Name: quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation
Uploaded: 2019-08-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Yazarlar QMI tahlil geliştirme önemli katkıları için Tessa Davis kabul etmek istiyorum, ve teknik rehberlik ve entelektüel giriş için Smith ve Schrum laboratuvarları mevcut ve eski üyeleri. Bu çalışma NIMH hibe R01 MH113545 ve R00 MH 102244 tarafından finanse edilmiştir.

1. Ataşe tasarımı
<ol><li>Aday antikor hazırlığı<ol>
<li>İlgi çekici her protein için, ekrana 3-5 antikor seçin. Mümkün olduğunda, farklı epitopsiyi tanıyan monoklonal antikorlar kullanın. Ayrıca bir non-spesifik kontrol antikor içerir.</li>
		<li>Tris'i kaldırmak için, antikor30 kDa spin filtresine ekleyerek, minimum hacmine inerek, 500 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek ve 3 kez tekrarlayarak tampon değişimi gerçekleştirin. Taşıyıcı proteinleri çıkarmak için, üreticinin protoko...

<ol>
	<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rodr&#237;guez-Jorge, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+T+cell+receptor+and+Toll-like+receptor+5+signaling+for+CD4.">Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4.</a> Science Signaling. 12 (577), (2019).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), (2018).</li><li>Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+signaling+by+modular+adaptor+proteins.">Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).</li><li>Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+G+protein+signaling.">The many faces of G protein signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).</li><li>Lohse, M. J., Hofmann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Aspects+of+Signaling+by+G-Protein-Coupled+Receptors.">Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors.</a> Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).</li><li>Eltschinger, S., Loewith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOR+Complexes+and+the+Maintenance+of+Cellular+Homeostasis.">TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis.</a> Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).</li><li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theoretical+framework+for+specificity+in+cell+signaling.">A theoretical framework for specificity in cell signaling.</a> Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+and+Specificity+in+Signal+Transduction+via+Physiologic+Protein+Interaction+Networks.">Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks.</a> Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).</li><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+essentials:+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks.">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).</li><li>Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+in+the+endoplasmic+reticulum+unfolded+protein+response.">Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).</li><li>Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Iron+Homeostasis:+New+Players+in+Metabolism,+Cell+Death,+and+Disease.">Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+matrix+network+analysis+of+protein+complexes+in+the+human+TCR+signalosome.">Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome.</a> Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).</li><li>Schrum, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Science's STKE. 2007 (389), (2007).</li><li>Brown, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+the+autisms+using+glutamate+synapse+protein+interaction+networks+from+cortical+and+hippocampal+tissue+of+seven+mouse+models.">Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models.</a> Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).</li><li>Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+induces+input-specific+rearrangements+in+a+targeted+synaptic+protein+interaction+network.">Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network.</a> Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+protein+complexes+isolated+from+primary+human+skin-resident+T+cells+can+be+analysed+by+Multiplex+IP-FCM.">Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM.</a> Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).</li><li>Neier, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+proximal+&#945;&#946;+TCR+signalosome+specifies+thymic+selection+outcome+through+a+quantitative+protein+interaction+network.">The early proximal &#945;&#946; TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network.</a> Science Immunology. 4 (32), (2019).</li><li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM:+immunoprecipitation+detected+by+flow+cytometry.">IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).</li><li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-FCM+measures+physiologic+protein-protein+interactions+modulated+by+signal+transduction+and+small-molecule+drug+inhibition.">IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition.</a> PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).</li><li>Lautz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+changes+in+synaptic+protein+complex+composition+are+consistent+in+different+detergents+despite+differential+solubility.">Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility.</a> BioRXiv. , (2019).</li><li>Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WGCNA:+an+R+package+for+weighted+correlation+network+analysis.">WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis.</a> BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).</li><li>Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+bivalency+observed+among+TCR/CD3+complexes+isolated+from+primary+T+cells.">Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells.</a> Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).</li></ol>

QMI tahlili antikor paneli geliştirme, ekipman ve reaktifler için önemli bir yatırım gerektirir, ancak tahkikat kurulduktan sonra, deneysel olarak kontrol edilen yanıt olarak protein etkileşim ağlarını gözlemleyerek yüksek boyutlu veri toplayabilir Uyaran. Teknik olarak, QMI dikkatli pipetleme ve örnek ve antikor kuyu yerleri izleme gerektirir. Tahlil plakalarının dikkatle etiketlenmesi, kağıt üzerindeki iyi konumların ayrıntılı bir şablonu nun yapılması gibi, daha sonra veri analizi için kayded...

