Name: quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation
Uploaded: 2019-08-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить Тесса Дэвис за важный вклад в развитие исследования ЗМИ, а также нынешних и бывших членов лабораторий Смита и Шрума за техническое руководство и интеллектуальный вклад. Эта работа финансировалась NIMH гранты R01 MH113545 и R00 MH 102244.

1. Ассаи дизайн
<ol><li>Препарат антитела кандидата<ol>
<li>Для каждого интересуемого белка выберите от 3 до 5 антител для проверки. Когда это возможно, используйте моноклональные антитела, которые распознают различные эпитопы. Также включите одно неспецифическое антитело управления.</li>
		<li>Ч...

<ol>
	<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rodr&#237;guez-Jorge, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+T+cell+receptor+and+Toll-like+receptor+5+signaling+for+CD4.">Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4.</a> Science Signaling. 12 (577), (2019).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), (2018).</li><li>Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+signaling+by+modular+adaptor+proteins.">Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).</li><li>Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+G+protein+signaling.">The many faces of G protein signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).</li><li>Lohse, M. J., Hofmann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Aspects+of+Signaling+by+G-Protein-Coupled+Receptors.">Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors.</a> Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).</li><li>Eltschinger, S., Loewith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOR+Complexes+and+the+Maintenance+of+Cellular+Homeostasis.">TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis.</a> Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).</li><li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theoretical+framework+for+specificity+in+cell+signaling.">A theoretical framework for specificity in cell signaling.</a> Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+and+Specificity+in+Signal+Transduction+via+Physiologic+Protein+Interaction+Networks.">Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks.</a> Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).</li><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+essentials:+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks.">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).</li><li>Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+in+the+endoplasmic+reticulum+unfolded+protein+response.">Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).</li><li>Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Iron+Homeostasis:+New+Players+in+Metabolism,+Cell+Death,+and+Disease.">Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+matrix+network+analysis+of+protein+complexes+in+the+human+TCR+signalosome.">Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome.</a> Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).</li><li>Schrum, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Science's STKE. 2007 (389), (2007).</li><li>Brown, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+the+autisms+using+glutamate+synapse+protein+interaction+networks+from+cortical+and+hippocampal+tissue+of+seven+mouse+models.">Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models.</a> Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).</li><li>Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+induces+input-specific+rearrangements+in+a+targeted+synaptic+protein+interaction+network.">Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network.</a> Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+protein+complexes+isolated+from+primary+human+skin-resident+T+cells+can+be+analysed+by+Multiplex+IP-FCM.">Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM.</a> Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).</li><li>Neier, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+proximal+&#945;&#946;+TCR+signalosome+specifies+thymic+selection+outcome+through+a+quantitative+protein+interaction+network.">The early proximal &#945;&#946; TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network.</a> Science Immunology. 4 (32), (2019).</li><li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM:+immunoprecipitation+detected+by+flow+cytometry.">IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM+measures+physiologic+protein-protein+interactions+modulated+by+signal+transduction+and+small-molecule+drug+inhibition.">IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition.</a> PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).</li><li>Lautz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+changes+in+synaptic+protein+complex+composition+are+consistent+in+different+detergents+despite+differential+solubility.">Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility.</a> BioRXiv. , (2019).</li><li>Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WGCNA:+an+R+package+for+weighted+correlation+network+analysis.">WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis.</a> BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+bivalency+observed+among+TCR/CD3+complexes+isolated+from+primary+T+cells.">Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells.</a> Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).</li></ol>

Анализ ЗМИ требует значительных инвестиций в разработку антител панели, оборудование и реагенты, но как только анализ установлен, можно собирать высокомерные данные наблюдения белковых сетей взаимодействия, как они реагируют на экспериментально контролируемых Стимулы. Технически, З?...

