Name: a minimally invasive lesion technique for muscles intrinsic to the odontophore of aplysia californica
Uploaded: 2019-08-16T15:00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Minimally Invasive Lesion Technique for Muscles Intrinsic to the Odontophore of Aplysia californica at JoVE.com

היינו רוצים להכיר בעבודה הקשה ששרי Niggel, סיסי לו, וג וו הכניסו לשיפור ולאימות הפרוטוקולים הללו. עבודה זו נתמכת על ידי NSF גרנט IOS 1754869.

Aplysia הם חסרי חוליות ולכן לא נתון לאישור IAUC. כדי למזער אי נוחות לבעלי חיים, ודא שהם מורדם לחלוטין לפני יישום טכניקות כירורגי המתוארות להלן.
1. בחירת בעלי חיים והפחתת ההרדמה
<ol><li>בחר בעל חיים פעיל על-ידי הצעת אותו אצות והמאשרת כי מרווחי הנשיכה אינם גדולים יותר מאשר בין 3 ו-5.</li>
	<li>
לשאת את החיה עם 0.333 מגנזיום טוחנת כלוריד (לראות את שולחן 1) על ידי הזרקת ליד הראש עם מחט של 18 גרם על מזרק 60 mL כך הריכוז הגבוה ביותר של הרדמה יהיה סביב המסה בוצ.
	<ol>
<li>לטפל לחדור הן האפיתל החיצוני ואת שכבת הרקמה הפנימית עם המחט. ודא כי הזריקה היא בערך תחת הלוע, באמצע הדרך בין הלוע ואת הרגל, ואת המחט צריך להיכנס בכיוון ההפוך, הצבעה לכיוון הלסתות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר 10 דקות, בעדינות לנסות להכניס את הפין לתוך הזימים והריפור, מוודא כי אלה לא לסגת, כדי להבטיח מספיק ההרדמה.</li>
	<li>ודא שהשפתיים והלסת של הסלאג רגועים, כך שניתן יהיה לחשוף את הדונפטופור. הערה: הקמטים על השפתיים של איור 2A מעיד על כך שהשפתיים והלסת של בעל החיים אינם רגועים מספיק להליך הכירורגי שיבוצע ללא נזק. השפתיים החלקות והרגועות של איור 2B מעידות על כך שהלסתות רגועות באופן מלא.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig2.jpg"> איור 2: מתח והרפיה באפליסיה . (א) aplysia מראה רמה גבוהה של מתח שרירים סביב השפתיים. זה תואם עם מתח הלסת התווית מצביע על המשך עם הניתוח. (ב) aplysia עם שפתיים רגועות, מראה את החלק הפנימי של הלסתות (אפור בהיר). הצבעים מתאימים שוב לאלה שנצפו בבעל החיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol start="5"><li>אם שפתי בעל חיים אינם רגועים, הכנס עוד 30 מ ל של מגנזיום כלוריד והמתן עוד 5 דקות. אם זה לא גורם לרגיעה שפתיים, להחזיר אותם מכולה מבודדת עם זרימת מים טובה כדי לאפשר להם להתאושש (ראה שלב 4) ולהמשיך עם בעל חיים שונים.</li>
</ol>2. חשיפת המשטח הRadular
<ol><li>מקמו את הקליע כך שהראש מסתובב כלפי מטה ומאפשר למסת המוח להתיישב מול הלסתות.</li>
	<li>הפעילו לחץ על האגודל והאצבע כדי לדחוף את מסת הבוצ לכיוון הלסתות, והחזיקו את המסה ההמונית במקום.</li>
	<li>לסובב את הלסתות כך שהם גלויים. באותו הזמן, לשמור על הלחץ על מסת בוצ, כך חרטום של מסה בוצ גלוי דרך הלסתות. (איור 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig3.jpg"> איור 3: תמיכה במסה בוצ כנגד הפנים של הלסתות. האצבעות תומכות המסה בוצ כי כבר דחף את הקצה הפנימי של הלסתות עד קצה הגלגל ניתן לראות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol start="4"><li>בעדינות לעבוד את קצות המלקחיים קהה לתוך החריץ של השיניים ולהשתמש בהם כדי למנוף את פני השטח radular דרך הלסתות. אם הלסתות אינן רגועות מספיק, השתמשו בלקחיים כדי לתפוס בעדינות את קצה החריץ כדי לסייע לתהליך זה. זהירות: הלחץ הזה מסכן. נזק גדול יותר לחיה</li>
	<li>לאחר חשיפת פני השטח, לעבוד את הלסתות לנקות את החלק הקדמי של פני השטח radular כל הדרך סביב המתחם. זה הופך את הדונטוורידים פחות סביר לחזור (איור 4). ודא כי לא יותר ממחצית קירות השיניים חשוף.</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig4.jpg"> איור 4: אבריון חלקי של השיניים. המשטח הradular נחשף במלואו, אך הצדדים של הפיטוורידים אינם חשופים, מה שהופך את זה לדבר חלקי בלבד. . ההמשך עלול לגרום נזק לחיה <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
הערה: במלוא הרצינות של הדונטופפור יגרום נזק השריר העיקרי שממנו בעלי החיים הם איטיים מאוד להתאושש.
3. חתכים כירורגיים
<ol><li>
לאחר משטח radular נחשף לגמרי, לסדר את הסלאג תחת היקף הניתוח עבור כירורגיה.
	<ol>
<li>לחילופין, השתמשו בגומייה רחבה וביד שלישית כדי לייצב את הלסתות ואת המשטח הradular לניתוח, במיוחד בזמן הלמידה. זה, עם זאת, מוסיף זמן ונזק רקמות מוגבר להליך, מה שהופך אותו אידיאלי פחות לטווח ארוך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מניחים את פני השטח הradular כך שהצד השולי פונה לחוקר.</li>
