Name: quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation
Uploaded: 2019-08-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Gli autori desiderano riconoscere Tessa Davis per importanti contributi allo sviluppo dei saggi QMI e per gli attuali ed ex membri dei laboratori Smith e Schrum per l'orientamento tecnico e l'input intellettuale. Questo lavoro è stato finanziato dalle sovvenzioni NIMH R01 MH113545 e R00 MH 102244.

1. Progettazione del saggio
<ol><li>Preparazione anticorpale candidato<ol>
<li>Per ogni proteina di interesse, scegliere da 3 a 5 anticorpi da vagliare. Quando possibile, utilizzare anticorpi monoclonali che riconoscono epitopi diversi. Includere anche un anticorpo di controllo non specifico.</li>
		<li>Per rimuovere Tris, eseguire lo scambio di buffer aggiungendo l'anticorpo a un filtro di spin da 30 kDa, girando fino al suo volume minimo, aggiungendo 500 L di salina con buffer fosfato (PBS) e ripetendo 3 volte. Per r...

<ol>
	<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rodr&#237;guez-Jorge, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+T+cell+receptor+and+Toll-like+receptor+5+signaling+for+CD4.">Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4.</a> Science Signaling. 12 (577), (2019).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), (2018).</li><li>Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+signaling+by+modular+adaptor+proteins.">Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).</li><li>Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+G+protein+signaling.">The many faces of G protein signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).</li><li>Lohse, M. J., Hofmann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Aspects+of+Signaling+by+G-Protein-Coupled+Receptors.">Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors.</a> Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).</li><li>Eltschinger, S., Loewith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOR+Complexes+and+the+Maintenance+of+Cellular+Homeostasis.">TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis.</a> Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).</li><li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theoretical+framework+for+specificity+in+cell+signaling.">A theoretical framework for specificity in cell signaling.</a> Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+and+Specificity+in+Signal+Transduction+via+Physiologic+Protein+Interaction+Networks.">Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks.</a> Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).</li><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+essentials:+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks.">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).</li><li>Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+in+the+endoplasmic+reticulum+unfolded+protein+response.">Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).</li><li>Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Iron+Homeostasis:+New+Players+in+Metabolism,+Cell+Death,+and+Disease.">Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+matrix+network+analysis+of+protein+complexes+in+the+human+TCR+signalosome.">Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome.</a> Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).</li><li>Schrum, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Science's STKE. 2007 (389), (2007).</li><li>Brown, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+the+autisms+using+glutamate+synapse+protein+interaction+networks+from+cortical+and+hippocampal+tissue+of+seven+mouse+models.">Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models.</a> Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).</li><li>Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+induces+input-specific+rearrangements+in+a+targeted+synaptic+protein+interaction+network.">Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network.</a> Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+protein+complexes+isolated+from+primary+human+skin-resident+T+cells+can+be+analysed+by+Multiplex+IP-FCM.">Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM.</a> Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).</li><li>Neier, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+proximal+&#945;&#946;+TCR+signalosome+specifies+thymic+selection+outcome+through+a+quantitative+protein+interaction+network.">The early proximal &#945;&#946; TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network.</a> Science Immunology. 4 (32), (2019).</li><li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM:+immunoprecipitation+detected+by+flow+cytometry.">IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM+measures+physiologic+protein-protein+interactions+modulated+by+signal+transduction+and+small-molecule+drug+inhibition.">IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition.</a> PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).</li><li>Lautz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+changes+in+synaptic+protein+complex+composition+are+consistent+in+different+detergents+despite+differential+solubility.">Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility.</a> BioRXiv. , (2019).</li><li>Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WGCNA:+an+R+package+for+weighted+correlation+network+analysis.">WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis.</a> BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+bivalency+observed+among+TCR/CD3+complexes+isolated+from+primary+T+cells.">Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells.</a> Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).</li></ol>

Il test QMI richiede notevoli investimenti nello sviluppo, nelle attrezzature e nei reagenti dei pannelli anticorpi, ma una volta stabilito il test, si possono raccogliere dati ad alta dimensione osservando le reti di interazione delle proteine mentre rispondono ai controlli sperimentali Stimoli. Tecnicamente, QMI richiede un'attenta pipettatura e tracciamento delle posizioni dei pozzi di campioni e anticorpi. È utile etichettare con attenzione le lastre di analisi, così come un modello dettagliato di posizioni dei poz...

