Name: quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation
Uploaded: 2019-08-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

저자는 QMI 분석 개발에 중요한 기여에 대한 테사 데이비스를 인정하고 자합니다, 기술 지도 및 지적 입력스미스와 슈럼 연구소의 현재와 전 회원. 이 작품은 NIMH 보조금 R01 MH113545 및 R00 MH 102244에 의해 지원되었다.

1. 분석 디자인
<ol><li>후보 항체 제제<ol>
<li>관심 있는 각 단백질에 대해 3-5개의 항체를 선택하여 선별합니다. 가능하면 다른 에피토프를 인식하는 단일 클론 항체를 사용하십시오. 또한 하나의 비특이적 조절 항체를 포함한다.</li>
		<li>Tris를 제거하려면 항체를 30 kDa 스핀 필터에 추가하고 최소 부피로 회전하고 인산완충 식염수 (PBS)의 500 μL을 추가하고 3 번 반복하여 버퍼 교환을 수행하십시오. ?...

<ol>
	<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rodr&#237;guez-Jorge, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+T+cell+receptor+and+Toll-like+receptor+5+signaling+for+CD4.">Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4.</a> Science Signaling. 12 (577), (2019).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), (2018).</li><li>Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+signaling+by+modular+adaptor+proteins.">Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).</li><li>Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+G+protein+signaling.">The many faces of G protein signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).</li><li>Lohse, M. J., Hofmann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Aspects+of+Signaling+by+G-Protein-Coupled+Receptors.">Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors.</a> Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).</li><li>Eltschinger, S., Loewith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOR+Complexes+and+the+Maintenance+of+Cellular+Homeostasis.">TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis.</a> Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).</li><li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theoretical+framework+for+specificity+in+cell+signaling.">A theoretical framework for specificity in cell signaling.</a> Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+and+Specificity+in+Signal+Transduction+via+Physiologic+Protein+Interaction+Networks.">Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks.</a> Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).</li><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+essentials:+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks.">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).</li><li>Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+in+the+endoplasmic+reticulum+unfolded+protein+response.">Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).</li><li>Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Iron+Homeostasis:+New+Players+in+Metabolism,+Cell+Death,+and+Disease.">Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+matrix+network+analysis+of+protein+complexes+in+the+human+TCR+signalosome.">Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome.</a> Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).</li><li>Schrum, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Science's STKE. 2007 (389), (2007).</li><li>Brown, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+the+autisms+using+glutamate+synapse+protein+interaction+networks+from+cortical+and+hippocampal+tissue+of+seven+mouse+models.">Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models.</a> Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).</li><li>Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+induces+input-specific+rearrangements+in+a+targeted+synaptic+protein+interaction+network.">Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network.</a> Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+protein+complexes+isolated+from+primary+human+skin-resident+T+cells+can+be+analysed+by+Multiplex+IP-FCM.">Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM.</a> Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).</li><li>Neier, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+proximal+&#945;&#946;+TCR+signalosome+specifies+thymic+selection+outcome+through+a+quantitative+protein+interaction+network.">The early proximal &#945;&#946; TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network.</a> Science Immunology. 4 (32), (2019).</li><li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM:+immunoprecipitation+detected+by+flow+cytometry.">IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM+measures+physiologic+protein-protein+interactions+modulated+by+signal+transduction+and+small-molecule+drug+inhibition.">IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition.</a> PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).</li><li>Lautz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+changes+in+synaptic+protein+complex+composition+are+consistent+in+different+detergents+despite+differential+solubility.">Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility.</a> BioRXiv. , (2019).</li><li>Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WGCNA:+an+R+package+for+weighted+correlation+network+analysis.">WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis.</a> BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+bivalency+observed+among+TCR/CD3+complexes+isolated+from+primary+T+cells.">Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells.</a> Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).</li></ol>

QMI 분석법은 항체 패널 개발, 장비 및 시약에 상당한 투자가 필요하지만, 일단 분석이 확립되면 실험적으로 제어되는 단백질 상호 작용 네트워크를 관찰하는 고차원 데이터를 수집할 수 있습니다. 자극. 기술적으로 QMI는 시료 및 항체 유정 위치의 신중한 파이펫팅 및 추적이 필요합니다. 분석 판에 신중하게 라벨을 붙이는 것은 종이에 우물 위치의 상세한 템플릿을 만드는 것과 같이 유용하며, 이?...

