Name: quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation
Uploaded: 2019-08-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Författarna vill erkänna Tessa Davis för viktiga bidrag till QMI assay utveckling, och nuvarande och tidigare medlemmar i Smith och Schrum Labs för teknisk vägledning och intellektuell input. Detta arbete finansierades av NIMH-bidrag R01 MH113545 och R00 MH 102244.

1. analysens utformning
<ol><li>Kandidat preparat för antikroppar<ol>
<li>För varje protein av intresse, Välj 3 till 5 antikroppar mot skärmen. När det är möjligt, Använd monoklonala antikroppar som erkänner olika epitoper. Omfattar även en icke-specifik kontroll antikropp.</li>
		<li>För att ta bort Tris, utför buffertutbytet genom att lägga till antikroppen i ett 30 kDa-spinn filter, snurra ner till dess minsta volym, lägga till 500 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och upprepa 3 gånger. För att ta...

<ol>
	<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rodr&#237;guez-Jorge, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+T+cell+receptor+and+Toll-like+receptor+5+signaling+for+CD4.">Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4.</a> Science Signaling. 12 (577), (2019).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), (2018).</li><li>Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+signaling+by+modular+adaptor+proteins.">Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).</li><li>Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+G+protein+signaling.">The many faces of G protein signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).</li><li>Lohse, M. J., Hofmann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Aspects+of+Signaling+by+G-Protein-Coupled+Receptors.">Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors.</a> Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).</li><li>Eltschinger, S., Loewith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOR+Complexes+and+the+Maintenance+of+Cellular+Homeostasis.">TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis.</a> Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).</li><li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theoretical+framework+for+specificity+in+cell+signaling.">A theoretical framework for specificity in cell signaling.</a> Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+and+Specificity+in+Signal+Transduction+via+Physiologic+Protein+Interaction+Networks.">Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks.</a> Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).</li><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+essentials:+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks.">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).</li><li>Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+in+the+endoplasmic+reticulum+unfolded+protein+response.">Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).</li><li>Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Iron+Homeostasis:+New+Players+in+Metabolism,+Cell+Death,+and+Disease.">Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+matrix+network+analysis+of+protein+complexes+in+the+human+TCR+signalosome.">Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome.</a> Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).</li><li>Schrum, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Science's STKE. 2007 (389), (2007).</li><li>Brown, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+the+autisms+using+glutamate+synapse+protein+interaction+networks+from+cortical+and+hippocampal+tissue+of+seven+mouse+models.">Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models.</a> Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).</li><li>Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+induces+input-specific+rearrangements+in+a+targeted+synaptic+protein+interaction+network.">Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network.</a> Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+protein+complexes+isolated+from+primary+human+skin-resident+T+cells+can+be+analysed+by+Multiplex+IP-FCM.">Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM.</a> Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).</li><li>Neier, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+proximal+&#945;&#946;+TCR+signalosome+specifies+thymic+selection+outcome+through+a+quantitative+protein+interaction+network.">The early proximal &#945;&#946; TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network.</a> Science Immunology. 4 (32), (2019).</li><li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM:+immunoprecipitation+detected+by+flow+cytometry.">IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM+measures+physiologic+protein-protein+interactions+modulated+by+signal+transduction+and+small-molecule+drug+inhibition.">IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition.</a> PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).</li><li>Lautz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+changes+in+synaptic+protein+complex+composition+are+consistent+in+different+detergents+despite+differential+solubility.">Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility.</a> BioRXiv. , (2019).</li><li>Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WGCNA:+an+R+package+for+weighted+correlation+network+analysis.">WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis.</a> BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+bivalency+observed+among+TCR/CD3+complexes+isolated+from+primary+T+cells.">Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells.</a> Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).</li></ol>

QMI-analysen kräver betydande investeringar i utveckling av antikropp paneler, utrustning och reagenser, men när analysen är etablerad kan man samla in högdimensionella data som observerar protein interaktions nätverk när de reagerar på experimentellt kontrollerade Stimuli. Tekniskt, kräver QMI noggrann pipettering och spårning av prov och antikroppar väl platser. Noggrant märkning analysen plattorna är användbar, som gör en detaljerad mall för väl platser på papper, som sedan sparas för dataanalys. Vik...