Динамические белково-белковые взаимодействия представляют собой молекулярные сигнальные каскады имотил-структуры, которые являются функциональной основой большинства клеточной физиологии 1. Эти процессы часто изображаются как линейные сигнальные пути, которые переключаются между устойчивыми состояниями на основе одного ввода, но экспериментальные и модельные данные ясно показывают, что они функционируют как интегрированные сети2,3, 4. В случае G белков, различные рецепторы часто имеют возможность активировать тот же белок G, и один рецептор может также активировать более одного типа белка G5,6. Для того, чтобы относительно небольшое количество классов белка G специально модулировать широкий спектр клеточных функций, таких как синаптическая передача, гормональная регуляция, и миграция клеток, клетки должны как интегрировать и дифференцировать эти сигналы4 , 5. Доказательства показали, что эта специфичность сигнала, для G белков, а также другие, в первую очередь происходит на основе тонко настроенных белково-белковых взаимодействий и их височной динамики1,3, 4 , 5 , 6 , 7. Поскольку сигнальные сети состоят из динамических белковых комплексов с несколькими входными данными, выходами и циклами обратной связи, одно возмущение имеет возможность изменить общий гомеостатический баланс физиологии клетки4 ,7. В настоящее время широко ели, что сигнализация должна быть рассмотрена с точки зрения сети, с тем чтобы лучше понять, как интеграция нескольких входов контролирует дискретные клеточные функции в области здравоохранения и болезни7,8, 9,10,11,12,13. В свете этого, Количественный мультиплекс иммунопреципсии (ЗМИ) был разработан для сбора средней пропускной связи, количественные данные об изменениях раза в динамических сетей взаимодействия белка.
ЗМИ является антитела основе анализ, в котором клеточный лизат инкубируется с панелью иммунопрецит антител, которые ковалентно связаны с магнитными бусинами, содержащими различные соотношения флуоресцентных красителей. Наличие специфических антител в сочетании с отдельными классами магнитного биса позволяет одновременно со-иммунопрецитировать несколько белков-мишеней из одного и того же лизата. После иммунопреципиции (IP), магнитные бусы инкубируются со вторым, фторофор-конъюгированных антитела зонда (или биотинилаповые антитела в сочетании с фторофором-конъюгированный стрептавидин). Со-ассоциации между белками, распознаемыми каждой антител-зондом IP, или PiSCES (белки в общих комплексах, обнаруженных открытыми поверхностными эпитопами), затем обнаруживаются цитометрией потока и могут быть количественно сопоставлены между различными условия выборки14. Иллюстрации на рисунке 1 показывают шаги, участвующие в запуске анализом ЗМИ, в том числе диаграмму магнитных бусин с иммунопромизированными белковыми комплексами, помеченными флуоресцентно спряженных антителами зонда (рисунок1C).
Чувствительность ЗМИ зависит от концентрации белка лизата относительно количества магнитных бусин, используемых для иммунопрециционности, и достижение разрешения для обнаружения 10% раз изменения требует лишь небольшое количество исходного материала по сравнению с другими методы совместного IP14,15. Например, количество исходного материала, используемого в ЗМИ, аналогично тому, которое требуется для сэндвича Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), но несколько взаимодействий обнаруживаются в одном анализе ЗМИ. Анализы с использованием 20 IPs и 20 целей зонда были выполнены с использованием 1-5 х 105 первичных Т-клеток, изолированных от биопсии кожи 4 мм, Синаптосомные препараты P2 из 3 мм корональной секции мыши префронтальной коры, или 3 х 106 культивированных мышей первичной корковых нейронов14,16,17. Эта чувствительность делает ЗМИ полезным для анализа клеток или тканей с ограниченной доступностью, таких как клинические образцы.
ЗМИ может быть адаптирована для любой ранее определенной сети взаимодействия белков (при условии, что антитела доступны), и на сегодняшний день была разработана для анализа Т-клеточного рецептора антигена (TCR) сигналосомы и подмножество белков на глутаматергических синапсов в нейронах 17 Лет , 18. В исследованиях Сигнализирующих рецепторов Т-клеток, ЗМИ был впервые использован для выявления вызванных стимуляцией изменений в PiSCES, а затем, чтобы отличить аутоиммунных пациентов от контрольной группы, обнаружить эндогенные аутоиммунные сигнализации, и, наконец, для создания гипотеза, связанная с несбалансированной болезнью, связанной с подсетью взаимодействий14. Совсем недавно, та же панель ЗМИ была использована для определения того, что выбор тимоцита определяется количественными, а не качественными различиями в TCR-ассоциированного белка сигнализации19. В нейронах, ЗМИ был использован для описания входной конкретной перестановки сети взаимодействия белка для различных типов входных сигналов таким образом, который поддерживает вновь возникающих моделей синаптической пластичности17. Кроме того, эта синаптическая панель ЗМИ была использована для выявления различий в семи моделях мыши аутизма, кластера моделей в подгруппы на основе их PiSCES биоподписей, и точно предположить общий молекулярный дефицит, который был ранее непризнанным в одной из моделей16. Аналогичный подход можно было бы использовать для проверки других подгрупп, которые могли бы реагировать на различные методы лечения наркомании, или назначать лекарства конкретным адаптивным подгруппам. В дополнение к фундаментальной науке, помимо фундаментальной науки, у компании «МИ» есть потенциальное применение в области диагностики, субтипирования пациентов и разработки лекарственных средств.
Для того чтобы собрать панель антитела зМИ, начальные протоколы скрининга антител и выбора описаны в разделе 1, ниже. После выявления панелей антител в разделе 2 описаны протоколы спряжения выбранных антител к магнитным бусинам для ИС и биотинилации выбранных антител зонда. Протокол для запуска анализа ЗМИ на лисаты клеток или тканей описан в разделе 3. Наконец, поскольку один эксперимент может генерировать отдельные точки данных в размере 5 х 10 5, в разделе 4 предусмотрены инструкции и компьютерные коды для оказания помощи в обработке данных, анализе и визуализации. Обзор рабочего процесса, описанного в разделах 2-4, показан на рисунке 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well flat bottomed plates</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171025001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well PCR plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82006-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bioplex 200 System with HTF</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171000205</td>
			<td>modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bio-Plex Pro Wash Station</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">30034376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">BSA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">CML beads</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C37481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EDTA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">MagPlex Microspheres</td>
			<td style="width:121px;">Luminex</td>
			<td style="width:119px;">MC12xxx-01</td>
			<td>xxx is the 3 digit bead region</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Melon Gel IgG Spin Purification Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45206</td>
			<td>used for antibody purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:237px;">MES</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Microplate film, non-sterile</td>
			<td style="width:121px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2920-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Phosphotase inhibitor cocktail #2</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sandwich Prep Refrigerator</td>
			<td style="width:121px;">Norlake</td>
			<td>SMP 36 15</td>
			<td>for custom refrigeration of Bioplex 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Streptavidin-PE</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">405204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sulfo NHS</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Tris</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation

Динамические белково-белковые взаимодействия контролируют клеточное поведение, от подвижности до репликации ДНК и сигнала трансдукции. Однако, мониторинг динамических взаимодействий между несколькими белками в сети взаимодействия белка технически трудно. Здесь мы представляем протокол количественного мультиплексного иммунопрециционного протеина (ЗМИ), который позволяет количественно оценивать изменения складов в белковых взаимодействиях на основе относительных измерений флуоресценции белков в общих комплексах, обнаруженных exposed Поверхностные эпитопы (PiSCES). В ЗМИ белковые комплексы из клеточных лисатов иммунопронифицируются на микросферы, а затем исследуются с помеченным антителом для другого белка, чтобы количественно оставить PiSCES. Иммунопрефференционные антитела спрягаются с различными спектральными областями MagBead, что позволяет цитометро потока дифференцировать несколько параллельных иммунопрециций и одновременно количественно количество антител зонда, связанных с каждым из них. ЗМИ не требует генетической маркировки и может быть выполнена с использованием минимального биоматериала по сравнению с другими методами иммунопреципции. ЗМИ может быть адаптирован атлетировал для любой определенной группы взаимодействующих белков, и до сих пор использовался для характеристики сигнальных сетей в Т-клетках и нейрональных синапсах глутамата. Результаты привели к порождению новых гипотез с потенциальным диагностическим и терапевтическим применением. Этот протокол включает в себя инструкции для выполнения ЗМИ, от первоначального выбора панели антител до беговых анализов и анализа данных. Первоначальная сборка асссея ЗМИ включает скрининговых антител для создания панели и эмпирически определение соответствующего буфера лиза. Последующий препарат реагента включает в себя ковалентно екосочетание иммунопрецитификации антител к MagBeads, и биотинилатации антител зонда, чтобы они могли быть помечены стрептавидин-конъюгированный фторофор. Для запуска асса, lysate смешивается с MagBeads ночь, а затем бисер делятся и инкубируются с различными антителами зонда, а затем флюорофор этикетки, и читать поток цитометрии. Для выявления PiSCES, которые значительно различаются между экспериментальными условиями, проводятся два статистических теста, и результаты визуализироваться с помощью тепловых карт или диаграмм узла.

