Name: quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation
Uploaded: 2019-08-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Los autores desean reconocer a Tessa Davis por sus importantes contribuciones al desarrollo del ensayo QMI, y a los miembros actuales y anteriores de los laboratorios Smith y Schrum por su orientación técnica y aportación intelectual. Este trabajo fue financiado por las subvenciones NIMH R01 MH113545 y R00 MH 102244.

1. Diseño de ensayos
<ol><li>Preparación de anticuerpos candidatos<ol>
<li>Para cada proteína de interés, elija de 3 a 5 anticuerpos para examinar. Cuando sea posible, utilice anticuerpos monoclonales que reconozcan diferentes epítopos. También incluya un anticuerpo de control no específico.</li>
		<li>Para eliminar Tris, realice el intercambio de búferes agregando el anticuerpo a un filtro de giro de 30 kDa, girando hacia abajo a su volumen mínimo, agregando 500 salinas con búfer de fosfato (PBS) y repitiend...

<ol>
	<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rodr&#237;guez-Jorge, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+T+cell+receptor+and+Toll-like+receptor+5+signaling+for+CD4.">Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4.</a> Science Signaling. 12 (577), (2019).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), (2018).</li><li>Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+signaling+by+modular+adaptor+proteins.">Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).</li><li>Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+G+protein+signaling.">The many faces of G protein signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).</li><li>Lohse, M. J., Hofmann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Aspects+of+Signaling+by+G-Protein-Coupled+Receptors.">Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors.</a> Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).</li><li>Eltschinger, S., Loewith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOR+Complexes+and+the+Maintenance+of+Cellular+Homeostasis.">TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis.</a> Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).</li><li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theoretical+framework+for+specificity+in+cell+signaling.">A theoretical framework for specificity in cell signaling.</a> Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+and+Specificity+in+Signal+Transduction+via+Physiologic+Protein+Interaction+Networks.">Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks.</a> Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).</li><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+essentials:+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks.">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).</li><li>Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+in+the+endoplasmic+reticulum+unfolded+protein+response.">Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).</li><li>Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Iron+Homeostasis:+New+Players+in+Metabolism,+Cell+Death,+and+Disease.">Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+matrix+network+analysis+of+protein+complexes+in+the+human+TCR+signalosome.">Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome.</a> Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).</li><li>Schrum, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Science's STKE. 2007 (389), (2007).</li><li>Brown, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+the+autisms+using+glutamate+synapse+protein+interaction+networks+from+cortical+and+hippocampal+tissue+of+seven+mouse+models.">Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models.</a> Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).</li><li>Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+induces+input-specific+rearrangements+in+a+targeted+synaptic+protein+interaction+network.">Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network.</a> Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+protein+complexes+isolated+from+primary+human+skin-resident+T+cells+can+be+analysed+by+Multiplex+IP-FCM.">Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM.</a> Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).</li><li>Neier, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+proximal+&#945;&#946;+TCR+signalosome+specifies+thymic+selection+outcome+through+a+quantitative+protein+interaction+network.">The early proximal &#945;&#946; TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network.</a> Science Immunology. 4 (32), (2019).</li><li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM:+immunoprecipitation+detected+by+flow+cytometry.">IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM+measures+physiologic+protein-protein+interactions+modulated+by+signal+transduction+and+small-molecule+drug+inhibition.">IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition.</a> PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).</li><li>Lautz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+changes+in+synaptic+protein+complex+composition+are+consistent+in+different+detergents+despite+differential+solubility.">Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility.</a> BioRXiv. , (2019).</li><li>Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WGCNA:+an+R+package+for+weighted+correlation+network+analysis.">WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis.</a> BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+bivalency+observed+among+TCR/CD3+complexes+isolated+from+primary+T+cells.">Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells.</a> Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).</li></ol>

El ensayo QMI requiere una inversión sustancial en el desarrollo de paneles de anticuerpos, equipos y reactivos, pero una vez establecido el ensayo, se pueden recopilar datos de alta dimensión observando redes de interacción de proteínas a medida que responden a las Estímulos. Técnicamente, QMI requiere un cuidadoso pipeteo y seguimiento de las ubicaciones de pozos de muestras y anticuerpos. Etiquetar cuidadosamente las placas de ensayo es útil, al igual que hacer una plantilla detallada de las ubicaciones de pozo...

