Name: quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation
Uploaded: 2019-08-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Forfatterne ønsker å erkjenne Tessa Davis for viktige bidrag til QMI analysen utvikling, og nåværende og tidligere medlemmer av Smith og Schrum laboratorier for teknisk veiledning og intellektuelle innspill. Dette arbeidet ble finansiert av NIMH tilskudd R01 MH113545 og r00 MH 102244.

1. analyse design
<ol><li>Utarbeidelse av kandidat antistoff<ol>
<li>For hvert protein av interesse, Velg 3 til 5 antistoffer til skjermen. Når det er mulig, bruk monoklonale antistoffer som gjenkjenner forskjellige epitopes. Inkluderer også en ikke-spesifikk kontroll antistoff.</li>
		<li>For å fjerne Tris, Utfør buffer utvekslingen ved å legge til antistoff i et 30-verdi Settings filter på kDa, spinn ned til minimums volumet, Legg til 500 μL av fosfat-bufret saltvann (PBS), og gjenta 3 ganger. For å fjerne tr...

<ol>
	<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rodr&#237;guez-Jorge, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+T+cell+receptor+and+Toll-like+receptor+5+signaling+for+CD4.">Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4.</a> Science Signaling. 12 (577), (2019).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), (2018).</li><li>Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+signaling+by+modular+adaptor+proteins.">Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).</li><li>Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+G+protein+signaling.">The many faces of G protein signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).</li><li>Lohse, M. J., Hofmann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Aspects+of+Signaling+by+G-Protein-Coupled+Receptors.">Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors.</a> Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).</li><li>Eltschinger, S., Loewith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOR+Complexes+and+the+Maintenance+of+Cellular+Homeostasis.">TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis.</a> Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).</li><li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theoretical+framework+for+specificity+in+cell+signaling.">A theoretical framework for specificity in cell signaling.</a> Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+and+Specificity+in+Signal+Transduction+via+Physiologic+Protein+Interaction+Networks.">Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks.</a> Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).</li><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+essentials:+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks.">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).</li><li>Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+in+the+endoplasmic+reticulum+unfolded+protein+response.">Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).</li><li>Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Iron+Homeostasis:+New+Players+in+Metabolism,+Cell+Death,+and+Disease.">Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+matrix+network+analysis+of+protein+complexes+in+the+human+TCR+signalosome.">Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome.</a> Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).</li><li>Schrum, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Science's STKE. 2007 (389), (2007).</li><li>Brown, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+the+autisms+using+glutamate+synapse+protein+interaction+networks+from+cortical+and+hippocampal+tissue+of+seven+mouse+models.">Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models.</a> Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).</li><li>Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+induces+input-specific+rearrangements+in+a+targeted+synaptic+protein+interaction+network.">Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network.</a> Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+protein+complexes+isolated+from+primary+human+skin-resident+T+cells+can+be+analysed+by+Multiplex+IP-FCM.">Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM.</a> Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).</li><li>Neier, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+proximal+&#945;&#946;+TCR+signalosome+specifies+thymic+selection+outcome+through+a+quantitative+protein+interaction+network.">The early proximal &#945;&#946; TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network.</a> Science Immunology. 4 (32), (2019).</li><li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM:+immunoprecipitation+detected+by+flow+cytometry.">IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM+measures+physiologic+protein-protein+interactions+modulated+by+signal+transduction+and+small-molecule+drug+inhibition.">IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition.</a> PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).</li><li>Lautz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+changes+in+synaptic+protein+complex+composition+are+consistent+in+different+detergents+despite+differential+solubility.">Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility.</a> BioRXiv. , (2019).</li><li>Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WGCNA:+an+R+package+for+weighted+correlation+network+analysis.">WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis.</a> BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+bivalency+observed+among+TCR/CD3+complexes+isolated+from+primary+T+cells.">Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells.</a> Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).</li></ol>

Den QMI analysen krever betydelige investeringer i antistoff panel utvikling, utstyr og reagenser, men når analysen er etablert, kan man samle høy-dimensjonale data observere protein interaksjon nettverk som de reagerer på eksperimentelt-kontrollerte Stimuli. Teknisk sett krever QMI nøye pipettering og sporing av prøve-og antistoff brønn steder. Nøye merking analysen platene er nyttig, som gjør en detaljert mal av brønn steder på papir, som deretter lagres for dataanalyse. Viktigheten av å holde perlene og lys...