	<li>לתפוס בעדינות את פני השטח radular, ליד בסיס radular, כך קיפול אופקי נוצרת בניצב הקמט האנטומי. השימוש מספריים עדינים לחתוך את הקפל הזה, עושה חתך לאורך הקמט האנטומי (איור 5).</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig5.jpg"> איור 5: מיקום החתך אל פני השטח Radular. (א) Radular פני השטח, עם חתך. (ב) Radular פני השטח עם עיגולים המראים היכן גדילי השריר הדו I7 לצרף; קווים מנוקדים מציגים את מיקומם של השרירים היורדים מתחת לפני השטח הradular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol start="4"><li>להאריך את החתך הראשוני כדי 3-5 ס מ כדי לאפשר גישה לפנים של מסה בוצ.</li>
	<li>כוונן את האור כך שיצביע ישירות דרך החתך.</li>
	<li>חלק את קצות החתך כך את גבו של לומן של הדונפטופור ואת קווצות אנכי דק של שריר I7 גלויים. (איור 6)</li>
</ol><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig6.jpg"> איור 6: מיקום I7 דרך חתך פני השטח Radular. מסתכל דרך החתך, שני קווצות של I7 ניתן לראות בין המשטחים הפנימיים של I4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol start="7"><li>להגיע דרך החתך, לתפוס את שני קווצות של I7, ולמשוך אותם למעלה דרך החתך, שם ככל שהשריר ניתן לגזור כפי שהוא מעשי (איור 7).</li>
</ol><img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig7.jpg"> איור 7: משיכת השריר I7 שריר דרך החתך. שריר I7 הוא גמיש מאוד ניתן למשוך דרך החתך להסרת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
הערה: עם תרגול, זה בדרך כלל יעיל יותר לאתר I7 על ידי ההרגשה מאשר על ידי ראייה.
4. טיפול שלאחר הניתוח
<ol><li>לאחר נגעים בוצעו, לתפוס את זרועות הקדמי, ולדחוף למטה על פני השטח radular כדי להחזיר את הסלאג אל התצורה המקורית שלו.</li>
	<li>מניחים בעלי חיים שלאחר ניתוח בסביבה מוגנת עם זרימת מים טובה. . החמצן הוגבר מאיץ את ההחלמה ודא שבעלי החיים ערניים ומגיבים ביום שלאחר הניתוח. אם זה לא המקרה, ניתן להניח כי הם לא להתאושש. הערה: בדרך כלל, בעלי חיים יתחילו להיזון ביום הראשון או השני אחרי הניתוח. אפילו בעלי חיים כי הם מתקשים לנשוך צריך להיות מוצעים אצות, כפי שהוא התבוננות אנקדוטיים שההחלמה של החיה משופרת על ידי ניסיונותיה לאכול.</li>
</ol>5. עבור הנגע משנה radular סיבים
<ol><li>בצע את השלבים מ 1.1 עד 3.5</li>
	<li>הכנס את קצהו של להב אזמל ישר קטן (#11 או דומה) דרך החתך עם הקצה החדה בזווית כלפי מעלה. מגרדים בעדינות את סיבי השרירים הדקים מהצד התחתון של המשטח הradular. (איור 8).</li>
</ol><img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig8.jpg"> איור 8: לעבור את סיבי Subradular. הקצה של להב האזמל הוא בזווית מעלה דרך החתך אל החלק התחתון של המשטח radular, כך שהוא יכול לגרד בעדינות את סיבי sub-radular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol start="3"><li>. חזור לשלב 4.1</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pinsker, H., Kupfermann, I., Castellucci, V., Kandel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+and+Dishabituation+of+the+GM-Withdrawal+Reflex+in+Aplysia.">Habituation and Dishabituation of the GM-Withdrawal Reflex in Aplysia.</a> Science. 167, 1740-1742 (1970).</li><li>Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+Behavior+in+Aplysia:+A+Simple+System+for+the+Study+of+Motivation.">Feeding Behavior in Aplysia: A Simple System for the Study of Motivation.</a> Behavioral Biology. 10, 1-26 (1974).</li><li>Susswein, A. J., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+as+a+regulator+of+behavior:+New+ideas+from+Aplysia+feeding.">Nitric oxide as a regulator of behavior: New ideas from Aplysia feeding.</a> Progress in Neurobiology. 97, 304-317 (2012).</li><li>Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aplysia+feeding+biomechanics.">Aplysia feeding biomechanics.</a> Scholarpedia. 2, 4165 (2007).</li><li>Neustadter, D. M., Drushel, R. F., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinematics+of+the+buccal+mass+during+swallowing+based+on+magnetic+resonance+imaging+in+intact,+behaving+Aplysia+californica.">Kinematics of the buccal mass during swallowing based on magnetic resonance imaging in intact, behaving Aplysia californica.</a> Journal of Experimental Biology. 205, 939-958 (2002).</li><li>Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinematics+of+multifunctionality:+comparisons+of+biting+and+swallowing+in+Aplysia+californica.">The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica.</a> Journal of Experimental Biology. 210, 238-260 (2007).