Las interacciones dinámicas proteína-proteína constituyen las cascadas de señalización molecular y las estructuras móviles que son la base funcional de la mayoría de la fisiología celular1. Estos procesos a menudo se representan como vías de señalización lineal que cambian entre estados estables basados en entradas individuales, pero los datos experimentales y de modelado muestran claramente que funcionan como redes integradas2,3, 4. En el caso de las proteínas G, diferentes receptores a menudo tienen la capacidad de activar la misma proteína G, y un solo receptor también puede activar más de un tipo de proteína G5,6. Para que el número relativamente pequeño de clases de proteínas G modula específicamente una amplia gama de funciones celulares como la transmisión sináptica, la regulación hormonal y la migración celular, las células deben integrar y diferenciar estas señales4 , 5. La evidencia ha demostrado que esta especificidad de la señal, tanto para las proteínas G como para otras, se deriva principalmente sobre la base de interacciones proteína-proteína finamente afinadas y su dinámica temporal1,3, 4 , 5 , 6 , 7. Debido a que las redes de señalización se componen de complejos proteicos dinámicos con múltiples entradas, salidas y bucles de retroalimentación, una sola perturbación tiene la oportunidad de alterar el equilibrio homeostático general de la fisiología4 de una célula ,7. Ahora se acuerda ampliamente que la señalización debe ser examinada desde una perspectiva de red con el fin de comprender mejor cómo la integración de múltiples entradas controla las funciones celulares discretas en la salud y la enfermedad7,8, 9,10,11,12,13. A la luz de esto, se desarrolló la Inmunoprecipitación Múltiple Cuantitativa (QMI) para recopilar datos cuantitativos de rendimiento medio sobre los cambios de pliegue en las redes dinámicas de interacción de proteínas.
QMI es un ensayo basado en anticuerpos en el que el lisato celular se incuba con un panel de anticuerpos de inmunoprecipitación que se acoplan covalentemente a cuentas magnéticas que contienen proporciones distintas de colorantes fluorescentes. Tener anticuerpos específicos acoplados a distintas clases de cuentas magnéticas permite la co-inmunoprecipitación simultánea de múltiples proteínas diana del mismo lisato. Después de la inmunoprecipitación (IP), las perlas magnéticas se incuban con un segundo anticuerpo de sonda conjugada con fluoróforo (o anticuerpo biotinilado junto con estreptavidina conjugada con fluoróforo). Las coasociaciones entre las proteínas reconocidas por cada par de anticuerpos de anticuerpos IP- sondeo, o PiSCES (proteínas en complejos compartidos detectados por epítopos de superficie expuestos), se detectan por citometría de flujo y se pueden comparar cuantitativamente entre diferentes condiciones de la muestra14. Las ilustraciones de la Figura 1 muestran los pasos necesarios para ejecutar un ensayo QMI, incluido un diagrama de cuentas magnéticas con complejos proteicos inmunoprecipitados etiquetados por anticuerpos de sonda conjugados fluorescentes (Figura1C).
La sensibilidad de QMI depende de la concentración proteica del lisado en relación con el número de perlas magnéticas utilizadas para la inmunoprecipitación, y lograr una resolución para detectar cambios de pliegue del 10% requiere sólo una pequeña cantidad de material de partida en comparación con otros métodos co-IP14,15. Por ejemplo, la cantidad de material de partida utilizado en QMI es similar a la necesaria para un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas sándwich (ELISA), pero se detectan múltiples interacciones en un solo ensayo QMI. Los ensayos QMI con 20 IP y 20 dianas de sonda se han realizado utilizando células T primarias de 1-5 x 105 aisladas de una biopsia de piel de 4 mm, preparaciones sinapscontraómicas P2 a partir de una sección coronal de 3 mm de corteza prefrontal del ratón, o 3 x 106 neuronas corticales14,16,17. Esta sensibilidad hace que QMI sea útil para el análisis de células o tejidos con disponibilidad limitada, como muestras clínicas.
QMI se puede adaptar para cualquier red de interacción proteica previamente definida (siempre que los anticuerpos estén disponibles), y hasta la fecha se ha desarrollado para analizar el señalosoma del receptor de antígeno de células T (TCR) y un subconjunto de proteínas en las sinapsis glutamatérgicas en las neuronas 17 , 18. En estudios de señalización de receptores de células T, QMI se utilizó primero para identificar los cambios inducidos por la estimulación en PiSCES, y luego para distinguir a los pacientes autoinmunes de un grupo de control, detectar la señalización autoinmune endógena, y finalmente para generar una hipótesis que implica una subred de interacciones asociada a la enfermedad desequilibrada14. Más recientemente, se utilizó el mismo panel QMI para determinar que la selección de timocitos está determinada por diferencias cuantitativas en lugar de cualitativas en la señalización proteica asociada a la TCR19. En las neuronas, QMI se utilizó para describir la reorganización específica de la entrada de una red de interacción proteica para distintos tipos de señales de entrada de una manera que apoya los nuevos modelos de plasticidad sináptica17. Además, este panel QMI sináptico se utilizó para identificar diferencias en siete modelos de ratón de autismo, agrupar los modelos en subgrupos basados en sus biofirmas PiSCES, e hipotetizar con precisión un déficit molecular compartido que antes no era reconocido en uno de los modelos16. Un enfoque similar podría utilizarse para detectar otros subgrupos que podrían responder a diferentes tratamientos farmacológicos, o asignar medicamentos a subgrupos específicos con capacidad de respuesta. QMI tiene aplicaciones potenciales en diagnóstico, sub-tipado de pacientes y desarrollo de medicamentos, además de ciencia básica.
Para ensamblar un panel de anticuerpos QMI, los protocolos iniciales de selección y cribado de anticuerpos se describen en la Sección 1, a continuación. Una vez identificados los paneles de anticuerpos, los protocolos para la conjugación de los anticuerpos seleccionados con las perlas magnéticas para IP y para la biotinylación de los anticuerpos de sonda seleccionados, se describen en la Sección 2. El protocolo para ejecutar el ensayo QMI en los líticos celulares o tisulares se describe en la Sección 3. Por último, dado que un solo experimento puede generar puntos de datos individuales de 5 x 10 5, las instrucciones y los códigos informáticos para ayudar en el procesamiento, análisis y visualización de datos se proporcionan en la Sección 4. En la Figura 1se muestra una descripción general del flujo de trabajo descrito en las secciones 2-4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well flat bottomed plates</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171025001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well PCR plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82006-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bioplex 200 System with HTF</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171000205</td>
			<td>modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bio-Plex Pro Wash Station</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">30034376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">BSA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">CML beads</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C37481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EDTA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">MagPlex Microspheres</td>
			<td style="width:121px;">Luminex</td>
			<td style="width:119px;">MC12xxx-01</td>
			<td>xxx is the 3 digit bead region</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Melon Gel IgG Spin Purification Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45206</td>
			<td>used for antibody purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:237px;">MES</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Microplate film, non-sterile</td>
			<td style="width:121px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2920-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Phosphotase inhibitor cocktail #2</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sandwich Prep Refrigerator</td>
			<td style="width:121px;">Norlake</td>
			<td>SMP 36 15</td>
			<td>for custom refrigeration of Bioplex 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Streptavidin-PE</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">405204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sulfo NHS</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Tris</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation

Las interacciones dinámicas proteínas y proteínas controlan el comportamiento celular, desde la motilidad hasta la replicación del ADN y la transducción de la señal. Sin embargo, monitorear las interacciones dinámicas entre múltiples proteínas en una red de interacción proteica es técnicamente difícil. Aquí, presentamos un protocolo para la Inmunoprecipitación Cuantitativa múltiple (QMI), que permite la evaluación cuantitativa de los cambios de pliegue en las interacciones proteicas basadas en mediciones relativas de fluorescencia de Proteínas en Complejos Compartidos detectadas por Exposed Epítopos superficiales (PiSCES). En el QMI, los complejos proteicos de los lysaatos celulares se inmunoprecipitan en las microesferas y luego sondean con un anticuerpo etiquetado para una proteína diferente con el fin de cuantificar la abundancia de PiSCES. Los anticuerpos de inmunoprecipitación se conjugan en diferentes regiones espectrales de MagBead, lo que permite que un citómetro de flujo diferencie múltiples inmunoprecipitaciones paralelas y cuantifique simultáneamente la cantidad de anticuerpo de sonda asociado con cada una. QMI no requiere etiquetado genético y se puede realizar utilizando biomaterial mínimo en comparación con otros métodos de inmunoprecipitación. QMI se puede adaptar para cualquier grupo definido de proteínas que interactúan, y hasta ahora se ha utilizado para caracterizar las redes de señalización en las células T y las sinapsis de glutamato neuronal. Los resultados han dado lugar a una nueva generación de hipótesis con posibles aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Este protocolo incluye instrucciones para realizar QMI, desde la selección inicial del panel de anticuerpos hasta la ejecución de ensayos y el análisis de datos. El montaje inicial de un ensayo QMI implica la detección de anticuerpos para generar un panel y determinar empíricamente un búfer de lisis adecuado. La preparación posterior de reactivos incluye el acoplamiento covalente de anticuerpos de inmunoprecipitación a MagBeads, y anticuerpos de sonda biotinylantes para que puedan ser etiquetados por un fluoróforo conjugado con estreptavidina. Para ejecutar el ensayo, el islato se mezcla con MagBeads durante la noche, y luego las cuentas se dividen e incuban con diferentes anticuerpos de sonda, y luego una etiqueta de fluoróforo, y se lee por citometría de flujo. Se realizan dos pruebas estadísticas para identificar PiSCES que difieren significativamente entre las condiciones experimentales, y los resultados se visualizan mediante mapas de calor o diagramas de borde de nodo.