Dynamisk protein-protein interaksjoner utgjør den molekylære signalering kaskader og aktive strukturer som er funksjonell basis for de fleste cellulære fysiologi1. Disse prosessene er ofte avbildet som lineær signalering trasé som veksler mellom Steady stater basert på enkelt innganger, men eksperimentelle og modellering data tydelig viser at de fungerer som integrerte nettverk2,3, 4. i tilfelle av G proteiner, ulike reseptorer har ofte muligheten til å aktivere samme G protein, og en enkelt reseptor kan også aktivere mer enn én type G protein5,6. For at relativt lite antall G protein klasser spesielt modulere et stort utvalg av cellulære funksjoner som Synaptic overføring, hormon regulering, og celle migrasjon, må cellene både integrere og differensiere disse signalene4 , 5. bevis har vist at dette signalet spesifisitet, for G proteiner så vel som andre, er først og fremst avledet på grunnlag av finjusterte protein-protein interaksjoner og deres timelige dynamikk1,3, 4 andre priser , 5 andre priser , 6 andre priser , 7. fordi signalering nettverk består av dynamiske protein komplekser med flere innganger, utganger, og feedback looper, en enkelt forstyrrelsene har mulighet til å endre den samlede homøostatisk balansen i en celle fysiologi4 ,7. Det er nå allment enighet om at signalering bør undersøkes fra et nettverk perspektiv for å bedre forstå hvordan integreringen av flere innganger kontroller diskret cellulære funksjoner i helse og sykdom7,8, 9,10,11,12,13. I lys av dette, ble kvantitativ multiplex Immunutfelling (QMI) utviklet for å samle middels gjennomstrømning, kvantitative data om fold endringer i dynamiske protein interaksjon nettverk.
QMI er et antistoff-basert analyse der cellen lysat er inkubert med et panel av immunutfelling antistoffer som er covalently koplet til magnetiske perler som inneholder distinkte prosenter av fluorescerende fargestoffer. Etter å ha spesifikke antistoffer koplet til distinkte magnetiske bead klasser tillater samtidig co-immunutfelling av flere mål proteiner fra samme lysat. Etter immunutfelling (IP) er magnetiske perler inkubert med et sekund, fluoroforen sonde antistoff (eller biotinylated antistoff i forbindelse med fluoroforen-bøyd streptavidin). Co-foreninger mellom proteiner gjenkjent av hvert IP antistoff-sonde antistoff par, eller Fiskene (proteiner i delte komplekser oppdages av utsatte overflate epitopes), blir deretter oppdaget av Flow flowcytometri og kan kvantitativt sammenlignet mellom ulike eksempel vilkår14. Illustrasjoner i figur 1 viser trinnene involvert i å kjøre en QMI-analysen, inkludert et diagram av magnetiske perler med immunoprecipitated protein komplekser merket av fluorescensmerkete bøyd sonde antistoffer (figur 1C).
Følsomheten til QMI avhenger av protein konsentrasjonen av lysat i forhold til antall magnetiske perler som brukes til immunutfelling, og oppnå en oppløsning for å oppdage 10% fold endringer krever bare en liten mengde Start materiale i forhold til andre co-IP metoder14,15. For eksempel er mengden av Start materiale som brukes i QMI lik som kreves for en sandwich enzym-koblet Immunosorbentanalyse-analysen (ELISA), men flere interaksjoner er oppdaget i en enkelt QMI-analysen. QMI analyser med 20 IPs og 20 sonde mål har blitt utført med 1-5 x 105 primær T-celler isolert fra en 4 mm hud biopsi, P2 synaptosomal preparater fra en 3 mm koronale del av musen prefrontal cortex, eller 3 x 106 kultivert mus primære kortikale neurons14,16,17. Denne følsomheten gjør QMI nyttig for analyse av celler eller vev med begrenset tilgjengelighet, for eksempel kliniske prøver.
QMI kan tilpasses for alle tidligere definerte protein interaksjon nettverk (forutsatt at antistoffer er tilgjengelig), og hittil er utviklet for å analysere T celle antigen reseptor (TCR) signalosome og et delsett av proteiner på glutamatergic synapser i neurons 17 i , 18. i studier av T celle reseptor SIGNALERING, QMI ble først brukt til å identifisere stimulering-indusert endringer i Fiskene, og deretter å skille autoimmune pasienter fra en kontrollgruppe, oppdage endogene autoimmune signalering, og til slutt å generere en hypotese som involverer en ubalansert sykdom-assosiert subnettverket av interaksjoner14. Flere nylig, det samme QMI panelet ble brukt til å fastslå at thymocyte utvalg bestemmes av kvantitative snarere enn kvalitative forskjeller i TCR-Associated protein signalering19. I neurons, QMI ble brukt til å beskrive input-spesifikke omorganisering av et protein interaksjon nettverk for forskjellige typer inngangssignaler på en måte som støtter nylig nye modeller av Synaptic plastisitet17. I tillegg er dette Synaptic QMI panelet ble brukt til å identifisere forskjeller i syv musemodeller av autisme, klynge modellene i undergrupper basert på deres Fiskene biosignatures, og nøyaktig hypothesize en felles molekylær underskudd som tidligere var ugjenkjennelig i en av modellene16. En lignende tilnærming kan brukes til skjerm for andre undergrupper som kan reagere på ulike rusmiddel behandlinger, eller tildele medikamenter til spesifikke responsive undergrupper. QMI har potensielle applikasjoner innen diagnostikk, pasient under skriving og narkotika utvikling, i tillegg til grunnleggende vitenskap.
For å sette sammen et QMI antistoff panel, er første antistoff-screening og utvalgs protokoller beskrevet i avsnitt 1 nedenfor. Når antistoff paneler er identifisert, er protokoller for Bøyning av de utvalgte antistoffer mot magnetiske perler for IP, og for biotinylation av de valgte sonde antistoffer, beskrevet i avsnitt 2. Protokollen for å kjøre QMI-analysen på celle-eller vevs lysater er beskrevet i avsnitt 3. Til slutt, siden et enkelt eksperiment kan generere ~ 5 x 105 individuelle datapoints, instruksjoner og datamaskinkoder for å bistå i databehandling, analyse og visualisering er gitt i § 4. En oversikt over arbeidsflyten som er beskrevet i avsnittene 2-4, vises i figur 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well flat bottomed plates</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171025001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well PCR plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82006-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bioplex 200 System with HTF</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171000205</td>
			<td>modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bio-Plex Pro Wash Station</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">30034376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">BSA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">CML beads</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C37481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EDTA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">MagPlex Microspheres</td>
			<td style="width:121px;">Luminex</td>
			<td style="width:119px;">MC12xxx-01</td>
			<td>xxx is the 3 digit bead region</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Melon Gel IgG Spin Purification Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45206</td>
			<td>used for antibody purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:237px;">MES</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Microplate film, non-sterile</td>
			<td style="width:121px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2920-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Phosphotase inhibitor cocktail #2</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sandwich Prep Refrigerator</td>
			<td style="width:121px;">Norlake</td>
			<td>SMP 36 15</td>
			<td>for custom refrigeration of Bioplex 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Streptavidin-PE</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">405204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sulfo NHS</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Tris</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation

Dynamisk protein-protein interaksjoner kontroll cellulære atferd, fra motilitet til DNA replikering til signal Transduction. Det er imidlertid teknisk vanskelig å overvåke dynamisk samhandling mellom flere proteiner i et protein interaksjons nettverk. Her presenterer vi en protokoll for kvantitativ multiplex Immunutfelling (QMI), som tillater kvantitativ vurdering av fold endringer i protein interaksjoner basert på relative fluorescens målinger av proteiner i delte komplekser oppdaget av Exposed Overflate epitopes (Fiskene). I QMI, protein komplekser fra celle lysater er immunoprecipitated på mikrosfærer, og deretter analysert med en merket antistoff for et annet protein for å kvantifisere overflod av fiskene. Immunutfelling antistoffer blir bøyd til forskjellige MagBead Spectral regioner, som tillater en strømnings flowcytometer å differensiere flere parallelle immunoprecipitations og samtidig kvantifisere mengden av sonde antistoff knyttet til hver. QMI krever ikke genetisk merking og kan utføres ved hjelp av minimale biomaterialet sammenlignet med andre immunutfelling metoder. QMI kan tilpasses for enhver definert gruppe av samspill proteiner, og har hittil blitt brukt til å karakterisere signalering nettverk i T-celler og neuronal glutamat synapser. Resultatene har ført til ny hypotese generasjon med potensielle diagnostiske og terapeutiske programmer. Denne protokollen inneholder instruksjoner for å utføre QMI, fra det første antistoff panel valget gjennom å kjøre analyser og analysere data. Den første monteringen av en QMI analysen innebærer screening antistoffer for å generere et panel, og empirisk bestemme en passende lyseringsbuffer. Den påfølgende reagens forberedelsen inkluderer covalently kopling immunutfelling antistoffer mot MagBeads, og biotinylating sonde antistoffer slik at de kan merkes med en streptavidin fluoroforen. For å kjøre analysen, er lysat blandet med MagBeads over natten, og deretter perler er delt og inkubert med forskjellige sonde antistoffer, og deretter en fluoroforen etikett, og leses av flyt flowcytometri. To statistiske tester er utført for å identifisere Fiskene som avviker betydelig mellom eksperimentelle forhold, og resultatene er visualisere ved hjelp av heatmaps eller node-Edge diagrammer.