동적 단백질-단백질 상호 작용은 대부분의 세포 생리학1의 기능적 기초인 분자신호 캐스케이드 및 운동성 구조를 구성한다. 이러한 프로세스는 종종 단일 입력을 기반으로 정상 상태 사이를 전환하는 선형 신호 경로로 묘사되지만 실험 및 모델링 데이터는 통합 네트워크 2,3 . 4.G 단백질의 경우, 다른 수용체는 종종 동일한 G 단백질을 활성화할 수 있으며, 단일 수용체는또한 G 단백질 5,6의한 가지 유형 이상을 활성화시킬 수 있다. 상대적으로 적은 수의 G 단백질 클래스가 시냅스 전송, 호르몬 조절 및 세포 이동과 같은 광범위한 세포 기능을 구체적으로 조절하기 위해서는 세포가 이러한 신호를 통합하고 분화해야 합니다4 , 5. 증거는 이 신호 특이성이 G 단백질뿐만 아니라 다른 사람에 대해, 주로 미세 조정 된 단백질 - 단백질 상호 작용 및 시간 역학 1,3에기초하여 파생된다는 것을 보여주었습니다. 4개 , 5개 , 6개 , 7. 시그널링 네트워크는 여러 입력, 출력 및 피드백 루프가있는 동적 단백질 복합체로 구성되기 때문에 단일 섭동은 세포의 생리학4의 전반적인 적시 성 균형을 변경할 수있는 기회를 가합니다. ,7. 이제 여러 입력의 통합이 건강과 질병7,8에서개별 세포 기능을 제어하는 방법을 더 잘 이해하기 위해 네트워크 관점에서 신호를 검사해야한다는 것이 널리 동의됩니다. 9,10,11,12,13. 이에 비추어, 정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 동적 단백질 상호작용 네트워크의 배 변화에 대한 중간 처리량, 정량적 데이터를 수집하기 위해 개발되었다.
QMI는 세포 용해가 형광 염료의 뚜렷한 비율을 포함하는 자기 구슬에 공유결합되는 면역 침전 항체의 패널로 배양되는 항체 기지를 둔 분석입니다. 뚜렷한 자기 비드 클래스에 결합된 특정 항체를 갖는 것은 동일한 용해물로부터 다중 표적 단백질의 동시 동시 동시 면역 침전을 허용한다. 면역 침전 (IP)에 이어, 자기 비드는 두 번째, 형광 공형 프로브 항체 (또는 플루오로포폴화 된 스트렙타비딘과 함께 생체 면역 항체)로 배양됩니다. 각 IP 항체 프로브 항체 쌍또는 PiSCES (노출된 표면 에피토프에 의해 검출된 공유 복합체의 단백질)에 의해 인식된 단백질 간의 공동 연결은 유세포 측정에 의해 검출되고 서로 다른 사이에서 정량적으로 비교될 수 있습니다. 샘플 조건14. 도 1의 그림은 형광공응접체 프로브 항체에 의해 표지된 면역침전성 단백질 복합체를 가진 자기 비드의 다이어그램을 포함하여 QMI 분석을 실행하는 데 관여하는 단계를 보여 준다(도1C).
QMI의 감도는 면역 침전에 사용되는 자기 비드의 수에 비해 용해물의 단백질 농도에 따라 달라지며, 10% 배 변화를 검출하는 분해능을 달성하는 것은 다른 것에 비해 소량의 시작 물질만필요로 한다. 공동 IP 방법14,15. 예를 들어, QMI에 사용되는 시작 물질의 양은 샌드위치 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)에 필요한 것과 유사하지만, 단일 QMI 분석에서 여러 상호작용이 검출된다. 20개의 IP 및 20개의 프로브 표적을 사용하여 QMI 표적은 4 mm 피부 생검으로부터 분리된 1-5 x 10 5차 T 세포를 사용하여 수행되었으며, P2 시냅소탈 제제는 마우스 전두엽 피질의 3 mm 관상 동맥 부편에서, 또는 3 x 106 배양 마우스 프라이머리를 사용하여 수행되었다. 피질 뉴런14,16,17. 이 감도는 임상 견본과 같은 제한된 가용성을 가진 세포 또는 조직의 분석을 위해 QMI를 유용하게 합니다.
QMI는 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크(항체가 사용 가능)에 대해 적응할 수 있으며, 현재까지 뉴런의 글루타마테르지시냅스에서 T 세포 항원 수용체(TCR) 신호체 및 단백질의 서브세트를 분석하기 위해 개발되었습니다. 17세 , 18.T 세포 수용체 신호의 연구에서, QMI는 먼저 PiSCES에서 자극 유발 변화를 식별하기 위해 사용되었다, 다음 대조군에서 자가 면역 환자를 구별하기 위해, 내인성 자가 면역 신호를 감지하고, 마지막으로 생성하는 상호 작용의 불균형 질병 관련 하위 네트워크와 관련된 가설14. 보다 최근에는 동일한 QMI 패널이 TCR 관련 단백질 신호(19)의 질적 차이보다는 정량적차이에 의해 결정되는 흉선 선택이 결정되는 것을 결정하는데 사용되었다. 뉴런에서, QMI는 시냅스 가소성17의새롭게 떠오르는 모델을 지원하는 방식으로 뚜렷한 유형의 입력 신호에 대한 단백질 상호작용 네트워크의 입력 특이적 재배열을 설명하는 데 사용되었다. 또한, 이 시냅스 QMI 패널은 자폐증의 7개의 마우스 모델에서 차이를 식별하고, PiSCES 생체 서명을 기반으로 모델을 하위 그룹으로 클러스터화하고, 이전에는 인식되지 않았던 공유 분자 적자를 정확하게 가설하는 데 사용되었습니다. 모델 16중 하나에서 . 유사한 접근은 다른 약 처리에 반응할 수 있는 그밖 소집단을 위해 가리기 위하여 이용될 수 있었습니다, 또는 특정 반응하는 하위 단에 약을 할당하. QMI는 기초 과학 이외에 진단, 환자 서브 타이핑 및 약물 개발에 잠재적인 응용 프로그램을 가지고 있습니다.