Dinamik protein-protein etkileşimleri, çoğu hücresel fizyolojinin fonksiyonel temeli olan moleküler sinyalbasamaklarını ve hareketli yapıları oluşturur 1. Bu süreçler genellikle tek girişlere dayalı sabit durumlar arasında geçiş yapan doğrusal sinyal yolları olarak tasvir edilir, ancak deneysel ve modelleme verileri entegre ağlar olarak işlev ettiklerini açıkça göstermektedir2,3, 4. G proteinleri durumunda, farklı reseptörler genellikle aynı G proteinini aktive etme yeteneğine sahiptir ve tek bir reseptör de birden fazla G proteini türünü aktive edebilir5,6. Göreceli olarak az sayıda g protein sınıfının sinaptik iletim, hormon düzenlemesi ve hücre göçü gibi çok çeşitli hücresel fonksiyonları modüle edebilmesi için, hücrelerin bu sinyalleri hem entegre etmesi hem de farklılaştırmasıgerekir 4 , 5. Kanıtlar göstermiştir ki bu sinyal özgüllüğü, G proteinleri için yanı sıra diğerleri için, öncelikle ince ayarlı protein-protein etkileşimleri ve zamansal dinamikleri1temelinde türetilmiştir1 ,3, 4.2.2 , 5.000 , 6.000 , 7. Sinyal ağları birden fazla giriş, çıkış ve geri besleme döngüleri ile dinamik protein kompleksleri oluşur çünkü, tek bir pertürbasyon bir hücrenin fizyolojisi4 genel homeostatik dengesini değiştirmek için fırsat vardır ,7. Şimdi yaygın olarak sinyalizasyon daha iyi anlamak için bir ağ perspektifinden incelenmesi gerektiğini kabul edilir nasıl birden fazla girdi entegrasyonu sağlık ve hastalık ayrık hücresel fonksiyonları kontrol eder7,8, 9,10,11,12,13. Bunun ışığında, dinamik protein etkileşim ağlarında kıvrım değişiklikleri hakkında orta-iş- ve nicel veriler toplamak için Kantitatif Multipleks İmmünopantüen (QMI) geliştirilmiştir.
QMI, hücre lisatının floresan boyaların farklı oranlarda bulunan manyetik boncuklarla kovalent olarak birleşen immünopresid antikorlarından oluşan bir panel ile kuluçkaya yatırıldığı antikor bazlı bir tahlilidir. Farklı manyetik boncuk sınıfları ile birleşen spesifik antikorların olması, aynı lysate'den birden fazla hedef proteinin eşzamanlı olarak ko-immünoprepitasyon almasına olanak sağlar. İmmünenyağış (IP) sonrasında manyetik boncuklar ikinci bir florofor konjuge prob antikor (veya florofor konjuge streptavidin ile birlikte biyotinylated antikor) ile kuluçkaya yatırılır. Her IP antikor-probu antikor çifti veya PiSCES (maruz kalan yüzey epitoprepleri tarafından saptanan ortak komplekslerde proteinler) tarafından tanınan proteinler arasındaki ortak ilişki, akış sitometrisi tarafından saptanır ve farklı örnek koşulları14. Şekil 1'deki çizimler, flüoresanslı konjuge prob antikorları ile etiketlenmiş immünopsipitated protein kompleksleri ile manyetik boncuk diyagramı da dahil olmak üzere, bir QMI testi nin çalıştırılmasında yer alan adımları göstermektedir (Şekil 1C).