Detección de anticuerpos Figura 2 B muestra los resultados de una pantalla para la proteína Connexin36. La mayoría de las combinaciones IP_probe no producen ninguna señal sobre los controles IgG. La IP con el anticuerpo monoclonal 1E5 y la sonda con 1E5 o el anticuerpo policlonal 6200 produce un cambio hacia la derecha en la distribución del cordón en comparación con los controles IgG. Aquí, IP 1E5 y la sonda 6200poly fueron seleccionados para evi...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

La inmunoprecipitación por multiplex (QMI) cuantitativa utiliza citometría de flujo para la detección sensible de diferencias en la abundancia de interacciones proteínas y proteínas dirigidas entre dos muestras. QMI se puede realizar utilizando una pequeña cantidad de biomaterial, no requiere etiquetas genéticamente diseñadas y se puede adaptar para cualquier red de interacción de proteínas previamente definida.

Cuantificación de la dinámica de la red de interacción de proteínas mediante coinmunoprecipitación multiplexada

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

La co-inmunoprecipitación multiplexada cuantitativa, o QMI, permite a los usuarios medir simultáneamente cientos de interacciones binarias en una red de interacción proteica predefinida. Mediante la realización de múltiples co-IP simultáneamente en el mismo izado, las técnicas bioinformáticas pueden examinar cómo cambian los grupos de asociaciones conjuntas de manera coordinada. El ensayo requiere mucho tiempo para desarrollarse, pero una vez que el panel QMI está en la escala de red de mano, los datos se pueden recopilar sobre los sistemas de transducción de señales en un ensayo relativamente simplemente nocturno.QMI requiere el pipeteo preciso de diferentes muestras y reactivos en placas de 96 pozos. Se deben tomar notas cuidadosas al configurar y ejecutar cada ensayo para evitar errores. Para la preparación de muestras y la inmunoprecipitación, comience por la lesión de la muestra en un detergente adecuado con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa para una incubación de 15 minutos sobre hielo.Al final de la incubación, gire hacia abajo la muestra para eliminar las membranas y los desechos y realice un ensayo de BCA en el sobrenadante para determinar la concentración de proteínas de acuerdo con los protocolos estándar. Después de normalizar las concentraciones de proteínas, prepare una mezcla maestra de cuentas magnéticas que contenga aproximadamente 250 cuentas magnéticas de cada clase por pozo. Utilice la separación magnética para lavar la mezcla magnética de perlas dos veces en el búfer Fly P antes de resuspender las perlas en 20 microlitros de búfer Fly P por muestra.Después de un pipeteo exhaustivo, aliquot 20 microlitros de perlas en un tubo de microcentrífuga helada por muestra y añadir volúmenes iguales de izado con concentraciones de proteínas normalizadas a cada tubo para inmunoprecipitación. A continuación, divida cada muestra de lisato en un tubo para cada placa que se está ejecutando e inmunoprecipita las muestras en un rotador a cuatro grados Celsius durante la noche protegido de la luz. A la mañana siguiente utilice un estante magnético para eliminar el suaveato del primer conjunto de tubos y lavar las cuentas dos veces en 500 microlitros de lúdico frío Fly P buffer por lavado.Después de calcular el volumen de resuspensión, resuspender los inmunoprecipitados en el volumen calculado de lampló la mosca P fría. Resuspender a fondo las cuentas magnéticas mediante pipeteo suave y distribuir 25 microlitros de cuentas por pozo a través de una placa plana de 96 pozos sobre hielo. En una placa de 96 pozos diferente, diluir mediante anticuerpos de sonda attinilated a una concentración de trabajo dos veces mayor.Utilice una pipeta multicanal para distribuir 25 microlitros de cada dilución de anticuerpos de sonda en los pocillos apropiados de la placa de ensayo magnética que contiene la placa de ensayo y agitar a alta velocidad en un agitador de placa horizontal para mezclar y resuspender las perlas magnéticas. Después de mezclar, reduzca la velocidad durante una hora de incubación a cuatro grados Centígrados protegidos de la luz. Al final de la incubación, lave la placa tres veces con el tampón Fly P fresco por lavado en una arandela de placa magnética a cuatro grados centígrados.Después del último lavado, resuspender las perlas en 50 microlitros de estreptavidina PE diluido de uno a 200 en tampón Fly P. Agitar la mezcla y resuspender las perlas antes de incubar la placa a cuatro grados Celsius durante 30 minutos protegido de la luz. Al final de la incubación, lave la placa tres veces con el amortiguador