QMI 항체 패널을 조립하기 위해, 초기 항체 스크리닝 및 선택 프로토콜은 아래 섹션 1에 기재되어 있다. 항체 패널이 확인되면, IP를 위한 자기 비드에 선택된 항체의 컨쥬게이션을 위한 프로토콜, 그리고 선택된 프로브 항체의 생체 측질화를 위한, 섹션 2에서 기술된다. 세포 또는 조직 용해에 대한 QMI 분석을 실행하기 위한 프로토콜은 섹션 3에 기재되어 있다. 마지막으로 단일 실험에서는 ~5 x105개의 개별 데이터 포인트를 생성할 수 있기 때문에 데이터 처리, 분석 및 시각화를 지원하는 지침과 컴퓨터 코드가 섹션 4에 제공됩니다. 2-4절에 설명된 워크플로의 개요는 그림1에 나와 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well flat bottomed plates</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171025001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well PCR plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82006-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bioplex 200 System with HTF</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171000205</td>
			<td>modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bio-Plex Pro Wash Station</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">30034376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">BSA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">CML beads</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C37481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EDTA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">MagPlex Microspheres</td>
			<td style="width:121px;">Luminex</td>
			<td style="width:119px;">MC12xxx-01</td>
			<td>xxx is the 3 digit bead region</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Melon Gel IgG Spin Purification Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45206</td>
			<td>used for antibody purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:237px;">MES</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Microplate film, non-sterile</td>
			<td style="width:121px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2920-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Phosphotase inhibitor cocktail #2</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sandwich Prep Refrigerator</td>
			<td style="width:121px;">Norlake</td>
			<td>SMP 36 15</td>
			<td>for custom refrigeration of Bioplex 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Streptavidin-PE</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">405204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sulfo NHS</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Tris</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation

동적 단백질-단백질 상호 작용 제어 세포 행동, 운동성에서 DNA 복제 신호 변환에. 그러나, 단백질 상호 작용 네트워크에서 여러 단백질 간의 동적 상호 작용을 모니터링하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 여기에서, 우리는 노출에 의해 검출된 공유 복합체에 있는 단백질의 상대적인 형광 측정에 근거를 둔 단백질 상호 작용에 있는 배 변경의 정량적인 평가를 허용하는 정량적 멀티플렉스 면역 침전 (QMI)를 위한 프로토콜을 제시합니다 표면 에피토프 (PiSCES). QMI에서, 세포 용해물에서 단백질 복합체는 PiSCES의 풍부를 정량화하기 위하여 다른 단백질을 위한 표지된 항체로 그 때 마이크로스피어로 면역 침전되고, 그 때 조사됩니다. 면역 침전 항체는 다른 MagBead 스펙트럼 지구에 공액화되어 유동 세포계가 다중 병렬 면역 침전을 분화하고 동시에 각각과 관련된 프로브 항체의 양을 정량화할 수 있습니다. QMI는 유전 적 태깅을 필요로하지 않으며 다른 면역 침전 방법에 비해 최소한의 생체 재료를 사용하여 수행 할 수 있습니다. QMI는 상호 작용하는 단백질의 임의의 정의된 단에 적응될 수 있고, 지금까지 T 세포 및 신경 글루타메이트 시냅스에서 신호 네트워크를 특성화하는 데 사용되어 왔다. 결과는 잠재적인 진단 및 치료 응용을 가진 새로운 가설 생성으로 이끌어 냈습니다. 이 프로토콜에는 초기 항체 패널 선택부터 실행 분석 및 데이터 분석에 이르기까지 QMI를 수행하는 지침이 포함되어 있습니다. QMI 분석법의 초기 조립은 패널을 생성하는 스크리닝 항체를 포함하고, 경험적으로 적절한 라시스 완충액을 결정한다. 후속 시약 제제는 MagBeads에 면역 침전 항체를 공유결합하고, 생물항제 프로브 항체를 포함하므로 스트렙타비딘-컨쥬게이트 형광에 의해 표지될 수 있다. 분석기를 실행하기 위해, 매사염은 하룻밤 동안 MagBeads와 혼합된 다음, 구슬을 다른 프로브 항체로 분할 및 배양한 다음, 불소 라벨을, 및 유세포 분석으로 읽습니다. 두 가지 통계 테스트가 수행되어 실험 조건간에 크게 다른 PiSCES를 식별하며, 히트맵 또는 노드 에지 다이어그램을 사용하여 결과를 시각화합니다.

