. QMI יש יישומים פוטנציאליים באבחון, משנה הקלדה החולה, פיתוח סמים, בנוסף למדע בסיסי.
כדי להרכיב פאנל נוגדן QMI, הקרנת נוגדנים ראשונית ופרוטוקולי בחירה מתוארים בסעיף 1, להלן. לאחר לוחות נוגדנים מזוהים, פרוטוקולים עבור בניינים של נוגדנים שנבחרו לחרוזים מגנטיים עבור IP, ו עבור biotinylation של נוגדנים בדיקה שנבחרו, מתוארים בסעיף 2. הפרוטוקול להפעלת הערך QMI בתאים או ברקמות מתואר בסעיף 3. לבסוף, מאחר שניסוי בודד יכול להפיק ~ 5 x 105 נקודות נתונים בודדות, הוראות וקודי מחשב כדי לסייע בעיבוד נתונים, ניתוח והדמיה מסופקים בסעיף 4. מבט כולל על זרימת העבודה המתוארת בסעיפים 2-4 מוצג באיור 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well flat bottomed plates</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171025001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well PCR plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82006-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bioplex 200 System with HTF</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171000205</td>
			<td>modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bio-Plex Pro Wash Station</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">30034376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">BSA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">CML beads</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C37481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EDTA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">MagPlex Microspheres</td>
			<td style="width:121px;">Luminex</td>
			<td style="width:119px;">MC12xxx-01</td>
			<td>xxx is the 3 digit bead region</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Melon Gel IgG Spin Purification Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45206</td>
			<td>used for antibody purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:237px;">MES</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Microplate film, non-sterile</td>
			<td style="width:121px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2920-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Phosphotase inhibitor cocktail #2</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sandwich Prep Refrigerator</td>
			<td style="width:121px;">Norlake</td>
			<td>SMP 36 15</td>
			<td>for custom refrigeration of Bioplex 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Streptavidin-PE</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">405204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sulfo NHS</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Tris</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation

אינטראקציות חלבון חלבונים דינאמיות שולטות בהתנהגות התאית, מתנועתיות ועד לשכפול דנ א לסימני התמרה. עם זאת, מעקב אחר אינטראקציות דינמיות בין מספר חלבונים ברשת אינטראקציה חלבון היא קשה מבחינה טכנית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור כמותיים מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI), המאפשר הערכה כמותית של שינויי מקפלים באינטראקציות חלבונים המבוססות על מדידות זריחה יחסית של חלבונים במערכות משותפות שזוהו על ידי חשופים אפיסקופים מפני השטח (דגים). ב QMI, מכלולי חלבון מ-lysates תא הם immunoprecipitated על מיקרוספירות, ולאחר מכן נחקר עם נוגדן בתווית עבור חלבון שונה כדי לכמת את השפע של דגים. נוגדנים Immunoprecipitation מובחנות אזורים ספקטרליים שונים, אשר מאפשר cytometer זרם להבדיל immunoprecipitations מקבילים מרובים ובמקביל לכמת את כמות נוגדן בדיקה הקשורים לכל. QMI אינו דורש תיוג גנטי ניתן לבצע באמצעות ביומטריה מינימלית לעומת שיטות immunoprecipitation אחרות. QMI יכול להיות מותאם עבור כל קבוצה מוגדרת של שימוש בחלבונים, ולכן יש עד כה שימש לאפיון רשתות איתות בתאי T ו-הסינפסות העצבית גלוטמט. התוצאות הובילו ליצירת השערה חדשה עם יישומים פוטנציאליים אבחון וטיפולי. פרוטוקול זה כולל הוראות לבצע qmi, מן הבחירה הראשונית הפאנל הנוגדן דרך להפעיל בחני וניתוח נתונים. ההרכבה הראשונית של שיטת QMI כרוכה בסינון נוגדנים ליצירת פאנל, וקביעת מאגר פירוק מתאים. ההכנה הכימית הבאה כוללת מצמד מimmunoprecipitation נוגדנים לחרוזי מאגי, ונוגדנים ביולוגיים מבוססי ביוטילוטינג כך שהם יכולים להיות מסומנים על-ידי fluorophore streptavidin. כדי להפעיל את הבדיקה, ליפוסט מעורבב עם מאגחרוזים בן לילה, ולאחר מכן חרוזים מחולקים מודבטים עם נוגדנים בדיקה שונים, ולאחר מכן תווית fluorophore ולקרוא על-ידי cy, הזרמת לנסות. שני בדיקות סטטיסטיות מתבצעות כדי לזהות את הדגים שונים באופן משמעותי בין התנאים הניסיוניים, והתוצאות מתדמיינו באמצעות מפות חום או דיאגרמות קצה הצומת.

הקרנת נוגדנים איור 2 B מציג את תוצאות המסך עבור חלבון Connexin36. רוב השילובים IP_probe מייצרים לא אות מעל פקדי IgG. IP עם הנוגדן המונשבטיים 1E5 ולבדוק עם או 1E5 או נוגדנים פוליבטיים 6200 מייצרת משמרת ימניים בהתפלגות חרוז לעומת שולטת IgG. כאן, IP 1E5 ו לחקור 6200poly נבחרו כדי להימ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

כמותית מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI) משתמשת cy, לנסות לגילוי רגיש של הבדלים בשפע של אינטראקציות חלבונים בחלבון ממוקדות בין שתי דגימות. QMI ניתן לבצע באמצעות כמות קטנה של ביומטריה, אינו דורש תגים מהונדסים גנטית, והוא יכול להיות מותאם עבור כל רשת בעבר הגדרת חלבון אינטראקציה.

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

שיתוף-אימונופרציפציה מרובה כמותית, או QMI, מאפשר למשתמשים למדוד בו-זמנית מאות אינטראקציות בינאריות ברשת אינטראקציה מוגדרת מראש של חלבונים. על ידי ביצוע מספר IPs משותף בו זמנית באותו lysate, טכניקות bioinformatics אז יכול לבחון כיצד קבוצות של עמותות שיתוף לשנות באופן מתואם. ההתמדה היא זמן רב לפתח, אבל ברגע פאנל QMI הוא ביד נתונים בקנה מידה רשת ניתן לאסוף על מערכות העברת אותות בהתמדה פשוטה יחסית לילה.QMI דורש צינור מדויק של דגימות שונות reagents לתוך 96 צלחות באר. יש לרשום הערות זהירות בעת הגדרה והפעלה של כל בדיקה כדי למנוע שגיאות. להכנת מדגם ו immunoprecipitation, להתחיל על ידי lysing את המדגם בחומר ניקוי מתאים עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז עבור דגירה 15 דקות על קרח.בסוף הדגירה, לסובב את המדגם כדי להסיר את הממברנות והפסולת ולבצע בדיקה BCA על supernatant כדי לקבוע את ריכוז החלבון על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לאחר נרמול ריכוזי החלבון, הכינו תערובת אב של חרוזים מגנטיים המכילה כ-250 חרוזים מגנטיים מכל מחלקה לבא. השתמש בהפרדה מגנטית כדי לשטוף את תערובת חרוזים מגנטיים פעמיים במאגר Fly P לפני שימוש חוזר את חרוזים ב 20 microliters של מאגר לטוס P לכל מדגם.לאחר צינור יסודי, aliquot 20 microliters של חרוזים לתוך צינור microcentrifuge קר קרח אחד לכל מדגם ולהוסיף כמויות שוות של lysate עם ריכוזי חלבון מנורמל לכל צינור עבור immunoprecipitation. לאחר מכן מחלקים כל דגימת ליסאט לצינור אחד עבור כל צלחת המנוהלת ומאימונפרציפיט את הדגימות על מסובב בארבע מעלות צלזיוס לילה מוגן מפני אור. למחרת בבוקר להשתמש במדף חרוזים מגנטיים כדי להסיר את lysate מהסט הראשון של צינורות ולשטוף את חרוזים פעמיים ב 500 microliters של קרח קר לעוף P חוצץ לכל לשטוף.לאחר חישוב נפח ההתכווצות מחדש, המתן מחדש את האימונופריטים בנפח המחושב של מאגר Fly P קר כקרח. ביסודיות resuspend את חרוזים מגנטיים על ידי צינורות עדינים ולהפיץ 25 microliters של חרוזים לאורך היטב על פני שטוח תחתית 96 צלחת היטב על הקרח. בצלחת אחרת של 96 בארות, מדוללים על ידי נוגדני בדיקה attinilated לריכוז עבודה פעמיים.השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להפיץ 25 microliters של כל דילול נוגדן בדיקה לתוך בארות המתאימות של חרוז מגנטי המכיל צלחת הבדיקה לנער במהירות גבוהה על שייקר צלחת אופקית לערבב מחדש את חרוזים מגנטיים. לאחר ערבוב, להפחית את המהירות עבור דגירה של שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם חיץ טיסה P טרי לכל לשטוף על מכונת כביסה צלחת מגנטית בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הכביסה האחרונה, להשתמש שוב את חרוזים ב 50 microliters של סטרפטבידין PE מדולל אחד עד 200 במאגר P לטוס. מנערים את התערובת ומערבבים מחדש את חרוזים לפני הדגירה את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות מוגנים מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם חיץ לטוס P על מכונת כביסה צלחת מגנטית בארבע מעלות צלזיוס ו resuspend את חרוזים ב 125 microliters של חיץ P לטוס.לנער את הצלחת במשך דקה אחת ב 900 סיבובים כדי לשימוש חוזר ביסודיות את חרוזים לטעון את הצלחת לתוך ציטומטר זרימה refridgerated. בתוכנת ציטומטר הזרימה, בחר הגדרת יעד גבוהה של RP1, מצב עצירה של 1,000 חרוזים לאזור ונפח דגימה של 80 מיקרוליטרים. השהה את הריצה באמצע הדרך והתן מחדש את חרוזים כדי למנוע התיישבות.בסוף הריצה, יצא את קבצי הנתונים בתבנית XML. כדי לבצע ניתוח ANC, מלא את קובץ הקלט של ANC כדי לשקף את פרטי העיצוב הניסיוני ולהפעיל את התוכנית, אשר יכתוב קובץ CSV לתוך הספריה הפעילה. הקובץ מסתיים בהיטים.csv ידווח על עמותות החלבון השונות באופן משמעותי ברמה חיובית כוזבת של 0.05 בין הבקרה לתנאי הניסוי בלפחות שלושה מתוך ארבעה שכפולים ניסיוניים. עבור ניתוח רשת מתאם משוקלל, הדבק את כותרות העמודות של פלט קובץ הנתונים על-ידי Matlab המסתיים ב- mfi. csv לתוך העמודה הראשונה של גיליון אלקטרוני חדש ולהוסיף את העמודות ניסוי מספר טיפול לטיפול ניסיוני וכל משתנים אחרים שיש לנתח.שמור קובץ זה כתכונות. csv ולפתוח R סטודיו. הגדר את ספריית העבודה לתיקיה המכילה את ה- mfi.CSV ותכונות. קובצי csv, סמן מקטעי קוד ולחץ על Command Enter כדי להפעיל את פקודות R כפי שצוין בקובץ הפקודה עם ההערות. מודולי ניתוח רשת מתאם משוקלל בקורלציה משמעותית עם כל תכונה ניסיונית יהיה פלט כקובץ גרפי ואת המתאם של כל אינטראקציה עם כל מודול יהיה פלט כקובץ CSV.עבור כל אינטראקציה בקובץ הפלט ANC, זהה אם אינטראקציה זו משמעותית גם על-ידי CNA וצור עמודה חדשה המציינת אם כל להיט ANC הוא גם להיט CNA. המר את הערכים כדי לרשום שני שינויי קיפול ולחשב את הערך הממוצע עבור כל כניסות CNA של איחוד ANC. לבסוף, צור גיליון אלקטרוני חדש עם כל להיט CNA של איחוד ANC הרשום על-ידי יעד immunoprecipitation שלו בעמודה אחת, יעד הבדיקה שלו בעמודה השניה וערך שינוי הקיפול שלו בעמודה השלישית.יבא קובץ זה לתוך Cytoscape כרשת כדי ליצור דיאגרמת קצה צומת. אינטראקציות חלבון בביטחון גבוה שזוהו על-ידי שתי הגישות הסטטיסטיות הבלתי תלויות חזותיות כדיאגרמות קצה צומת באמצעות תוכנת הקוד הפתוח, Cytoscape, או כמפות חום המשתמשות בקוד R ובהוראות ניתוח הכלולות בחומר המשלים. לאורך כל הפרוטוקול, משתמשים צריכים לדאוג pipette במדויק, כדי לשמור על רשומות קפדניות, ולשמור על הדגימות קרות בכל עת.השתמשנו ב- QMI כדי להבין כיצד מסלולי החלת אותות מבדילים בין סוגי קלט שונים ומשלבים מידע מקולטנים מרובים.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

ויזואליזציה של אינטראקציה בין חלבונים ב גרעיני cytoplasmic שברים על ידי Co-immunoprecipitation ו<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

חקירת חלבון רצף-מבנה-דינמיקה יחסים עם Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

לכידה בסיוע שרפים בשילוב עם תיוג תג מסת טנדם איזוברי לכימות מרובב של חמצון חלבון תיול

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...