Fly P en una arandela de placa magnética a cuatro grados Celsius y resusppend las perlas en 125 microlitros de tampón Fly P.Agitar la placa durante un minuto a 900 rotaciones para resuspender a fondo las perlas y cargar la placa en un citómetro de flujo repusido. En el software de citometro de flujo, seleccione El ajuste de destino de alto RP1, una condición de parada de 1.000 perlas por región y un volumen de muestra de 80 microlitros. Detenga la carrera a mitad de camino y resusppend las cuentas para evitar el asentamiento.Al final de la ejecución, exporte los archivos de datos en formato XML. Para realizar el análisis ANC, rellene el archivo de entrada ANC para reflejar los detalles del diseño experimental y ejecute el programa, que escribirá un archivo CSV en el directorio activo. El archivo que termina en hits.csv informará de las asociaciones proteicas que son significativamente diferentes en un nivel falso positivo de 0,05 entre las condiciones de control y experimental en al menos tres de cuatro réplicas experimentales. Para el análisis de red de correlación ponderada, pegue los títulos de columna de la salida del archivo de datos por Matlab que termina en mfi. csv en la primera columna de una nueva hoja de cálculo y agregue las columnas Experimento para el número de experimento y Tratamiento para el tratamiento experimental y cualquier otra variable a analizar.Guarde este archivo como rasgos. csv y abrir R Studio. Establezca el directorio de trabajo en una carpeta que contenga el mfi.csv y rasgos. csv, resalte secciones de código y pulse Comando Intro para ejecutar los comandos de R como se indica en el archivo de comandos comentado. Los módulos de análisis de red de correlación ponderada significativamente correlacionados con cada rasgo experimental se mostrarán como un archivo gráfico y la correlación de cada interacción con cada módulo se mostrará como un archivo CSV.Para cada interacción en el archivo de salida ANC, identifique si esa interacción también es significativa por CNA y cree una nueva columna que indique si cada acierto ANC es también un golpe CNA. Convierta los valores para registrar dos cambios de plegado y calcule el valor promedio para todos los hits CNA de unión ANC. Por último, haga una nueva hoja de cálculo con cada CNA de unión ANC que se vea listada por su objetivo de inmunoprecipitación en una columna, su objetivo de sondeo en la segunda columna y su valor de cambio de pliegue en la tercera columna.Importe este archivo en Cytoscape como red para crear un diagrama de borde de nodo. Las interacciones de proteínas de alta confianza identificadas por los dos enfoques estadísticos independientes se visualizan como diagramas de borde de nodo utilizando el software de código abierto, Cytoscape, o como mapas de calor utilizando el código R y las instrucciones de análisis incluidas en el material complementario. A lo largo del protocolo, los usuarios deben tener cuidado con la pipeta con precisión, mantener registros meticulosos y mantener las muestras frías en todo momento.Hemos utilizado QMI para entender cómo las vías de transducción de señales diferencian entre diferentes tipos de entrada e integran información de múltiples receptores.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción proteína-proteína entre HCN1 y TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Investigación

Bioquímica

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

La visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de Co-inmunoprecipitación y<em&gt; In Situ</em&gt; Ligadura ensayo de proximidad

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Investigación de la secuencia de la proteína-estructura-dinámica Relaciones con Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Medición de alta sensibilidad de transcripción DNA Factor obligatorio afinidades por valoración competitiva utilizando microscopía de fluorescencia

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Uso en transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de Vitro para el estudio de la dinámica de los complejos de la proteína en una escala de tiempo de milisegundos

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Monitorización de la dinámica de interacción proteína-ARN in vivo a alta resolución temporal utilizando χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análisis de interacción proteína-proteína de membrana

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Captura asistida por resina junto con etiquetado de etiqueta de masa isobárica en tándem para la cuantificación multiplexada de la oxidación de la proteína tiol

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...