Dynamiska protein-protein interaktioner utgör molekylära signalering kaskader och rörliga strukturer som är funktionell grund för de flesta cellulära fysiologi1. Dessa processer avbildas ofta som linjära signalvägar som växlar mellan steady-state baserat på enstaka ingångar, men experimentella och modelleringsdata visar tydligt att de fungerar som integrerade nätverk2,3, 4. När det gäller G-proteiner, olika receptorer har ofta förmågan att aktivera samma G-protein, och en enda receptor kan också aktivera mer än en typ av g-protein5,6. För att det relativt lilla antalet G protein klasser att specifikt modulera ett brett spektrum av cellulära funktioner såsom synaptisk transmission, hormon reglering, och cell migration, celler måste både integrera och differentiera dessa signaler4 , 5. bevis har visat att denna signalspecificitet, för G-proteiner och andra, huvudsakligen härleds på grundval av finstämda protein-proteininteraktioner och deras temporala dynamik1,3, 4 , ,5 , 6 , 7. eftersom signalering nätverk består av dynamiska proteinkomplex med flera ingångar, utgångar, och feedbackloopar, en enda störning har möjlighet att förändra den totala homeostatiska balansen i en cells fysiologi4 ,7. Det är nu allmänt överenskommet att signalering bör undersökas ur ett nätverk perspektiv för att bättre förstå hur integrationen av flera ingångar styr diskreta cellulära funktioner i hälsa och sjukdom7,8, 9,10,11,12,13. Mot bakgrund av detta utvecklades kvantitativ multiplex immunoprecipitation (QMI) för att samla in medelhögt dataflöde, kvantitativa data om viknings förändringar i dynamiska protein interaktions nätverk.
QMI är ett antikroppsbaserat test där celllysat inkuberas med en panel av immunoprecipitation-antikroppar som är kovalent kopplade till magnetiska pärlor som innehåller distinkta proportioner av fluorescerande färgämnen. Med specifika antikroppar kopplade till distinkta magnetiska pärlklasser möjliggör samtidig samtidig immunoprecipitation av flera målproteiner från samma lysat. Efter immunoprecipitation (IP) inkuberas magnetiska pärlor med en andra, fluorophore-konjugerad sond-antikropp (eller biotinylerad antikropp tillsammans med fluorophore-konjugerat streptavidin). Co-föreningar mellan de proteiner som erkänns av varje IP antikropp-sond antikroppar par, eller Fiskarna (proteiner i delade komplex upptäcks av exponerade ytan epitopes), sedan detekteras med flödescytometri och kan kvantitativt jämföras mellan olika exempel villkor14. Illustrationerna i figur 1 visar de steg som ingår i en QMI-analys, inklusive ett diagram över magnetiska pärlor med immunoprecipiterade proteinkomplex märkta med fluorescerande konjugerade sond antikroppar (figur 1C).
Känsligheten för QMI beror på protein koncentrationen av lysat i förhållande till antalet magnetiska pärlor som används för immunoprecipitation, och att uppnå en upplösning för att upptäcka 10% gånger förändringar kräver endast en liten mängd utgångsmaterial jämfört med andra Co-IP-metoder14,15. Till exempel är den mängd utgångsmaterial som används i QMI liknande den som krävs för en Sandwich enzymkopplad ImmunoSorbent assay (ELISA), men flera interaktioner upptäcks i en enda QMI-analys. QMI-analyser med 20 IPs och 20 sond mål har utförts med 1-5 x 105 primära T-celler isolerade från en 4 mm hudbiopsi, P2 synaptosomala preparat från en 3 mm koronala delen av mus prefrontala cortex, eller 3 x 106 odlade mus primär kortikala neuroner14,16,17. Denna känslighet gör QMI användbart för analys av celler eller vävnad med begränsad tillgänglighet, såsom kliniska prover.
QMI kan anpassas för alla tidigare definierade protein interaktions nätverk (förutsatt att antikroppar finns), och hittills har utvecklats för att analysera T-cellantigen-receptorn (TCR) signalosome och en delmängd av proteiner vid glutamaterga synapser i nervceller 17 , 18. i studier av T-cell receptor signalering, QMI användes först för att identifiera stimulering-inducerad förändringar i fiskarna, och sedan att skilja autoimmuna patienter från en kontrollgrupp, upptäcka endogena autoimmuna signalering, och slutligen att generera en hypotes som involverar ett obalanserat sjukdomsassocierat subnätverk av interaktioner14. På senare tid, samma QMI panelen användes för att fastställa att thymocyte urvalet bestäms av kvantitativa snarare än kvalitativa skillnader i TCR-associerad protein signalering19. I nervceller, QMI användes för att beskriva input-specifika omplaceringen av ett protein interaktion nätverk för olika typer av ingångssignaler på ett sätt som stöder nyligen framväxande modeller av synaptisk plasticitet17. Dessutom, detta Synaptic QMI panel användes för att identifiera skillnader i sju musmodeller av autism, Cluster modellerna i subgrupper baserat på deras fiskarna biosignatures, och exakt hypotes en delad molekylära underskott som tidigare okänt i en av modellerna16. En liknande metod kan användas för att skärmen för andra undergrupper som kan svara på olika läkemedelsbehandlingar, eller tilldela läkemedel till specifika responsiva undergrupper. QMI har potentiella tillämpningar inom diagnostik, patient under skrivning och läkemedelsutveckling, förutom grundläggande vetenskap.