QMI'nin duyarlılığı, immünopresipitasyon için kullanılan manyetik boncuk sayısına göre lysate protein konsantrasyonuna bağlıdır ve %10 kat değişikliklerini tespit etmek için bir çözüm elde etmek, diğer co-IP yöntemleri14,15. Örneğin, QMI'de kullanılan başlangıç materyalinin miktarı sandviç Enzime Bağlı İmmünosorbent Test (ELISA) için gerekli olana benzer, ancak tek bir QMI testinde birden fazla etkileşim algılanır. 4 mm deri biyopsisinden izole edilmiş 1-5 x 105 primer T hücreleri, fare prefrontal korteksin 3 mm koronal bölümünden P2 sinaptozomal preparatlar veya 3 x 106 kültürlü fare primemi kullanılarak 20 IP ve 20 prob hedefi kullanılarak QMI tahlilleri yapılmıştır. kortikal nöronlar14,16,17. Bu duyarlılık QMI'yi klinik numuneler gibi sınırlı kullanılabilirlik teshisi olan hücrelerin veya dokunun analiziiçin yararlı hale getirir.
QMI daha önce tanımlanmış herhangi bir protein etkileşim ağına uyarlanabilir (antikorların mevcut olması koşuluyla) ve bugüne kadar T hücre antijen reseptörü (TCR) sinyalozomve nöronlarda glutamaterjik sinapslarda protein alt kümesini analiz etmek için geliştirilmiştir. 17.000 , 18- T hücre reseptör sinyalizasyonu çalışmalarında, QMI ilk PiSCES stimülasyon kaynaklı değişiklikleri belirlemek için kullanılan ve daha sonra bir kontrol grubundan otoimmün hastaları ayırt etmek için, endojen otoimmün sinyal tespit ve son olarak oluşturmak için etkileşimlerin dengesiz bir hastalık ilişkili alt ağ içeren hipotez14. Daha yakın zamanda, aynı QMI paneli timosit seçimi tcr ilişkili protein sinyal19 nitel farklılıklar yerinenicel tarafından belirlenir belirlemek için kullanılmıştır. Nöronlarda, QMI sinaptik plastisite yeni ortaya çıkan modelleri destekleyen bir şekilde giriş sinyalleri farklı türleri için bir protein etkileşim ağının giriş-özel yeniden düzenlenmesi tanımlamak için kullanılmıştır17. Ayrıca, bu sinaptik QMI paneli otizm yedi fare modeli farklılıkları belirlemek için kullanılmıştır, kendi PiSCES biyoimzadayalı alt gruplar halinde modelleri küme, ve doğru daha önce tanınmamış bir paylaşılan moleküler açık hipotez modellerinden birinde16. Benzer bir yaklaşım, farklı uyuşturucu tedavilerine yanıt verebilecek diğer alt grupları taramak veya belirli duyarlı alt gruplara ilaç atamak için de kullanılabilir. QMI temel bilime ek olarak tanı, hasta alt yazma ve ilaç geliştirme potansiyel uygulamalara sahiptir.
QMI antikor paneli oluşturmak için, ilk antikor taraması ve seçim protokolleri Bölüm 1'de aşağıda açıklanmıştır. Antikor panelleri tanımlandıktan sonra, seçilen antikorların IP için manyetik boncuklara konjugasyonu ve seçilen prob antikorlarının biyotinylasyonu için protokoller Bölüm 2'de açıklanmıştır. Hücre veya doku lysates üzerinde QMI test çalıştırmak için protokol Bölüm 3 açıklanmıştır. Son olarak, tek bir deneme ~ 5 x 105 bireysel veri noktaları, talimatlar ve bilgisayar kodları veri işleme, analiz ve görselleştirme yardımcı üretebilir beri Bölüm 4 sağlanır. Bölüm 2-4'te açıklanan iş akışına genel bir bakış Şekil1'de gösterilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well flat bottomed plates</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171025001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">96-well PCR plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82006-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bioplex 200 System with HTF</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">171000205</td>
			<td>modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Bio-Plex Pro Wash Station</td>
			<td style="width:121px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:119px;">30034376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">BSA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">CML beads</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C37481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EDTA</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">MagPlex Microspheres</td>
			<td style="width:121px;">Luminex</td>
			<td style="width:119px;">MC12xxx-01</td>
			<td>xxx is the 3 digit bead region</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Melon Gel IgG Spin Purification Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45206</td>