</li><li>Brezina, V., Evans, C. G., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+membrane+ion+currents+of+a+model+molluscan+muscle,+the+accessory+radula+closer+muscle+of+Aplysia+california.+I.+Hyperpolarization-activated+currents.">Characterization of the membrane ion currents of a model molluscan muscle, the accessory radula closer muscle of Aplysia california. I. Hyperpolarization-activated currents.</a> Journal of Neurophysiology. 71, 2093-2112 (1994).</li><li>Evans, C. G., Rosen, S., Kupfermann, I., Weiss, K. R., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Radula+Opener+Neuromuscular+System+in+Aplysia.">Characterization of a Radula Opener Neuromuscular System in Aplysia.</a> Journal of Neurophysiology. 76 (2), 1267-1281 (1996).</li><li>Cullins, M. J., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrode+Fabrication+and+Implantation+in+Aplysia+californica+for+Multi-channel+Neural+and+Muscular+Recordings+in+Intact,+Freely+Behaving+Animals.">Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals.</a> Journal of Visualized Experiment. (40), 1791 (2010).</li><li>Dudek, F. E., Cobbs, J. S., Pinsker, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bag+cell+electrical+activity+underlying+spontaneous+egg+laying+in+freely+behaving+Aplysia+brasiliana.">Bag cell electrical activity underlying spontaneous egg laying in freely behaving Aplysia brasiliana.</a> Journal of Neurophysiology. 42, 804-817 (1979).</li><li>Hermann, P., Maat, A., Jansen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neural+Control+of+Egg-Laying+Behaviour+in+the+Pond+Snail+Lymnaea+Stagnalis:+Motor+Control+of+Shell+Turning.">The Neural Control of Egg-Laying Behaviour in the Pond Snail Lymnaea Stagnalis: Motor Control of Shell Turning.</a> Journal of Experimental Biology. 197, 79-99 (1994).</li><li>Jansen, R. F., Pieneman, A. W., Ater Maat, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+Generation+in+the+Buccal+System+of+Freely+Behaving+Lymnaea+stagnalis.">Pattern Generation in the Buccal System of Freely Behaving Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Neurophysiology. 82, 3378-3391 (1999).</li><li>Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+the+appetitive+and+consummatory+phases+of+feeding+behavior+in+Aplysia:+a+lesion+study.">Dissociation of the appetitive and consummatory phases of feeding behavior in Aplysia: a lesion study.</a> Behavioral Biology. 10, 89-97 (1974).</li><li>Scott, M. L., Kirk, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+consummatory+feeding+behavior+after+bilateral+lesions+of+the+cerebral-buccal+connectives+in+Aplysia+california.">Recovery of consummatory feeding behavior after bilateral lesions of the cerebral-buccal connectives in Aplysia california.</a> Brain Research. 585, 272-274 (1992).</li><li>de Boer, P. A., Jansen, R. F., ter Maat, A., van Straalen, N. M., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinction+between+retractor+and+protractor+muscles+of+the+freshwater+snail&#8217;s+male+organ+has+no+physiological+basis.">The distinction between retractor and protractor muscles of the freshwater snail&#8217;s male organ has no physiological basis.</a> Journal of Experimental Biology. 213, 40-44 (2010).</li><li>Chiel, H. J., Weiss, K. R., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+identified+histaminergic+neuron+modulates+feeding+motor+circuitry+in+Aplysia.">An identified histaminergic neuron modulates feeding motor circuitry in Aplysia.</a> Journal of Neuroscience. 6, 2427-2450 (1986).</li><li>Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+patterns+of+the+B31/B32+pattern+initiators+innervating+the+I2+muscle+of+the+buccal+mass+during+normal+feeding+movements+in+Aplysia+californica.">Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica.</a> Journal of Neurophysiology. 75, 1309-1326 (1996).</li><li>Kier, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+hydrostatic+skeletons.">The diversity of hydrostatic skeletons.</a> Journal of Experimental Biology. 215, 1247-1257 (2012).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