Скрининг антител Рисунок 2 B показывает результаты экрана для белка Connexin36. Большинство комбинаций IP-зондов не производят сигнала над элементами управления IgG. IP с моноклональным антителом 1E5 и зондом с 1E5 или поликлональным антителом 6200 производит сдв...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Количественный мультиплекс иммунопрецитификации (ЗМИ) использует поток цитометрии для чувствительного обнаружения различий в изобилии целевых белково-белковых взаимодействий между двумя образцами. ЗМИ может быть выполнена с использованием небольшого количества биоматериала, не требует генетически модифицированных тегов, и может быть адаптирована для любой ранее определенной сети взаимодействия белка.

Количественная оценка динамики взаимодействия белков с использованием мультиплексного со-иммунопрециации

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Количественная мультиплексированная ко-иммунопреципиентация, или ЗМИ, позволяет пользователям одновременно измерять сотни бинарных взаимодействий в предопределенной сети взаимодействия белка. Выполняя несколько со-IPs одновременно в том же лизе, биоинформатики методы могут затем изучить, как группы совместного объединения изменения в скоординированной основе. Анализ отнимая много времени на разработку, но как только панель qMI находится в руке, данные сетевого масштаба могут быть собраны о системах передачи сигналов в относительно просто ночном анализе.«МИ требует точного пипетки различных образцов и реагентов в 96 пластин. При настройке и запуске каждого анализа следует принимать осторожные заметки для предотвращения ошибок. Для подготовки образца и иммунопреципиентации, начните с облизывания образца в подходящем моющее средство с ингибиторами протеазы и фосфатазы в течение 15 минут инкубации на льду.В конце инкубации, спина вниз образца для удаления мембран и мусора и выполнить анализ BCA на супернатант, чтобы определить концентрацию белка в соответствии со стандартными протоколами. После нормализации концентрации белка, подготовить магнитный шарик мастер смесь, которая содержит около 250 магнитных бусин каждого класса на колодец. Используйте магнитное разделение для мытья магнитной смеси шарика два раза в буфере Fly P, прежде чем повторно использовать бисер в 20 микролитров буфера Fly P на образец.После тщательного пипетки, aliquot 20 микролитров бисера в одну ледяную микроцентрифугную трубку на образец и добавить равные объемы лизата с нормализованными концентрациями белка в каждой трубке для иммунопреципиентации. Затем разделите каждый образец лизата на одну трубку для каждой запущенной пластины и проясните образцы на ротаторе при четырех градусах Цельсия, защищенных от света. На следующее утро используйте магнитную стойку шарика, чтобы удалить лизат из первого набора трубок и мыть бисер два раза в 500 микролитров ледяной Fly P буфера за стирку.После расчета объема повторного получения, повторное использование иммунопрециатов в расчете объема ледяного буфера Fly P. Тщательно resuspend магнитные бусины нежной пипетки и распространять 25 микролитров бисера на колодец через плоский дном 96 хорошо пластины на льду. В другой пластине 96 хорошо, разбавленный attinilated антителами зонда к 2 временам работая концентрации.Используйте многоканальный пипетку для распределения 25 микролитров каждого зонда антитела разбавления в соответствующие скважины магнитной шарик, содержащий анализ пластины и встряхнуть на высокой скорости на горизонтальной шейкер пластины смешивать и повторно магнитных бусин. После смешивания, уменьшить скорость в течение одного часа инкубации на четыре градуса по Цельсию защищены от света. В конце инкубации, мыть пластину три раза со свежим буфером Fly P на стирку на магнитной шайбе пластины при четырех градусах по Цельсию.После последней стирки, повторно использовать бисер в 50 микролитров стрептавидина PE разбавленной от одного до 200 в буфере Fly P. Встряхните смесь и повторно поместите шарики перед инкубацией пластины при четырех градусах По Цельсию в течение 30 минут, защищенных от света. В конце инкубации трижды вымойте пластину буфером Fly P на шайбе магнитной пластины при четырех градусах по Цельсию и повторно помесив бисер в 125 микролитров буфера Fly P.