Antistoff screening Figur 2 B viser resultatene av en skjerm for proteinet Connexin36. De fleste IP_probe-kombinasjoner gir ingen signal over IgG-kontroller. IP med monoklonale antistoff 1E5 og sonde med enten 1E5 eller polyklonale antistoff 6200 produserer en høyre forskyvning i perle fordelingen sammenlignet med IgG-kontroller. Her ble IP 1E5 og sonde 6200poly valgt for å unngå å bruke samme antistoff som IP og sonde, både for å redusere sannsynli...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantitativ multiplex Immunutfelling (QMI) bruker flyt flowcytometri for følsom påvisning av forskjeller i overflod av målrettede protein-protein interaksjoner mellom to prøver. QMI kan utføres ved hjelp av en liten mengde biomaterialet, krever ikke genetisk konstruerte koder, og kan tilpasses for alle tidligere definerte protein interaksjon nettverk.

Kvantifisering av protein samspill nettverk dynamikk ved hjelp av multiplekset co-Immunutfelling

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Kvantitativ multipleksed co-immunoprecipitation, eller QMI, gjør det mulig for brukere å samtidig måle hundrevis av binære interaksjoner i et forhåndsdefinert protein interaksjonsnettverk. Ved å utføre flere co-IPer samtidig i samme lysate, kan bioinformatikkteknikker deretter undersøke hvordan grupper av samforeninger endres på en koordinert måte. Analysen er tidkrevende å utvikle, men når QMI-panelet er i håndnettverksskaladata kan samles inn om signaltransduksjonssystemer i en relativt enkelt enkelt overnattingsanalyse.QMI krever nøyaktig pipettering av forskjellige prøver og reagenser i 96 brønnplater. Det bør tas forsiktige notater når du konfigurerer og kjører hver analyse for å forhindre feil. For prøveforberedelse og immunforefall, begynn med å lyse prøven i et egnet vaskemiddel med protease- og fosfatasehemmere for en 15 minutters inkubasjon på is.På slutten av inkubasjonen, spinn ned prøven for å fjerne membraner og rusk og utføre en BCA-analyse på det overnaturlige for å bestemme proteinkonsentrasjonen i henhold til standardprotokoller. Etter normalisering av proteinkonsentrasjonene, lag en magnetisk perlemesterblanding som inneholder ca. 250 magnetiske perler av hver klasse per brønn. Bruk magnetisk separasjon til å vaske den magnetiske perleblandingen to ganger i Fly P-bufferen før du gjenbruker perlene i 20 mikroliter Fly P-buffer per prøve.Etter en grundig pipettering, aliquot 20 mikroliter perler i en iskald mikrocentrifuge rør per prøve og legge like mengder lysate med normaliserte proteinkonsentrasjoner til hvert rør for immunoprecipitation. Del deretter hver lysateprøve i ett rør for hver plate som kjøres og immundeprecipitate prøvene på en rotator ved fire grader Celsius over natten beskyttet mot lys. Neste morgen bruker du et magnetisk perlestativ for å fjerne lysatet fra det første settet med rør og vaske perlene to ganger i 500 mikroliter iskald Fly P-buffer per vask.Etter beregning av resuspensjonsvolumet, gjenbruker immunoprecipitates i det beregnede volumet av iskald Fly P-buffer. Gjenoppus de magnetiske perlene grundig ved mild pipettering og fordel 25 mikroliter per brønn over en flat bunnet 96 brønnplate på is. I en annen 96 brønnplate, fortynnes ved attinilated sondeantistoffer til en to ganger arbeidskonsentrasjon.Bruk en flerkanals pipette til å fordele 25 mikroliter av hver sonde antistofffortynning i de riktige brønnene til den magnetiske perlen som inneholder analyseplate og rist ved høy hastighet på en horisontal plateshaker for å blande og gjenbruke de magnetiske perlene. Etter blanding, redusere hastigheten for en time inkubasjon ved fire grader Celsius beskyttet mot lys. På slutten av inkubasjonen, vask platen tre ganger med fersk Fly P buffer per vask på en magnetisk plate vaskemaskin ved fire grader Celsius.Etter siste vask, resuspend perlene i 50 mikroliter streptavidin PE fortynnet en til 200 i Fly P buffer. Rist blandingen og resuspend perlene før du inkuberer platen ved fire grader Celsius i 30 minutter beskyttet mot lys. På slutten av inkubasjonen, vask