항체 스크리닝 그림 2 B는 코넥신36 단백질에 대한 스크린의 결과를 나타낸다. 대부분의 IP_probe 조합은 IgG 컨트롤에 대한 신호를 생성하지 않습니다. 단일클론 항체 1E5 및 1E5 또는 폴리클로날 항체(6200)를 가진 프로브를 가진 IP는 IgG 대조군과 비교하여 비드 분포에서 우회적인 변화를 일으킨다. 여기서, IP 1E5 및 프로브 6200poly는 IP 및 프로브와 동일?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 두 샘플 간의 표적 단백질-단백질 상호 작용의 풍부성에 대한 민감한 검출을 위해 유세포분석기를 사용합니다. QMI는 소량의 생체 물질을 사용하여 수행될 수 있고, 유전자 조작 태그를 필요로 하지 않으며, 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크에 적응될 수 있다.

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

정량적 멀티플렉스 공동 면역 침전물 또는 QMI를 사용하면 미리 정의된 단백질 상호 작용 네트워크에서 수백 개의 이진 상호 작용을 동시에 측정할 수 있습니다. 동일한 lysate에서 동시에 여러 공동 IP를 수행함으로써 생물 정보학 기술은 공동 연관 그룹이 조정 된 방식으로 어떻게 변화하는지 검사 할 수 있습니다. 분석은 개발하는 데 시간이 많이 걸리지만 QMI 패널이 네트워크 스케일에 들어가면 비교적 간단하게 하룻밤 사이에 신호 전달 시스템에 대해 수집할 수 있습니다.QMI는 96 웰 플레이트에 다른 샘플 및 시약의 정확한 파이펫팅이 필요합니다. 오류를 방지하기 위해 각 분석기를 설정하고 실행할 때주의 깊게 주의해야 합니다. 시료 제제 및 면역 침전을 위해, 얼음에 15 분 동안 프로테아제 와 인산 억제제와 적합한 세제에서 샘플을 lysing하여 시작합니다.인큐베이션의 끝에서, 멤브레인과 파편을 제거하고 표준 프로토콜에 따라 단백질 농도를 결정하기 위해 상체에 BCA 분석기를 수행하기 위해 샘플을 아래로 회전. 단백질 농도를 정상화한 후 각 클래스당 약 250개의 마그네틱 비드가 포함된 마그네틱 비드 마스터 믹스를 준비합니다. 자기 분리를 사용하여 플라이 P 버퍼에서 두 번 마그네틱 비드 믹스를 세척한 후 샘플당 플라이 P 버퍼 20 마이크로리터에서 구슬을 다시 분리합니다.철저한 파이펫팅 후, 시료당 20마이크로리터의 비드를 하나의 얼음 냉간 미세센심분리기 튜브에 넣고 면역 침전을 위해 각 튜브에 정규화된 단백질 농도와 동일한 양의 리세이트를 추가합니다. 그런 다음 각 lysate 샘플을 실행하는 각 플레이트에 대해 하나의 튜브로 나누고 빛으로부터 밤새 보호되는 섭씨 4도에서 회전기의 샘플을 면역 침전시합니다. 다음 날 아침, 마그네틱 비드 랙을 사용하여 첫 번째 튜브 세트에서 용액을 제거하고 세척당 얼음 차가운 플라이 P 버퍼 500 마이크로리터에서 구슬을 두 번 세척합니다.재서스펜션 부피를 계산한 후, 얼음 냉기 P 버퍼의 계산된 부피에서 면역침전염을 회수한다. 부드러운 파이펫팅으로 마그네틱 구슬을 철저히 재연하고 얼음 위에 평평한 바닥 96 웰 플레이트를 가로질러 우물당 25마이크로리터의 구슬을 분배합니다. 다른 96 웰 플레이트에서, 2회 작동 농도로 아티네이트 프로브 항체에 의해 희석한다.멀티채널 파이펫을 사용하여 각 프로브 항체 희석제 25마이크로리터를 분석 플레이트를 함유한 마그네틱 비드의 적절한 우물에 분배하고 수평 플레이트 셰이커에서 고속으로 흔들어 자기 비드를 혼합하고 재보펜한다. 혼합 후 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양 속도를 줄입니다. 인큐베이션이 끝나면 4°C의 마그네틱 플레이트 와셔에 세척당 신선한 플라이 P 버퍼로 플레이트를 세 번 씻습니다.마지막 세척 후, 플라이 P 버퍼에서 1~200을 희석한 스트렙타비딘 PE의 50 마이크로리터에서 구슬을 재연한다. 