הצעדים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם הצורך להבטיח כי בעל החיים הוא מורדם לחלוטין, וכי הציון של מסת בוצ הוא רק מספיק כדי לגשת השרירים הבסיסיים. זה עשוי לדרוש קצת תרגול כדי להשלים את השלבים הללו, אבל ברגע שהם שולט, התשואה של ניתוחים היא עשויה להיות גדולה מ 85% של כל הניסויים שנעשו. הדרך החשובה ביותר לשנות ולפתור בעיות הפרוטוקול היא לבלות זמן לבצע ניתוח של מסה בוצ, כך שמיקומי השרירים הפנימיים ברורים לחלוטין לחוקר. מכיוון החתך הציע דרך פני השטח radular בהכרח גורם נזק לסיבים sub-radular הבסיסית, זה עשוי להיות מתאים לשנות את המיקום המדויק של החתך כדי למנוע אזורים ספציפיים של סיבים אלה.
מגבלה אחת של הטכניקה כירורגית היא כי ייתכן השפעות שאינן ספציפיות על תגובות האכלה, כגון חוזק של המתיחה. אחת הדרכים להתגבר על מגבלה זו היא שבעלי חיים משמשים כפקדים שלהם. בנוסף, חשוב להיות קבוצת נגעים מזויפים הנתונה לפרוטוקול הכירורגי כולו, למעט הסרת השריר הספציפי (כלומר, I7 או ה-SRFs). על ידי ביצוע הצעות אלה, חוקר תפחית את ההשפעות של השונות בין בעלי חיים יש מדד מהותי של ההשפעות הלא ספציפיות של הניתוח.
העבודה הקודמת השתמשה גישות דרך קיר הגוף כדי לנגע או להקליט מפני העצבים13,14, או שרירים15,16,17. במעבדה שלנו, יש לנו anecdotally נצפו כי חתכים בקיר הגוף מלווים לעתים קרובות על ידי אובדן משמעותי של המוליקמ ובכך של נפח הגוף. בעלי חיים דורשים לעתים קרובות מספר ימים כדי להתאושש מזה, ואם הנגע בקיר הגוף לא בזהירות משמים, בעלי חיים לא יכול להתאושש. בנוסף, בדיקה שלאחר המוות של בעלי החיים מגלה הצטלקות ניכרת סביב החתך ותגובה חיסונית חזקה (אנקדוטיים). לעומת זאת, בעלי חיים לא מראים אובדן של המוליקמ או שינוי נפח הגוף לאחר התאוששות מהפרוטוקול המתואר כאן (מבוסס על תצפיות 96 בעלי חיים).
יישומים עתידיים של הטכניקה עשויים להאריך אותה לשרירים אחרים בתוך מנגנון ההזנה של Aplysia, ולבעלי חיים אחרים. התמקדנו בהסרת השריר I7 ו-sub-radular סיבים. אלה טכניקות כירורגית כלליות גם לאפשר גישה לרוב השרירים האחרים של הדונטופפור. חלק מאלה, כגון החלק הפנימי של השריר I5, הם הטובים ביותר גישה דרך פני השטח radular. אחרים, כמו העלונים הפנימיים של I4, יכול להיות הגיע טוב יותר דרך האפיתל החיצוני של הדונטופפור. יש לנו ניסויים ראשוניים שבו החתך תחת radular שסועה של מותר באופן חלקי evertop לגשת לקרס מחודד להיות מוכנס כי יכול לשמש לנגע שריר נוסף בתוך הדונטופפור, שריר I88. מכיוון שהפרוטוקול הכירורגי המתואר כאן אינו פותח את חלל הגוף הראשי, אין צורך בשום מבצע.
הפרוטוקול שתיארנו יכול להיות עניין כללי לחוקרים אחרים העובדים על מבני רקמה רכה שאחרת יהיה קשה לתמרן, למשל, מכשיר האכלה של רכיכות אחרות. באופן כללי יותר, פרוטוקול זה יכול להציע גישות אחרות כירורגי הרומן ניתוח של מבנים רכים כגון לשונות, גזעי או זרועות18.