platen tre ganger med Fly P-buffer på en magnetisk platevaskeskiven ved fire grader Celsius og gjenoppusser perlene i 125 mikroliter Fly P-buffer.Rist platen i ett minutt ved 900 rotasjoner for å grundig bruke perlene grundig og laste platen inn i et omridgerated strømningscytometer. I strømningssytometerprogramvaren velger du Høy RP1-målinnstilling, en stoppbetingelse på 1000 perler perler per region og et prøvevolum på 80 mikroliter. Pause løpet halvveis gjennom og resuspend perlene for å hindre bosetting.På slutten av kjøringen eksporterer du datafilene i XML-formatet. For å utføre ANC-analyse, fyll ut ANC-inndatafilen for å gjenspeile detaljene i eksperimentell design og kjøre programmet, som vil skrive en CSV-fil inn i active directory. Filen som slutter på treff.csv vil rapportere protein co-assosiasjoner som er betydelig forskjellige på et falskt positivt nivå på 0,05 mellom kontroll og eksperimentelle forhold i minst tre av fire eksperimentelle repliker. For vektet korrelasjonsnettverksanalyse limer du inn kolonnetitlene på datafilutdataene etter Matlab som slutter på mfi. csv i den første kolonnen i et nytt regneark og legge til kolonnene Eksperimenter for eksperimentnummer og behandling for eksperimentell behandling og eventuelle andre variabler som skal analyseres.Lagre denne filen som egenskaper. csv og åpne R Studio. Sett arbeidsmappen til en mappe som inneholder mfi.csv og egenskaper. csv-filer, uthev deler av koden og trykk Kommando Enter for å kjøre R-kommandoene som angitt i den kommenterte kommandofilen. De vektede korrelasjonsnettverksanalysemodulene som er betydelig korrelert med hver eksperimentell egenskap, vil bli utdata som en grafisk fil, og korrelasjonen mellom hver interaksjon med hver modul vil bli utdatat som en CSV-fil.For hver samhandling i ANC-utdatafilen, identifiser om denne samhandlingen også er betydelig av CNA og opprett en ny kolonne som angir om hvert ANC-treff også er et CNA-treff. Konverter verdiene til å logge to ganger endring og beregne gjennomsnittsverdien for alle ANC union CNA treff. Til slutt, lage et nytt regneark med hver ANC union CNA truffet oppført av sin immunoprecipitation mål i en kolonne, sin sonde mål i den andre kolonnen, og dens fold endringsverdi i den tredje kolonnen.Importer denne filen til Cytoscape som et nettverk for å opprette et nodekantdiagram. Proteininteraksjoner med høy tillit identifisert av de to uavhengige statistiske tilnærmingene visualiseres som nodekantdiagrammer ved hjelp av åpen kildekode-programvaren, Cytoscape, eller som varmekart ved hjelp av R-kode- og analyseinstruksjonene som inngår i tilleggsmaterialet. Gjennom hele protokollen må brukerne ta vare på pipetten nøyaktig, holde grundige poster, og for å holde prøvene kalde til enhver tid.Vi har brukt QMI til å forstå hvordan signaltransduksjonsveier skiller mellom ulike inndatatyper og integrerer informasjon fra flere reseptorer.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisering av Protein-protein Interaksjon i Kjerne- og cytoplasmatiske Fraksjoner av Co-immunoprecipitation og<em&gt; In Situ</em&gt; Nærhet hemorroider Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Undersøkelse av protein-sekvens-struktur-dynamikk Relasjoner med Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantifisering av Protein Homo-oligomerization med kommersielle instrumentering og gratis, åpen kildekode lysstyrke analyseprogramvare

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom hele kvantifisering av merking homogenitet på ett molekyl nivå

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Overvåking av protein-RNA-interaksjonsdynamikk in vivo ved høy temporal oppløsning ved bruk av χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membran Nanopartikler System for membran Protein-Protein Interaksjon Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Harpiksassistert fangst kombinert med isobarisk tandemmassemerkemerking for multiplekset kvantifisering av proteintioloksidasjon

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...