			<td>used for antibody purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:237px;">MES</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Microplate film, non-sterile</td>
			<td style="width:121px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2920-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Phosphotase inhibitor cocktail #2</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sandwich Prep Refrigerator</td>
			<td style="width:121px;">Norlake</td>
			<td>SMP 36 15</td>
			<td>for custom refrigeration of Bioplex 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Streptavidin-PE</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">405204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Sulfo NHS</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Tris</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of protein interaction network dynamics using multiplexed co-immunoprecipitation

Dinamik protein-protein etkileşimleri, motiliteden DNA repliğine ve sinyal transdüksiyonuna kadar hücresel davranışı kontrol eder. Ancak, bir protein etkileşim ağında birden fazla protein arasındaki dinamik etkileşimleri izlemek teknik olarak zordur. Burada, Maruz Kalan Proteinlerin göreceli floresan ölçümlerine dayalı olarak protein etkileşimlerinde kat değişimlerinin kantitatif değerlendirmesini sağlayan Kantitatif Multipleks İmmünenyağış (QMI) için bir protokol sayılmiyoruz. Yüzey epitopleri (PiSCES). QMI'de, hücre lisatlarından gelen protein kompleksleri mikrokürelere immünpresipitat edilse ve pisces bolluğunu ölçmek için farklı bir protein için etiketli bir antikor ile incelenir. İmmünenen anatomikler farklı MagBead spektral bölgelere konjuge edilir, bu da bir akış sitometresinin birden fazla paralel immünoprepliti ayırt etmesini ve aynı anda her biriyle ilişkili prob antikor miktarını ölçmesini sağlar. QMI genetik etiketleme gerektirmez ve diğer immünopredipredityöntemleriile karşılaştırıldığında minimal biyomalzeme kullanılarak yapılabilir. QMI, etkileşim eden proteinlerin tanımlanmış herhangi bir grubu için uyarlanabilir ve şimdiye kadar T hücreleri ve nöronal glutamat sinapslarında sinyal ağlarını karakterize etmek için kullanılmıştır. Sonuçlar, potansiyel tanı ve tedavi uygulamaları ile yeni hipotez oluşumuna yol açmıştır. Bu protokol, ilk antikor paneli seçiminden çalışan tahlillere ve analiz verilerine kadar QMI'yi gerçekleştirmek için talimatlar içerir. Bir QMI tahlilinin ilk montajı, bir panel oluşturmak için antikorların taranmasını ve uygun bir lisis tamponunun ampirik olarak belirlenmesini içerir. Sonraki reaktif hazırlığı magbeadlar için kovalent kaplin immünopresian antikorlar içerir, ve bir streptavidin-konjuge florofile etiketlenmiş olabilir böylece biyotinilting prob antikorlar. Tofaş çalıştırmak için, lysate magbeads ile bir gecede karıştırılır, ve sonra boncuk bölünmüş ve farklı prob antikorları ile kuluçka, ve daha sonra bir florofor etiketi, ve akış sitometri tarafından okunur. PiSCES'i deneysel koşullar arasında önemli ölçüde farklılık gösteren iki istatistiksel test yapılır ve sonuçlar ısı haritaları veya düğüm kenarı diyagramları kullanılarak görselleştirilmiştir.

Antikor Taraması Şekil 2 B protein Connexin36 için bir ekran sonuçlarını gösterir. Ip_probe kombinasyonlarının çoğu IgG kontrolleri üzerinde sinyal üretmez. 1E5 veya poliklonal antikor 6200 ile monoklonal antikor 1E5 ve prob ile IP IgG kontrolleri ile karşılaştırıldığında boncuk dağılımında sağa doğru bir kayma üretir. Burada IP 1E5 ve probe 6200poly, hem spesifik olmayan bir proteinin iki bağımsız antikor tarafından tanın...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation at JoVE.com

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kantitatif Multipleks İmmünopantü (QMI), iki örnek arasındaki hedeflenen protein-protein etkileşimlerinin bolluğundaki farklılıkların hassas tespiti için akış sitometrisini kullanır. QMI biyomalzeme küçük bir miktar kullanılarak yapılabilir, genetiği değiştirilmiş etiketleri gerektirmez, ve daha önce tanımlanmış herhangi bir protein etkileşim ağı için adapte edilebilir.