מערכת האכלה של ליסיה קליפורניקה יש היסטוריה ארוכה של שימוש כמערכת מודל להבנת למידה וזיכרון1, התנהגויות מוטיבציה2,3, ואת האינטראקציה בין התנהגות, ביומכניקה ו שליטה עצבית בזמן האכלה4. יש מעגלים עצביים נגישים מאוד, עם מספר קטן יחסית של נוירונים גדולים, הניתנים לזיהוי. לחיה מערכת מחזור הדם פתוחה למחצה, ומאפשרת גישה לרבים מהמבנים הפנימיים שלו מבלי לגרום לנזק משמעותי. הוא גם חזק למניפולציות רבות הן בvivo והן בתוך מבחנה, מה שהופך אותו למודל מאוד מעוקב לניתוח של התנהגות ומעגלים עצביים.
כדי להבין את הדפוסים העצביים הגורמים להתנהגויות האכלה, חשוב לתאר את המכניקה הבסיסית של המבנה הרך היוצר את איבר ההזנה, מסת הבקאל4. בעוד יש עבודה שנעשתה כדי לאפיין את השרירים החיצוניים המהווה את המסה בוצ5,6, את השרירים הפנימיים של המבנה הבסיסי בתוך מסה בוצ השולט על פני השטח של גמור, הדונטופפור, היו לא נגיש במידה רבה בניסויים vivo. למרות שהיו במחקרים מחוץ לגופית על הפונקציות של חלק מהשרירים האלה7,8, היעדר גישה ישירה לשרירים אלה הקשה ללמוד את תפקידם בבעלי חיים שלמים ומתנהגים.
רוב הטכניקות עבור השרשה אלקטרודות או נגעים aplysia או רכיכות דומה מינים דורשים כי קיר הגוף יפתחו9,10,11,12. פתיחת קיר הגוף גורמת לפציעה אפיתל, ואת החתך חייב להיות אטום באופן מאובטח כדי למנוע המוליקמ להימלט. קשיים רציניים אפילו יותר הם הציבו כאשר מנסים להגיע השרירים הפנימיים של גמור של Aplysia (השרירים המשמשים את פני השטח radular או בתוך הדונטופפור): לאחר שנכנס דרך חלל הגוף הראשי, יש לעבור לאחר מכן דרך כמה חלק של הקיר השרירי של מסה בוצ כדי לקבל גישה למבנים הפנימיים (איור 1A). זו פציעה מצטברת וקושי של גישה עשה את הגישה דרך קונבנציונאלי אמצעים בעייתיים כי בעלי חיים לא להתאושש היטב מניתוחים אלה (של בעלי חיים עם בעיות מלאות, רק 17% חזר כל יכולת האכלה, N = 12. סביב 85% של בעלי חיים שאינם everted חזרו היכולת להאכיל, N = 84).
שריר I7, אשר מאופיין כפותחן radular8, הוא עמוק בתוך הדונפטוהור עצמו, עוד מסבך את הגישה. היא משתרעת בין הבסיס של הradular (איור 1C) והחלק התחתון של משטח הradular, דרך לומן בדונפטופור (איור 1c). על שלושה צדדים של שרירי I7 הם קירות של שריר, והקיר הרביעי מורכב radular גבעול. לצורך מחקר ביומכאני, ליקוי גדול לכל מבנה אלה עלול לפגוע בתפקוד הרגיל של מנגנון ההזנה. פיתחנו גישה הרומן של העבודה הדונטופד החוצה דרך הלסתות, ולנהל את הניתוח באמצעות חתך לפני השטח radular דק, הסחוס, שאפשרו לנגע שריר I7, כמו גם לאחרונה תיאר סיבי שריר בסדר ש לרוץ ממש מתחת לפני השטח radular, אשר אנו מתייחסים כמו סיבי sub-radular (איור 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig1.jpg"> איור 1: סקירה אנטומי. (A) מיקום המסה בתוך aplysia. (ב) אנטומיה חיצונית של שפיטופור. פני השטח של רדולה ו radular sac הם צהובים; שרירי החיבור של הדונפטופור מוצגים באדום, על בסיס הצבעים הממשיים שלהם. (ג) משונן קטע של דונפטופור, המראה את המיקום של סיבים תת radular (קו ורוד מעוקל) ו I7 שריר (קו ישר ורוד). חתך החלק של השריר I6 מוצג אדום כהה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11210-10</td>
			<td>2 pair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade (#11)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Webcam</td>
			<td>Logitech</td>
			<td>c920</td>
			<td>for recording data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a minimally invasive lesion technique for muscles intrinsic to the odontophore of aplysia californica