혼합물을 흔들고 빛으로부터 보호 30 분 동안 섭씨 4도에서 접시를 배양하기 전에 구슬을 다시 놓습니다. 인큐베이션이 끝나면, 4°C에서 마그네틱 플레이트 와셔에 플라이 P 버퍼로 플레이트를 세 번 세척하고 플라이 P 버퍼의 125 마이크로리터에서 구슬을 재놓습니다.900 회전에서 1 분 동안 접시를 흔들어 구슬을 철저히 재일시 중단하고 플레이트를 냉장고된 흐름 사이토미터에 로드합니다. 유량 사이토미터 소프트웨어에서 고RP1 대상 설정, 지역당 1, 000개의 비드의 정지 조건 및 80마이크로리터의 샘플 부피를 선택합니다. 중간쯤 에 실행을 일시 중지하고 침전을 방지하기 위해 구슬을 다시 일시 중지합니다.실행이 끝나면 데이터 파일을 XML 형식으로 내보냅니다. ANC 분석을 수행하려면 ANC 입력 파일을 작성하여 실험 설계의 세부 정보를 반영하고 프로그램을 실행하여 활성 디렉터리에 CSV 파일을 작성합니다. 파일이 조회수로 끝납니다.csv는 4개의 실험 복제 중 적어도 3개에서 대조군과 실험 조건 사이의 0.05의 거짓 양성 수준에서 현저하게 다른 단백질 공동 협회를 보고합니다. 가중 상관 관계 네트워크 분석을 위해 Mfi로 끝나는 Matlab에 의해 데이터 파일 출력의 열 제목을 붙여 넣습니다. csv는 새로운 스프레드시트의 첫 번째 열에 넣고 실험 적 치료 및 분석할 다른 변수를 위한 실험 횟수 및 치료를 위한 컬럼 실험을 추가합니다.이 파일을 특성으로 저장합니다. csv 및 오픈 R 스튜디오. 작업 디렉터리를 mfi가 포함된 폴더로 설정합니다.csv 와 특성. csv 파일, 코드의 섹션을 강조 표시하고 명령 입력을 누르고 주석 명령 파일에 표시된 대로 R 명령을 실행합니다. 각 실험 특성과 크게 상관관계가 있는 가중 상관 관계 네트워크 분석 모듈은 그래픽 파일로 출력되며 각 모듈과의 상호 상관 관계는 CSV 파일로 출력됩니다.ANC 출력 파일의 각 상호 작용에 대해 CNA에서 해당 상호 작용이 중요한지 확인하고 각 ANC 히트가 CNA 히트인지를 나타내는 새 열을 만듭니다. 값을 변환하여 두 배 변경으로 기록하고 모든 ANC 유니온 CNA 조회의 평균 값을 계산합니다. 마지막으로, 각 ANC 유니온 CNA 히트한 각 ANC 조합 CNA히트를 한 열의 면역 침전 목표, 두 번째 열의 프로브 대상 및 세 번째 열의 접이식 변경 값으로 만듭니다.이 파일을 네트워크로 Cytoscape로 가져와 노드 에지 다이어그램을 만듭니다. 두 개의 독립적인 통계 적 접근법에 의해 확인된 고신뢰도 단백질 상호 작용은 오픈 소스 소프트웨어, Cytoscape를 사용하여 노드 엣지 다이어그램또는 보충 자료에 포함된 R 코드 및 분석 지침을 사용하여 히트맵으로 시각화됩니다. 프로토콜 전반에 걸쳐 사용자는 파이펫을 정확하게 주의하고, 세심한 기록을 보관하고, 샘플을 항상 차갑게 유지해야 합니다.우리는 신호 변환 경로가 다른 입력 유형을 구별하고 다중 수용체에서 정보를 통합하는 방법을 이해하기 위해 QMI를 사용했다.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

연구

생화학

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Bio3D-web을 이용한 단백질 염기 서열 구조 역학 관계 조사

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

χCRAC를 사용하여 높은 시간 분해능에서 생체 내 단백질-RNA 상호 작용 역학 모니터링

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

단백질 티올 산화의 다중화 정량화를 위한 등압 탠덤 질량 태그 라벨링과 결합된 수지 보조 포획

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...