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Kantitatif çokkatlı co-immünoprepitasyon veya QMI, kullanıcıların önceden tanımlanmış bir protein etkileşimağında aynı anda yüzlerce ikili etkileşimi ölçmelerini sağlar. Biyoinformatik teknikleri, aynı anda birden fazla eş-IP gerçekleştirerek, eş-ilişkilendirme gruplarının nasıl eşgüdümlü bir şekilde değiştiğini inceleyebilir. Tahse geliştirmek için zaman alıcı, ancak Bir kez QMI paneli elinde ağ ölçek verileri nispeten basit bir gecede tahse sinyal iletim sistemleri hakkında toplanabilir.QMI, farklı numunelerin ve reaktiflerin 96 kuyu plakasına doğru şekilde pipetlemesini gerektirir. Hataları önlemek için her bir titreyi kurarken ve çalıştırırken dikkatli notlar alınmalıdır. Numune hazırlama ve immünoprepitasyon için, numuneyi proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile uygun bir deterjanla buz üzerinde 15 dakikalık bir kuluçka için lysing ile başlayın.Kuluçka sonunda, membranları ve döküntüleri çıkarmak için numuneyi aşağı doğru çevirin ve standart protokollere göre protein konsantrasyonunu belirlemek için süpernatant üzerinde bca tayini yapın. Protein konsantrasyonlarını normale döndürtükten sonra, her sınıf için yaklaşık 250 manyetik boncuk içeren bir manyetik boncuk ana karışımı hazırlayın. Numune başına 20 mikrolitre Fly P tamponu boncukları yeniden sumadan önce fly P tamponunda manyetik boncuk karışımını iki kez yıkamak için manyetik ayırmayı kullanın.Ayrıntılı bir pipetleme den sonra, numune başına bir buz gibi mikrocentrifuge tüpüne 20 mikrolitre boncuk ekleyin ve immünoprediiçin her tüpe normalleştirilmiş protein konsantrasyonları ile eşit hacimlerde lysat ekleyin. Daha sonra her lysate numunesini çalıştırılan her bir plaka için bir tüpe bölün ve numuneleri ışıktan korunan dört derece lik bir rotatörde bir gecede immünoppresipitate edin. Ertesi sabah tüplerin ilk seti lysate kaldırmak ve yıkama başına buz gibi sinek P tampon 500 mikrolitre boncuk iki kez yıkamak için bir manyetik boncuk raf kullanın.Resuspension hacmi hesaplandıktan sonra, buz soğuk Fly P tampon hesaplanan hacminde immünoppresipitates resuspend. Manyetik boncukları nazik pipetleme ile iyice askıya alın ve buz üzerinde düz dipli 96 kuyu plakası boyunca her biri 25 mikrolitre boncuk dağıtın. Farklı bir 96 kuyu plaka, iki kez çalışma konsantrasyonu attinilated prob antikorları tarafından seyreltin.Her probuantikor seyreltme 25 mikrolitre dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın manyetik boncuk içeren manyetik boncuk uygun kuyulara ve karıştırmak ve manyetik boncuklar yeniden askıya almak için yatay bir plaka shaker üzerinde yüksek hızda sallamak. Karıştırma sonra, ışıktan korunan dört santigrat derece bir saat kuluçka için hızı azaltmak. Kuluçka sonunda, dört santigrat derece bir manyetik plaka yıkayarak başına taze Fly P tampon ile plaka üç kez yıkayın.Son yıkamadan sonra, streptavidin PE 50 mikrolitre boncuk resuspend Fly P tampon bir ila 200 seyreltilmiş. Karışımı salla ve ışığı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırmadan önce boncukları yeniden askıya alın. Kuluçka sonunda, plakayı manyetik plakalı bir çamaşır makinesinde Fly P tamponuyla üç kez yıkayın ve 125 mikrolitre Fly P tamponundaki boncukları yeniden askıya alın.900 dönüşte plakayı bir dakika boyunca çalkalayarak boncukları iyice askıya alın ve plakayı yeniden buzdolabına konan akış sitometresine yükleyin. Akış sitometre yazılımında, Yüksek RP1 Hedef ayarı, bölge başına 1.000 boncuk luk bir durdurma koşulu ve 80 mikrolitrelik bir örnek hacmi seçin. Yolu yarıladırve yerleşmeyi önlemek için boncukları askıya alın.