מערכת מודל ללימוד השליטה העצבית בלמידה ובהתנהגות. לחיה זו מערכת של מחזור הדם פתוח למחצה, ומאפשרת גישה לרבים מהמבנים הפנימיים שלה מבלי לגרום לנזק משמעותי. מניפולציות רבות ניתן לבצע בקלות הן בvivo והן בתוך מבחנה, מה שהופך אותו מודל צייתן מאוד לניתוח של התנהגות ומעגלים עצביים. כדי להבין טוב יותר את הפונקציות של השרירים בתוך גמור האכלה, פיתחנו טכניקה עבור מתיחה אותם מבלי לפתוח את חלל הגוף העיקרי של בעל החיים או להזיק את השכבות החיצוניות של איבר האכלה (כלומר, המסה בוצ). בטכניקה זו, גמור הוא חלקית באופן חלקי, המאפשר גישה ישירה לשרירים. הליך זה מאפשר לבעלי חיים להתאושש במהירות ובאמינות. זה איפשר לנגע השרירים I7 וסיבים sub-radular, המאפשר לנו להראות כי שני השרירים לתרום באופן משמעותי את הפתיחה ב vivo.

העבודה הקודמת הציע כי שריר I7 תרם לפתיחת גמור8. מחקרים אנטומיים שלנו הציע כי סיבי sub-radular עשוי גם לתרום לפתיחת גמור. כדי לבחון את ההשערות הללו, בעלי חיים המושרה לייצר נשיכות הן לפני ואחרי קבלת הליך כירורגי. בעלי חיים היו חשופים לכל הצעדים המנתחים, כולל החתך במשטח הradular, אך לא הוסרו שרירים פנימיים. בעלי חיים שנחשפו לנגע I7 היו שרירי I7 הוסרו. בעלי חיים שנחשפו לנגע תת סיבים radular היה ~ 25% של סיבי sub-radular הוסרו מיד מתחת לחתך. הנגעים שאם לא היתה השפעה משמעותית על רוחב של הפתיחה בשיא של נשיכות, ואילו הן I7 ו-sub-radular נגעים סיבים להפחית באופן משמעותי את רוחב הנשיכה (איור 9).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig9.jpg"> איור 9: תוצאות נגעים על רוחב הפתיחה במהלך הנשיכות בשיא. נתונים המוצגים הם ההבדלים בין רוחב הפתיחה המנורמל בממוצע של רדולה לפני ואחרי הליך כירורגי עבור 5 בעלי חיים בכל אחת משלוש הקבוצות (שאם הפצע, I7, או הנגע srf), כאשר כל בעל חיים משמש כשליטה משלה. ממוצעים נלקחו 5 עקיצות לפני, ו 5 עקיצות לאחר ההליך הכירורגי כדי לקבוע את ההבדל מנורמל מתכוון. רוחב הפתיחה היה המרחק ממרכז רדולה לקצה radular בשיא המתיחה, מנורמל על ידי המרחק מן המשטח הפנימי של בסיס radular אל הקצוות הצדדיים של המשטח הradular. ההבדלים מוצגים כאמצעי בתוספת או פחות סטיית התקן. לאחר הקמת הנתונים שההבדל הופץ בדרך כלל, ההסתברות כי הנגע לא היתה השפעה נקבע (כלומר, ההשערה null נבדק כי ההשפעות של ההליכים כירורגי יהיה אפס, בממוצע) על ידי החלת מזווג t-test לכל קבוצה עצמאית. הנתונים מדגים כי הנגע המזויף לא היתה השפעה משמעותית, בעוד נגע של שרירי I7 או נגע של סיבי sub-radular היה השפעה משמעותית על radular פתיחה (p < 0.031 עבור הקבוצה הנגע I7, המצוין עם כוכבית אחת , או p < 0.002 עבור קבוצת הנגעים SRF, המצוינת על-ידי כוכבית כפולה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>משקל הגוף</td>
			<td>מנה מגנזיום כלוריד</td>
		</tr>
<tr>
<td>< 200 גרם</td>
			<td>1/2 משקל גוף</td>
		</tr>
<tr>
<td>200-350 גרם</td>
			<td>1/3 משקל גוף</td>
		</tr>
<tr>
<td>350-450 גרם</td>
			<td>1/4 משקל גוף</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מינון מגנזיום כלוריד במשקל גוף.