Встряхните тарелку в течение одной минуты при 900 вращениях, чтобы тщательно повторно использовать бисер и загрузить пластину в рефрижерированный цитометр потока. В программном обеспечении цитометра потока выберите параметр High RP1 Target, состояние остановки 1000 бусин на область и объем выборки 80 микролитров. Пауза запустить на полпути через и повторно beads для предотвращения урегулирования.В конце запуска экспортировать файлы данных в формате XML. Для выполнения анализа АНК заполните входной файл АНК, чтобы отразить детали экспериментального проектирования и запустить программу, которая напишет файл CSV в активный каталог. Файл, заканчивающийся хитами.csv сообщит о со-ассоциациях протеина которые значительно друг на ложноположивном уровне 0.05 между управлением и экспериментальными условиями в по крайней мере 3 из 4 экспериментальных репликаций. Для взвешенного анализа сети корреляции вставьте заголовки столбца вывода файла данных Matlab, заканчивающийся в mfi. csv в первую колонку новой таблицы и добавить столбцы Эксперимент для эксперимента номер и лечение для экспериментального лечения и любых других переменных, которые будут проанализированы.Сохраните этот файл в качестве признаков. csv и открыть R Studio. Установите рабочий каталог на папку, содержащую мфо.csv и черты. csv файлы, выделить разделы кода, и ударил Команды Введите для запуска команд R, как указано в прокомментировал командный файл. Взвешенные модули сетевого анализа корреляции, значительно коррелированные с каждой экспериментальной чертой, будут выводиться в качестве графического файла, а корреляция каждого взаимодействия с каждым модулем будет выводиться в качестве файла CSV.Для каждого взаимодействия в файле вывода АНК определите, является ли это взаимодействие также значительным CNA, и создайте новую колонку, которая указывает, является ли каждый удар АНК также хитом CNA. Преобразование значений для изменения двухкратных раз и расчета среднего значения для всех хитов CNA профсоюза АНК. Наконец, сделайте новую таблицу с каждым хитом профсоюза АНК CNA, перечисленным его целью иммунопреципиентации в одной колонке, ее целью зонда во второй колонке и значением изменения складок в третьей колонке.Импорт этого файла в Cytoscape как сеть для создания диаграммы кромки узла. Взаимодействия белков высокой уверенности, выявленные двумя независимыми статистическими подходами, визуализируются как диаграммы кромок узла с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом Cytoscape или в качестве тепловых карт с использованием R-кода и инструкций по анализу, включенных в дополнительный материал. На протяжении всего протокола, пользователи должны заботиться, чтобы пипетки точно, вести тщательный учет, и держать образцы холодной во все времена.Мы использовали МИ, чтобы понять, как пути трансдукции сигнала различают различные типы входных данных и интегрируют информацию из нескольких рецепторов.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Визуализация белокбелковых взаимодействия в ядерной и цитоплазматических фракций Co-иммунопреципитации и<em&gt; В Ситу</em&gt; Пробирной Расстояние Лигирование

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Исследование последовательности протеинов-структуры-динамики Отношения с Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Калибровка бесплатно в Vitro количественная оценка белка гомо олигомеризации с использованием коммерческих приборов и свободным, открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа яркости

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Мониторинг динамики взаимодействия белок-РНК in vivo при высоком временном разрешении с использованием χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Родная клеточная мембрана наночастицы системы membrane белка-белкового взаимодействия анализа

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Улавливание с помощью смолы в сочетании с изобарической маркировкой тандемных масс-меток для мультиплексированной количественной оценки окисления тиола белка

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...