Le interazioni dinamiche proteina-proteina costituiscono le cascate di segnalazione molecolare e le strutture motili che sono la base funzionale della maggior parte della fisiologia cellulare1. Questi processi sono spesso raffigurati come percorsi di segnalazione lineare che passano tra stati costanti basati su singoli input, ma i dati sperimentali e di modellazione mostrano chiaramente che funzionano come reti integrate2,3, 4.Nel caso delle proteine G, recettori diversi hanno spesso la capacità di attivare la stessa proteina G, e un singolo recettore può anche attivare più di un tipo di proteina G5,6. Affinché il numero relativamente ridotto di classi di proteine G modifichi specificamente una vasta gamma di funzioni cellulari come la trasmissione sinaptica, la regolazione ormonale e la migrazione cellulare, le cellule devono integrare e differenziare questi segnali4 , 5. Le prove hanno dimostrato che questa specificità del segnale, sia per le proteine G che per altre, è derivata principalmente sulla base di interazioni proteina-proteina finemente sintonizzate e della loro dinamica temporale1,3, 4 DEL psu' , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7. Poiché le reti di segnalazione sono costituite da complessi proteici dinamici con più ingressi, uscite e cicli di feedback, una singola perturbazione ha l'opportunità di modificare l'equilibrio omeostatico complessivo della fisiologia di una cellula4 ,7. È ormai ampiamente convenuto che la segnalazione dovrebbe essere esaminata da una prospettiva di rete al fine di comprendere meglio come l'integrazione di più ingressi controlla le funzioni cellulari discrete in salute e malattia7,8, 9,10,11,12,13. Alla luce di ciò, Quantitative Multiplex Immunoprecipitazionation (QMI) è stato sviluppato per raccogliere dati quantitativi di media velocità media sulle dimensioni sui cambiamenti di piegatura nelle reti di interazione dinamica delle proteine.
QMI è un saggio basato su anticorpi in cui il lisa cellulare è incubato con un pannello di anticorpi di immunoprecipitazioni che sono covalentmente accoppiati a perline magnetiche contenenti rapporti distinti di coloranti fluorescenti. Avere anticorpi specifici accoppiati a classi di perline magnetiche distinte consente la co-immunoprecipitazioni simultanea di più proteine bersaglio dallo stesso lisato. Dopo l'immunoprecipitazioni (IP), le perle magnetiche vengono incubate con un secondo anticorpo sonda coniugato a fluoroforo (o anticorpo biotinyato in combinazione con streptavidina coniugata a fluoroforo). Le co-associazioni tra le proteine riconosciute da ogni coppia di anticorpi anticorpi IP, o PiSCES (proteine in complessi condivisi rilevati da epitopes di superficie esposta), vengono poi rilevate dalla citometria di flusso e possono essere confrontate quantitativamente tra diversi condizioni del campione14. Le illustrazioni nella Figura 1 mostrano i passaggi coinvolti nell'esecuzione di un test QMI, incluso un diagramma di perline magnetiche con complessi proteici immunoprecipitati etichettati da anticorpi della sonda coniugati fluorescentmente (Figura 1C).
La sensibilità del QMI dipende dalla concentrazione proteica del lisato rispetto al numero di perline magnetiche utilizzate per l'immunoprecipitazioni e il raggiungimento di una risoluzione per rilevare i cambiamenti del 10% richiede solo una piccola quantità di materiale iniziale rispetto ad altri metodi di co-IP14,15. Ad esempio, la quantità di materiale di partenza utilizzato in QMI è simile a quella richiesta per un sandwich Enzima-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), ma vengono rilevate più interazioni in un singolo test QMI. I saggi QMI utilizzando 20 IP e 20 obiettivi di sonda sono stati eseguiti utilizzando 1-5 x 105 cellule T primarie isolate da una biopsia cutanea di 4 mm, preparazioni sinaptosomiche P2 da una sezione coronale da 3 mm della corteccia prefrontale del topo, o 3 x 106 cellule primarie di topo coltivate neuroni corticali14,16,17. Questa sensibilità rende QMI utile per l'analisi di cellule o tessuti con disponibilità limitata, come campioni clinici.
QMI può essere adattato per qualsiasi rete di interazione proteica definita in precedenza (a condizione che siano disponibili anticorpi), e ad oggi è stato sviluppato per analizzare il signaloso del recettore dell'antigene della cellula T (TCR) e un sottoinsieme di proteine nelle sinapsi glutamatergiche nei neuroni 17 mi lato , 18.Negli studi sulla segnalazione del recettore delle cellule T, QMI è stato utilizzato per identificare i cambiamenti indotti dalla stimolazione in PiSCES, e poi per distinguere i pazienti autoimmuni da un gruppo di controllo, rilevare la segnalazione autoimmune endogena e infine per generare un l'ipotesi che coinvolga una sottorete di interazioni associata alla malattia sbilanciata14. Più recentemente, lo stesso pannello QMI è stato utilizzato per determinare che la selezione dei timociti è determinata da differenze quantitative piuttosto che qualitative nella segnalazione proteica associata al TCR19. Nei neuroni, QMI è stato utilizzato per descrivere il riarrangiamento specifico dell'input di una rete di interazione proteica per tipi distinti di segnali di ingresso in un modo che supporta i nuovi modelli emergenti di plasticità sinaptica17. Inoltre, questo pannello sinaptico QMI è stato utilizzato per identificare le differenze in sette modelli murini di autismo, raggruppare i modelli in sottogruppi in base alle loro biofirme PiSCES e ipotizzare con precisione un deficit molecolare condiviso che in precedenza non era riconosciuto in uno dei modelli16. Un approccio simile potrebbe essere utilizzato per controllare altri sottogruppi che potrebbero rispondere a diversi trattamenti farmacologici o assegnare farmaci a specifici sottogruppi reattivi. QMI ha potenziali applicazioni nella diagnostica, sotto-tipizzazione dei pazienti e sviluppo di farmaci, oltre alla scienza di base.
Per assemblare un pannello anticorpo QMI, lo screening iniziale degli anticorpi e i protocolli di selezione sono descritti nella Sezione 1, di seguito. Una volta identificati i pannelli anticorpi, i protocolli per la coniugazione degli anticorpi selezionati alle perline magnetiche per ip e per la biotinylazione degli anticorpi della sonda selezionati sono descritti nella sezione 2. Il protocollo per l'esecuzione del saggio QMI sulle lisature di cellule o tessuti è descritto nella Sezione 3. Infine, poiché un singolo esperimento può generare 5 x 105 punti dati individuali, istruzioni e codici informatici per facilitare l'elaborazione, l'analisi e la visualizzazione dei dati sono forniti nella Sezione 4. Una panoramica del flusso di lavoro descritto nelle sezioni 2-4 è illustrata nella Figura 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well flat bottomed plates</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171025001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well PCR plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82006-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bioplex 200 System with HTF</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171000205</td>
			<td>modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bio-Plex Pro Wash Station</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">30034376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">BSA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">CML beads</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C37481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EDTA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">MagPlex Microspheres</td>
			<td style="width:121px;">Luminex</td>
			<td style="width:119px;">MC12xxx-01</td>
			<td>xxx is the 3 digit bead region</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Melon Gel IgG Spin Purification Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45206</td>
			<td>used for antibody purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:237px;">MES</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Microplate film, non-sterile</td>
			<td style="width:121px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2920-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Phosphotase inhibitor cocktail #2</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sandwich Prep Refrigerator</td>
			<td style="width:121px;">Norlake</td>
			<td>SMP 36 15</td>
			<td>for custom refrigeration of Bioplex 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Streptavidin-PE</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">405204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sulfo NHS</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Tris</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation

Le interazioni dinamiche proteina-proteina controllano il comportamento cellulare, dalla motilità alla replicazione del DNA alla trasduzione del segnale. Tuttavia, il monitoraggio delle interazioni dinamiche tra più proteine in una rete di interazione proteica è tecnicamente difficile. Qui presentiamo un protocollo per l'immunoprecipitazioni Quantitative Multiplex (QMI), che consente la valutazione quantitativa dei cambiamenti di piegatura nelle interazioni proteiche sulla base delle misurazioni relative a fluorescenza delle proteine nei complessi condivisi rilevate da Exposed Epitopi di superficie (PiSCES). Nel QMI, i complessi proteici da lismi cellulari sono immunoprecipitati sulle microsfere, e quindi sondati con un anticorpo etichettato per una proteina diversa al fine di quantificare l'abbondanza di PiSCES. Gli anticorpi dell'immunoprecipitazioni sono coniugati a diverse regioni spettrali MagBead, il che consente a un citometro di flusso di differenziare più immunoprecipitazioni parallele e quantificare simultaneamente la quantità di anticorpi sonda associati a ciascuna di esse. QMI non richiede l'etichettatura genetica e può essere eseguita utilizzando un biomateriale minimo rispetto ad altri metodi di immunoprecipitazioni. QMI può essere adattato per qualsiasi gruppo definito di proteine interagenti, ed è stato finora utilizzato per caratterizzare le reti di segnalazione nelle cellule T e sinapsi glutammato neuronale. I risultati hanno portato alla generazione di nuove ipotesi con potenziali applicazioni diagnostiche e terapeutiche. Questo protocollo include istruzioni per eseguire QMI, dalla selezione iniziale del pannello anticorpale fino all'esecuzione di saggi e all'analisi dei dati. L'assemblaggio iniziale di un saggio QMI prevede lo screening di anticorpi per generare un pannello e la determinazione empirica di un buffer di lisi appropriato. La successiva preparazione del reagente comprende anticorpi di immunoprecipitazioni covalentmente di accoppiamento a MagBeads, e anticorpi della sonda biotinylante in modo che possano essere etichettati da un fluoroforo coniugato di streptavidin. Per eseguire il saggio, il lisato viene mescolato con MagBeads durante la notte, e poi le perle sono divise e incubate con diversi anticorpi della sonda, quindi un'etichetta di fluoroforo, e lette per citometria di flusso. Vengono eseguiti due test statistici per identificare i PiSCES che differiscono in modo significativo tra le condizioni sperimentali e i risultati vengono visualizzati utilizzando mappe di calore o diagrammi node-edge.

Screening anticorpale Figura 2 B mostra i risultati di uno schermo per la proteina Connexin36. La maggior parte delle combinazioni IP_probe non produce alcun segnale sui controlli IgG. IP con l'anticorpo monoclonale 1E5 e sonda con 1E5 o l'anticorpo policlonale 6200 produce uno spostamento verso destra nella distribuzione del tallone rispetto ai controlli IgG. Qui sono stati selezionati IP 1E5 e la sonda 6200poly per evitare l'uso dello stesso anticorpo d...

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Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

L'immunoprecipitazioni quantitativa multiplex (QMI) utilizza la citometria di flusso per rilevare sensitivemente le differenze nell'abbondanza di interazioni mirate proteina-proteina tra due campioni. QMI può essere eseguita utilizzando una piccola quantità di biomateriale, non richiede tag geneticamente ingegnerizzati e può essere adattato per qualsiasi rete di interazione proteica definita in precedenza.

Quantificazione delle dinamiche della rete di interazione proteica mediante co-immunoprecipitazioni multiplexate

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

La co-immunoprecipitazione multipla quantitativa, o QMI, consente agli utenti di misurare simultaneamente centinaia di interazioni binarie in una rete di interazione proteica predefinita. Eseguendo più co-PIC contemporaneamente nello stesso lisato, le tecniche bioinformatiche possono quindi esaminare come cambiano i gruppi di co-associazioni in modo coordinato. Il test richiede molto tempo per essere sviluppato, ma una volta che il pannello QMI è in corso, i dati sulla scala di rete possono essere raccolti sui sistemi di trasduzione del segnale in un saggio relativamente semplicemente overnight.QMI richiede l'accurata pipettazione di diversi campioni e reagenti in 96 piastre di pozzo. Quando si impostano ed eseguono ogni saggio, è necessario prendere appunti accurati per evitare errori. Per la preparazione del campione e l'immunoprecipitazione, iniziare lisciviando il campione in un detergente adatto con inibitori della proteasi e della fosfatasi per un'incubazione di 15 minuti sul ghiaccio.Al termine dell'incubazione, far girare il campione per rimuovere le membrane e i detriti ed eseguire un test BCA sul supernatante per determinare la concentrazione proteica secondo protocolli standard. Dopo aver normalizzante le concentrazioni proteiche, preparare un mix di perline magnetiche che contiene circa 250 perline magnetiche di ogni classe per pozzo. Utilizzare la separazione magnetica per lavare la miscela di perline magnetiche due volte nel buffer Fly P prima di rimescolare le perline in 20 microlitri di tampone Fly P per campione.Dopo un'accurata pipettazione, aliquote 20 microlitri di perline in un tubo di microcentrifugo ghiacciato per campione e aggiungere volumi uguali di lysate con concentrazioni proteiche normalizzate a ciascun tubo per l'immunoprecipitazione. Quindi dividere ogni campione di lisato in un unico tubo per ogni piastra in esecuzione e immunoprecipitare i campioni su un rotatore a quattro gradi Celsius durante la notte protetti dalla luce. La mattina seguente utilizzare un rack magnetico perline per rimuovere il lisato dal primo set di tubi e lavare le perline due volte in 500 microlitri di tampone Fly P ghiacciato per lavaggio.Dopo aver calcolato il volume di resuspensione, resospensione degli immunopreciti nel volume calcolato del tampone Fly P ghiacciato. Riprendodere accuratamente le perline magnetiche con una delicata pipettazione e distribuire 25 microlitri di perline per pozzo su una piastra piatta con fondo 96 poggiale sul ghiaccio. In una diversa piastra di pozzo 96, diluire con anticorpi sonda anattinilati ad una concentrazione di lavoro due volte superiore.Utilizzare una pipetta multicanale per distribuire 25 microlitri di ogni diluizione dell'anticorpo della sonda nei pozzi appropriati della perla magnetica contenente la piastra di dosaggio e agitare ad alta velocità su uno shaker orizzontale per mescolare e rimpioderare le perline magnetiche. Dopo la miscelazione, ridurre la velocità per un'incubazione di un'ora a quattro gradi Celsius protetti dalla luce. Alla fine dell'incubazione, lavare la piastra tre volte con tampone Fly P fresco per lavaggio su una rondella magnetica a quattro gradi Celsius.Dopo l'ultimo lavaggio, rimescolare le perline in 50 microlitri di streptavidina PE diluiti uno a 200 nel tampone Fly P. Agitare il mix e rimostrare le perline prima di incubare la piastra a quattro gradi Celsius per 30 minuti protetti dalla luce. Alla fine dell'incubazione, lavare la piastra tre volte con tampone Fly P su una rondella magnetica a quattro gradi Celsius e rimescolare le perline in 125 microlitri di tampone Fly P.Agitare la piastra per un minuto a 900 rotazioni per risospendire accuratamente le perline e caricare la piastra in un citometro a flusso perfezionato. Nel software del citometro a flusso, selezionare l'impostazione Target RP1 alta, una condizione di arresto di 1.000 perline per regione e un volume di campioni di 80 microlitri. Mettere in pausa la corsa a metà strada e rimpiorsi le perline per evitare la sedimentazione.Alla fine dell'esecuzione esportare i file di dati nel formato XML. Per eseguire l'analisi ANC, compilare il file di input ANC per riflettere i dettagli della progettazione sperimentale ed eseguire il programma, che scriverà un file CSV in Active Directory. File che termina con i riscontri.csv segnalerà le co-associazioni proteiche che sono significativamente diverse a un livello falso positivo di 0,05 tra il controllo e le condizioni sperimentali in almeno tre repliche sperimentali su quattro. Per l'analisi ponderata della rete di correlazione, incollare i titoli delle colonne del file di dati output di Matlab terminando in mfi. csv nella prima colonna di un nuovo foglio di calcolo e aggiungere le colonne Esperimento per il numero dell'esperimento e Trattamento per il trattamento sperimentale e qualsiasi altra variabile da analizzare.Salvare questo file come caratteristiche. csv e aprire R Studio. Impostare la directory di lavoro su una cartella contenente la mfi.csv e tratti. csv, evidenziare sezioni di codice e premere COMANDO INVIO per eseguire i comandi R come indicato nel file di comando commentato. I moduli di analisi della rete di correlazione ponderati significativamente correlati con ogni tratto sperimentale verranno esati come file grafico e la correlazione di ogni interazione con ogni modulo verrà eseguito come file CSV.Per ogni interazione nel file di output ANC, identificare se tale interazione è significativa anche da CNA e creare una nuova colonna che indichi se ogni hit ANC è anche un hit CNA. Convertire i valori in modo da registrare la modifica a due pieghe e calcolare il valore medio per tutti gli hit CNA di unione ANC. Infine, crea un nuovo foglio di calcolo con ogni colpo CNA di unione ANC elencato dal suo obiettivo di immunoprecipitazione in una colonna, il suo obiettivo di sonda nella seconda colonna e il suo valore di modifica della piegatura nella terza colonna.Importare questo file in Cytoscape come rete per creare un diagramma perimetrale del nodo. Le interazioni proteiche ad alta confidenza identificate dai due approcci statistici indipendenti sono visualizzate come diagrammi dei bordi dei nodi usando il software open source Cytoscape, o come mappe di calore usando il codice R e le istruzioni di analisi incluse nel materiale supplementare. In tutto il protocollo, gli utenti devono fare attenzione a pipettare con precisione, a tenere registri meticolosi e a mantenere i campioni freddi in ogni momento.Abbiamo usato QMI per capire come le vie di trasduzione del segnale distinguono tra i diversi tipi di input e integrano le informazioni da più recettori.

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