Watch this Scientific Journal Video about A Minimally Invasive Lesion Technique for Muscles Intrinsic to the Odontophore of Aplysia californica at JoVE.com

A Minimally Invasive Lesion Technique for Muscles Intrinsic to the Odontophore of Aplysia californica

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור כירורגי מינימלית פולשנית של השרירים הפנימיים למנגנון האכלה של שבלול ימית הaplysia קליפורניה כדי להבין את התפקידים של שרירים אלה בעת האכלה התנהגות.

שיטה מינימלית פולשנית לשרירי השרירים הפנימיים של השיניים של Aplysia קליפורניה

Aplysia californica is a model system for studying the neural control of learning and behavior. This animal has a semi-open circulatory system, making it ...

מערכת ההזנה של Aplysia שימשה זמן רב כמערכת מודל לחקר שליטה מוטורית וביומכניקה של גוף רך. עם זאת, השרירים עמוק בתוך אחיזת ההאכלה לא היו נגישים למניפולציה vivo. ניתוח זה מאפשר לנו לגשת לשרירים אלה בבעלי חיים מתנהגים ללא פגע.לא רק שזה מאפשר לנו גישה vivo בפעם הראשונה, אבל הטכניקה כרוכה חתך אחד לחלק אחד של שבלול, כלומר הנזק לאזורים האחרים הם קטנים יחסית. ההכנה הטובה ביותר היא לעשות ניתוחים זהירים של המסה buccal ולהכיר את עצמך ביסודיות עם האנטומיה. בחר בעל חיים פעיל על-ידי הצעת אצות ואשר כי מרווחי הנשיכה אינם גדולים מחמש שניות.10 דקות לאחר ההרדמה, בעדינות לנסות להכניס סיכה לתוך הזית ואת rhinophore, אימות כי אלה אינם לסגת כדי להבטיח הרדמה מספקת. ודא כי השפתיים של הקליע הם חלקים, המציין את הלסתות רגועים לחלוטין. בדרך זו, אודונטופור נחשף.במקרה בו מופיעה קמטים על השפתיים, שפתיה ולסתה של החיה אינן רגועות מספיק לצורך ההליך הכירורגי. עיין בכתב היד לקבלת טיפים על גרימת הרפיה בשפה. מקם את הקליע כך שהראש יתלה כלפי מטה, מה שיאפשר למסה הבוקלית להתיישב כנגד הלסתות.החל לחץ עם האגודל והאגודל כדי לדחוף את המסה buccal לכיוון הלסתות, מחזיק את המסה buccal במקום. סובב את הלסת כך שהם יהיו גלויים. יחד עם זאת, לשמור על הלחץ על המסה buccal, כך צנית של המסה buccal גלוי דרך הלסתות.בעדינות לעבוד את קצות המלקחיים קהה לתוך שסוע של odontophore ולהשתמש בהם כדי למנף את פני השטח radular דרך הלסתות. אם הלסתות אינן רגועות מספיק, השתמש במלקחיים כדי לתפוס בעדינות את קצה ה שסוע כדי לסייע בתהליך זה. ברגע שהמשטח נחשף, תעבוד על הלסתות נקיות מהחלק הראשון של המשטח הצווארי לאורך כל ההיקף.זה עושה את האודונטופור פחות סביר לחזור בו. ודא כי לא יותר ממחצית הקירות של odontophore נחשף. לאחר משטח radular חשוף לחלוטין, לסדר את הקליע תחת מיקרוסקופ ניתוח לניתוח.עבור מדענים עם פחות ניסיון, השתמש גומייה רחבה ויד שלישית כדי לייצב את הלסתות ואת פני השטח radular לניתוח. מקם את משטח הצוואר כך שהצד שסוע פונה החוקר. תופסים בעדינות את המשטח הצווארי ליד בסיס הצוואר כך שנוצר קיפול אופקי בניצב לקמט האנטומי.השתמש מספריים עדין לחתוך דרך קיפול זה, מה שהופך חתך לאורך הקמט האנטומי. הרחב חתך ראשוני זה לשלושה עד חמישה סנטימטרים כדי לאפשר גישה לפנים המסה הבוקלית. כוונן את האור כך שיכוון ישירות חזרה דרך החתך הזה.