För att sätta ihop en QMI-antikroppspanelen beskrivs inledande antikroppsscreening-och urvals protokoll i avsnitt 1 nedan. När antikropps paneler har identifierats beskrivs protokoll för konjugering av de valda antikropparna till magnetiska pärlor för IP, och för biotinylering av de valda sond antikropparna, i avsnitt 2. Protokollet för att köra QMI-analysen på cell-eller vävnads celllysat beskrivs i avsnitt 3. Slutligen, eftersom ett enda experiment kan generera ~ 5 x 105 enskilda datapunkter, instruktioner och datorkoder för att bistå vid bearbetning, analys och visualisering finns i avsnitt 4. En översikt över arbetsflödet som beskrivs i avsnitten 2-4 visas i figur 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well flat bottomed plates</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171025001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well PCR plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82006-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bioplex 200 System with HTF</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171000205</td>
			<td>modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bio-Plex Pro Wash Station</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">30034376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">BSA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">CML beads</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C37481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EDTA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">MagPlex Microspheres</td>
			<td style="width:121px;">Luminex</td>
			<td style="width:119px;">MC12xxx-01</td>
			<td>xxx is the 3 digit bead region</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Melon Gel IgG Spin Purification Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45206</td>
			<td>used for antibody purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:237px;">MES</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Microplate film, non-sterile</td>
			<td style="width:121px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2920-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Phosphotase inhibitor cocktail #2</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sandwich Prep Refrigerator</td>
			<td style="width:121px;">Norlake</td>
			<td>SMP 36 15</td>
			<td>for custom refrigeration of Bioplex 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Streptavidin-PE</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">405204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sulfo NHS</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Tris</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interaktioner kontroll cellulära beteende, från motilitet till DNA-replikering för att signalera transduktion. Dock är det tekniskt svårt att övervaka dynamiska interaktioner mellan flera proteiner i ett protein interaktions nätverk. Här presenterar vi ett protokoll för kvantitativ multiplex immunoprecipitation (QMI), som möjliggör kvantitativ bedömning av veck förändringar i proteininteraktioner baserat på relativa fluorescensmätningar av proteiner i delade komplex som upptäckts av exponerade Ytan epitoper (fiskarna). I QMI, proteinkomplex från cell celllysat är immunoprecipitated på mikrosfärer, och sedan sonderade med en märkt antikropp för ett annat protein för att kvantifiera överflödet av fiskarna. Immunoprecipitation antikroppar konjugeras till olika MagBead spektrala regioner, vilket gör att en flödescytometer att skilja flera parallella immunoprecipitations och samtidigt kvantifiera mängden sond antikropp associerad med varje. QMI kräver inte genetisk märkning och kan utföras med minimal biomaterial jämfört med andra immunoprecipitation metoder. QMI kan anpassas för en definierad grupp av samverkande proteiner, och har hittills använts för att karakterisera signal nätverk i T-celler och neuronala glutamatsynapser. Resultat har lett till nya hypotes generationen med potentiella diagnostiska och terapeutiska tillämpningar. Detta protokoll innehåller instruktioner för att utföra QMI, från den initiala antikropp panel urvalet till att köra analyser och analysera data. Den första monteringen av en QMI-analys innebär screening antikroppar för att generera en panel, och empiriskt fastställa en lämplig lysis buffert. Det efterföljande reagenspreparatet omfattar kovalent koppling av immunoprecipitation-antikroppar mot MagBeads och biotinylerande sond-antikroppar så att de kan märkas med en streptavidin-konjugerad fluorofore. För att köra analysen, är lysate blandas med MagBeads över natten, och sedan pärlor är uppdelade och inkuberas med olika sond antikroppar, och sedan en fluorophore etikett, och läsas av flödescytometri. Två statistiska tester utförs för att identifiera fiskarna som skiljer sig avsevärt mellan experimentella förhållanden, och resultaten visualiseras med hjälp av heatmaps eller Node-Edge diagram.

Screening av antikroppar Figur 2 B visar resultatet av en skärm för proteinet Connexin36. De flesta IP_probe kombinationer ger ingen signal över IgG-kontroller. IP med den monoklonala antikroppen 1E5 och sond med antingen 1E5 eller den polyklonala antikroppen 6200 ger en högerriktad förskjutning av pärlfördelningen jämfört med IgG-kontroller. Här valdes IP 1E5 och PROBE 6200poly ut för att undvika att använda samma antikropp som IP och PROBE, ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantitativ multiplex immunoprecipitation (QMI) använder flödescytometri för känslig detektion av skillnader i överflödet av riktade protein-protein interaktioner mellan två prover. QMI kan utföras med en liten mängd biomaterial, kräver inte genetiskt modifierade taggar, och kan anpassas för alla tidigare definierade protein interaktion nätverk.

Kvantifiering av proteininteraktion Nätverksdynamik med hjälp av multiplexerade Co-immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Kvantitativa multiplexed co-immunoprecipitation, eller QMI, gör det möjligt för användare att samtidigt mäta hundratals binära interaktioner i ett fördefinierat nätverk för proteininteraktion. Genom att utföra flera co-IPs samtidigt i samma lysate, bioinformatik tekniker kan sedan undersöka hur grupper av co-föreningar förändras på ett samordnat sätt. Analysen är tidskrävande att utveckla, men när QMI panelen är i handnät skala data kan samlas in om signaltransduktion system i en relativt enkelt övernattning analys.QMI kräver noggrann pipettering av olika prover och reagenser till 96 brunnsplattor. Noggranna anteckningar bör tas när du ställer upp och kör varje analys för att förhindra fel. För provberedning och immunoprecipitation, börja med att provet i ett lämpligt rengöringsmedel med proteas och fosfatashämmande medel lysning under en 15 minuters inkubation på is kan sänkas.I slutet av inkubationen, snurra ner provet för att avlägsna membranen och skräp och utföra en BCA-analys på supernatanten för att bestämma proteinkoncentrationen enligt standardprotokoll. Efter att ha normaliserat proteinkoncentrationerna, förbered en magnetisk pärlmästarblandning som innehåller cirka 250 magnetiska pärlor av varje klass per brunn. Använd magnetisk separation för att tvätta den magnetiska pärlan blanda två gånger i Fly P buffert innan resuspending pärlorna i 20 mikroliter av Fly P buffert per prov.Efter en grundlig pipettering, alikvoter 20 mikroliter av pärlor i en iskall microcentrifug röret per prov och lägga till lika volymer av lysate med normaliserade protein koncentrationer till varje rör för immunoprecipitation. Dela sedan varje lysateprov i ett rör för varje platta som körs och immunprecipitate proverna på en rotator vid fyra grader Celsius över natten skyddas från ljus. Nästa morgon använder en magnetisk pärla rack för att ta bort lysate från den första uppsättningen av rör och tvätta pärlor två gånger i 500 mikroliter iskall Fly P buffert per tvätt.Efter beräkning av resuspension-volymen, återanvänd immunfällorna i den beräknade volymen av iskall Fly P buffert. Grundligt resuspend de magnetiska pärlorna genom mild pipettering och distribuera 25 mikroliter av pärlor per brunn över en platt bottnad 96 väl platta på is. I en annan 96 brunnsplatta, späd genom attinilated sond antikroppar mot en två gånger arbetskoncentration.Använd en flerkanalig pipett för att fördela 25 mikroliter av varje sondantikroppsutspädning i lämpliga brunnar i den magnetiska pärlan som innehåller analysplatta och skaka med hög hastighet på en horisontell plåtskakre för att blanda och resuspend de magnetiska pärlorna. Efter blandning, minska hastigheten för en timmes inkubation vid fyra grader Celsius skyddad från ljus. Vid slutet av inkubationen, tvätta plattan tre gånger med färsk Fly P buffert per tvätt på en magnetisk tallrik bricka bricka vid fyra grader Celsius.Efter den sista tvätten, resuspend pärlorna i 50 mikroliter av streptavidin PE utspädd en till 200 i Fly P buffert. Skaka blandningen och resuspend pärlorna innan inkubera plattan i fyra grader Celsius i 30 minuter skyddas från ljus. Vid slutet av inkubationen, tvätta plattan tre gånger med Fly P buffert på en magnetisk tallrik bricka på fyra grader Celsius och återanvänder pärlorna i 125 mikroliter av Fly P buffert.Skaka plattan i en minut vid 900 rotationer för att grundligt resuspend pärlorna och ladda plattan i en refridgerated flöde cytometer. I programvaran flödescytmeter väljer du inställning för hög RP1-mål, ett stoppvillkor på 1, 000 pärlor per region och en provvolym på 80 mikroliter. Pausa körningen halvvägs igenom och resuspend pärlorna för att förhindra att lösa.I slutet av körningen exporterar du datafilerna i XML-formatet. För att utföra ANC-analys, fyll i ANC-indatafilen för att återspegla detaljerna i den experimentella designen och köra programmet, som kommer att skriva en CSV-fil i den aktiva katalogen. Filen som slutar i träffar.CSV kommer att rapportera de medföreningar för protein som är väsentligt olika på en falsk positiv nivå på 0,05 mellan kontroll- och experimentförhållandena i minst tre av fyra experimentella replikat. För viktad korrelationsnätverksanalys klistrar du in kolumntitlarna för datafilsutdata genom att Matlab slutar på mfi. CSV i den första kolumnen i ett nytt kalkylblad och lägga kolumnerna Experiment för experiment nummer och Behandling för experimentell behandling och eventuella andra variabler som skall analyseras.Spara den här filen som egenskaper. CSV och öppna R Studio. Ställ in arbetskatalogen till en mapp som innehåller mfi.CSV och egenskaper. CSV-filer, markera avsnitt av kod och slå Kommando Enter för att köra R-kommandona som anges i den kommenterade Kommandofilen. De viktade korrelationsnätverksanalysmodulerna korrelerade avsevärt med varje experimentell egenskap kommer att vara utdata som en grafisk fil och korrelationen av varje interaktion med varje modul kommer att vara utdata som en CSV-fil.För varje interaktion i ANC-utdatafilen, identifiera om den interaktionen är också signifikant av CNA och skapa en ny kolumn som anger om varje ANC-träff också är en CNA-träff. Konvertera värdena till logg två gånger förändring och beräkna det genomsnittliga värdet för alla ANC union CNA träffar. Slutligen, gör ett nytt kalkylblad med varje ANC-union CNA hit som anges av dess immunprecipitationsmål i en kolumn, dess sondmål i den andra kolumnen och dess vikningsförändringsvärde i den tredje kolumnen.Importera den här filen till Cytoscape som ett nätverk för att skapa ett nodkantsdiagram. Hög konfidens protein interaktioner identifieras av de två oberoende statistiska tillvägagångssätt visualiseras som nod kantdiagram med hjälp av öppen källkod, Cytoscape, eller som heatmaps med hjälp av R-kod och analysanvisningar som ingår i det kompletterande materialet. Under hela protokollet, användare måste ta hand om att pipettera exakt, att hålla noggranna register, och att hålla proverna kalla hela tiden.Vi har använt QMI för att förstå hur signaltransduktionsvägar skiljer mellan olika indatatyper och integrerar information från flera receptorer.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisering av protein-proteininteraktion i nukleära och cytoplasmiska fraktioner av Co-immunoprecipitation och<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligation Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Undersökande Proteinsekvens-struktur-dynamik Förhållanden med Bio3D-webben

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-gratis In Vitro kvantifiering av Protein Homo-oligomerisering använder kommersiella instrumentering och fri, öppen källkod ljusstyrka analys programvara

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Använda i Vitro fluorescens resonans energiöverföring att studera dynamiken i proteinkomplex på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Övervakning av protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo vid hög tidsupplösning med χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Inbyggt cellmembrannanopartiklar system för membranprotein-protein interaktionsanalys

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Hartsassisterad fångst i kombination med isobar tandemmassetikettmärkning för multiplexerad kvantifiering av proteintioloxidation

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...