Çalıştırmanın sonunda, veri dosyalarını XML biçiminde dışa aktarın. ANC çözümlemesi gerçekleştirmek için, deneysel tasarımın ayrıntılarını yansıtacak şekilde ANC giriş dosyasını doldurun ve etkin dizine bir CSV dosyası yazacak programı çalıştırın. Dosya isabetle bitiyor.csv, kontrol ve deneysel koşullar arasında 0,05 yanlış pozitif düzeyde önemli ölçüde farklı olan protein ortak çağrışımlarını dört deneysel kopyadan en az üçünde rapor edecektir. Ağırlıklı korelasyon ağ çözümlemesi için, mfi ile biten Matlab tarafından veri dosyası çıktısının sütun başlıklarını yapıştırın. csv yeni bir elektronik tablonun ilk sütununa ve deney numarası ve deney tedavisi için Tedavi ve analiz edilecek diğer değişkenler için Deney sütunları ekleyin.Bu dosyayı özellik olarak kaydedin. csv ve açık R Studio. Çalışma dizini mfi içeren bir klasöre ayarlayın.csv ve özellikleri. csv dosyaları, kod bölümlerini vurgulayın ve yorumlanan Komut dosyasında belirtildiği gibi R komutlarını çalıştırmak için Komut girin'i vurdu. Her bir deneysel özellik ile önemli ölçüde ilişkili ağırlıklı korelasyon ağ analizi modülleri bir grafik dosyası olarak çıktı ve her bir modül ile her etkileşimkore csv dosyası olarak çıktı olacaktır.ANC çıktı dosyasındaki her etkileşim için, bu etkileşimin CNA tarafından da önemli olup olmadığını belirleyin ve her ANC isabetinin de CNA isabeti olup olmadığını belirten yeni bir sütun oluşturun. Değerleri iki kat değişiklik günlüğe dönüştürün ve tüm ANC birleşim CNA isabetleri için ortalama değeri hesaplayın. Son olarak, immünopredem hedefi tarafından bir sütunda listelenen her ANC birliği CNA isabet, ikinci sütunda sonda hedefi ve üçüncü sütunda kat değişim değeri ile yeni bir elektronik tablo yapın.Düğüm kenarı diyagramı oluşturmak için bu dosyayı ağ olarak Cytoscape'e aktarın. İki bağımsız istatistiksel yaklaşımla tanımlanan yüksek güven protein etkileşimleri, açık kaynak yazılımı Cytoscape kullanılarak düğüm kenarı diyagramları veya ek malzemede yer alan R kodu ve analiz yönergeleri kullanılarak ısı haritaları olarak görselleştirilmiştir. Protokol boyunca, kullanıcıların pipetlere doğru bir şekilde dikkat etmesi, titiz kayıtları tutması ve numuneleri her zaman soğuk tutması gerekir.Sinyal transdüksiyon yollarının farklı giriş türleri arasında nasıl ayrım dığını ve birden fazla reseptörden gelen bilgileri nasıl entegre ettiğimizi anlamak için QMI'yi kullandık.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Co-immunoprecipitation tarafından Nükleer ve Sitoplazmik Kesirler Protein-protein Etkileşim görselleştirme ve<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Bio3D-web ile Protein Dizisi-yapı-dinamikleri İlişkilerinin İncelenmesi

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Reçine Destekli Yakalama, Protein Thiol Oksidasyonunun Çoklanmış Niceliği için İzobarik Tandem Kütle Etiketi Etiketleme ile Birleştirildiğinde

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...