חלק את הקצוות של החתך, כך החלק האחורי של לומן של odontophore ואת הגדילים האנכיים הדקים של שריר I7 גלויים. הוש להגיע לתוך החתך. לתפוס את שני הגדילים של I7 ולמשוך אותם דרך החתך, שבו כמה שיותר של השריר ניתן לחתוך כמו מעשי.לאחר ביצוע נגעים, לתפוס את זרועות הציד קדימה ולדחוף אותם על פני השטח radular להחזיר את הקליע לתצורה המקורית שלה. מניחים בעלי חיים לאחר ניתוח בסביבה מוגנת עם זרימת מים טובה. ודאו שבעלי החיים ערניים ומגיבים ביום שלאחר הניתוח.ביום הראשון או השני לאחר הניתוח, בעלי חיים מתחילים לאכול. כדי לבצע הנגע סיבים תת-רדולרי לאחר חתך כירורגי, הכנס את קצה להב אזמל קטן וישר דרך החתך כשהקצה החד זוויתי כלפי מעלה. מגרדים בעדינות את סיבי השרירים העדינים מהצד התחתון של המשטח הצווארי.לאחר מכן, בצע טיפול לאחר הניתוח כבעבר. במחקר אנטומי זה, נגעים מזויפים לא הייתה השפעה משמעותית על רוחב הפתח בשיא לנשוך. בעוד שגם I7 וגם נגעים סיביים תת-רדולריים אכן הפחיתו באופן משמעותי את רוחב הנשיכה.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא כי השפתיים והלסתות של החיה רגועים לחלוטין לפני שתנסה לדחוף את האוחז החוצה דרך הלסתות. סביר להניח, הן I7 והן סיבים sub-radular הם שרירים רב תכליתיים ואנחנו רק זיהינו היבטים מסוימים של ההתנהגות שאליה הם תורמים. בנוסף, טכניקה זו של להאריך את odontophore נותן גישה לחלקים שלמים של האנטומיה שהיו נגישים בעבר.מלבד פתיחת אזורים אנטומיים וביומכניקה של גוף רך, אנו מקווים שזה עשוי לשמש בסיס לחוקרים אחרים שעובדים עם מבנים רכים שאחרת יהיה קשה לחקור.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Minimally Invasive Lesion Technique for Muscles Intrinsic to the Odontophore of Aplysia californica

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

אלקטרודה ייצור השרשה ב Aplysia californica עבור הקלטות רב ערוצי עצבית ושרירי ב, חיים שלמים חופשי מתנהג

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal.  ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

ניתוח Stereotaxic על הנגע Excitotoxic של אזורי מוח ספציפיים עכברוש למבוגרים בלבד

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

<em&gt; במבחנה</em&gt; הכנה להפקה והקלטה של ​​תוכניות רכב האכלה עם תנועות פיסיולוגיות<em&gt; Aplysia californica</em

Multifunctionality, the ability of one peripheral  structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals  to rapidly adapt their behaviors ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracellularly זיהוי תאי עצב מוטורי לשריר בברכת מוטור<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; Aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

טכניקה זעיר-פולשני להזרקה לתוך עצב העכברוש אופטי

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

זריקות לשריר לאורך צלחות מוטוריות סיום: גישה פולשנית להסעות קליעים נותבים ישירות לתוך מנוע נוירונים

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Endoscopic Endonasal Trans-sphenoidal Approach: Minimally Invasive Surgery for Pituitary Adenomas

בגישה אנדוסקופית דרך האף טרנס-sphenoidal: כירורגיה זעיר פולשנית עבור אדנומות בבלוטת יתרת המוח

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary ...