Name: three-dimensional angiogenesis assay system using co-culture spheroids formed by endothelial colony forming cells and mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-09-18T12:30:00
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Diese Forschung wurde durch ein Stipendium (17172MFDS215) des Ministeriums für Lebensmittel- und Arzneimittelsicherheit, die von der koreanischen Regierung (MSIP) (2017R1A2B4005463) und dem Basic Science Research Program durch die National Research Foundation of Korea (NRF) finanziert vom Bildungsministerium (2016R1A6A1A03007648).

Human EFCCs wurden aus menschlichem peripherem Blut isoliert, wie in einem früheren Bericht27beschrieben. Kurz gesagt, wurde die mononukleäre Zellschicht mit dem Ficoll-Paque Plus vom Ganzen Blut getrennt und im richtigen Medium kultiviert, bis die endotheliaden Kolonien auftauchten. Kolonien wurden gesammelt und EFCCs wurden mit CD31-beschichteten Magnetperlen isoliert. MSCs wurden aus dem anhaftenden mononukleären Zellanteil (MNC) des menschlichen erwachsenen Knochenmarks isoliert. Das Studie...

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Die vorliegende Studie führt ein verbessertes In-vitro-Angiogenese-Assay-System ein, das Co-Kultur-Sphäroide verwendet, die von zwei menschlichen Vaskulärenvorläufern, EFCCs und MSCs, gebildet werden. Durch Wechselwirkung und Einbeziehung zwischen Endothelzellen und Pericyten erreicht. Im Vergleich zu anderen In-vitro-Angiogenese-Assays, die nur die von ECs vermittelte Angiogenese widerspiegeln, ist dieses Co-Kultur-Assay-System repräsentativer für die mehrstufige Kaskade der physiologischen Angiogenese, einschlie?...

Es wird erwartet, dass weltweit rund 500 Millionen Menschen von einer angiogenesemodulierenden Therapie bei vaskulären Fehlbildungen wie rheumatoider Arthritis, Okulopathie, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Tumormetastasen profitieren1. So ist die Entwicklung von Medikamenten, die die Angiogenese kontrollieren, zu einem wichtigen Forschungsgebiet in der pharmazeutischen Industrie geworden. Während des Arzneimittelentwicklungsprozesses ist eine in-vivo-Tierstudie notwendig, um die Auswirkungen von Wirkstoffkandidaten auf physiologische Funktionen und systemische Wechselwirkungen zwischen Organen zu untersuchen. Ethische und Kostenfragen haben jedoch die Bedenken in Bezug auf Tierversuche verstärkt2. Daher sind verbesserte In-vitro-Assay-Systeme erforderlich, um genauere und berechenbarere Daten zu erhalten, die zu einer besseren Entscheidungsfindung vor Tierversuchen führen. Aktuelle In-vitro-Angiogenese-Assays messen in der Regel proliferations-, Invasions-, Migrations- oder tubuläre Strukturbildung von Endothelzellen (ECs), die in zweidimensionalen (2D) Kulturplattengesätsind 3 . Diese 2D-Angiogenese-Assays sind schnell, einfach, quantitativ und kostengünstig und haben wesentlich zur Entdeckung von Angiogenese-modulierenden Medikamenten beigetragen. Einige Fragen müssen jedoch noch verbessert werden.
Solche 2D-In-vitro-Assay-Systeme können keine komplexen mehrstufigen Ereignisse der Angiogenese widerspiegeln, die in in vivo physiologischen Bedingungen auftreten, was zu ungenauen Ergebnissen führt, die Diskrepanzen zwischen In-vitro-Assay-Daten und klinischen Studienergebnissen verursachen4. 2D-Kulturbedingungen induzieren auch die Veränderung der zellulären Phänotypen. Zum Beispiel haben ECs nach der Proliferation in 2D-Kulturplatten einen schwachen zellulären Phänotyp, der sich durch eine reduzierte Expression von CD34 und mehrere Signale manifestiert, die die zellulären Antworten steuern5,6. Um die Grenzen von 2D-Kultur-basierten Angiogenese-Assay-Systemen zu überwinden, wurden dreidimensionale (3D) Sphäroid-Angiogenese-Assay-Systeme entwickelt. Sprouting gefolgt von röhrenförmiger Strukturbildung aus Sphäroiden, die von ECs gebildet werden, reflektieren in vivo Neovaskularisationsprozesse7,8. So wurde der 3D-Sphäroid-Angiogenese-Assay als wirksames Assay-System zum Screening potenzieller Pro- oder Anti-Angiogenese-Medikamente betrachtet.
Die meisten 3D-Sphäroid-Angiogenese-Assays verwenden nur ECs, hauptsächlich menschliche Nabelvenenen-Endothelzellen (HUVECs) oder menschliche dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMECs), um sich auf die zelluläre Reaktion von ECs während der Angiogenese zu konzentrieren. Die Blutkapillaren bestehen jedoch aus zwei Zelltypen: ECs und Pericyten. Die Ausarbeitung einer bidirektionalen Interaktion zwischen ECs und Pericyten ist entscheidend für die richtige Gefäßintegrität und -funktion. Mehrere Krankheiten, wie erblicher Schlaganfall, diabetische Retinopathie und venöse Fehlbildung, sind mit veränderter Pericytdichte oder verminderter Pericyt-Anhaftung an das Endothel9verbunden. Pericyten sind auch als Schlüsselelement des angiogenen Prozesses bekannt. Perizyten werden rekrutiert, um neu gebildete Gefäßstrukturen durch ECs zu stabilisieren. In dieser Hinsicht enthält Mono-Kultur Sphäroid Angiogenese Assay keine Pericyten7,10. Daher können Co-Kultur-Sphäroide, die durch ECs und Pericyte gebildet werden, einen wertvollen Ansatz bieten, um physiologische angiogene Ereignisse genauer nachzuahmen.
Die vorliegende Studie zielte darauf ab, einen 3D-Kokultur-Sphäroid-Angiogenese-Assay mit einer Kombination von humanen endotheliaalen Koloniebildenden Zellen (EFCKw) und mesenchymalen Stammzellen (MSCs) zu entwickeln, um die In-vivo-Angiogenese genauer widerzuspiegeln. Das Co-Kultur-Sphäroidsystem als In-vitro-Repräsentationsassembly eines normalen Blutgefäßes wurdeerstmals 2001 von Korff et al. gegründet. Sie kombinierten HUVECs und menschliche Nabelarterie glatte Muskelzellen (HUSMCs), und zeigten, dass die Kokultur von zwei reifen Gefäßzellen das Keimpotenzial verringerte. Reife ECs (HUVECs) sind dafür bekannt, nach und nach ihre Fähigkeit zu vermehren und zu differenzieren, was sich negativ auf ihre Angiogenese-Antworten auswirkt12,13. Reife perivaskuläre Zellen (HUSMCs) können eine Endothelzellinaktivierung durch Abrogation des vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktors (VEGF) anregung11verursachen. Der Hauptunterschied zwischen Korffs und unserem Co-Kultur-Sphäroidsystem sind die verwendeten Zelltypen. Wir wandten zwei vaskuläre Vorläufer, EFCKw und MSCs, an, um ein geeignetes Angiogenese-Assay-System zu etablieren, um pro-oder-antiangiogene Wirkstoffe zu untersuchen und zu untersuchen. Die EFC-Staaten sind die Vorläufer von ECs. Die EFCKW verfügen über eine robuste Proliferationskapazität im Vergleich zu ausgereiften ECs14, die es ermöglichen, die Begrenzung der ECs zu überwinden. EFCKW tragen zu einer neuen Gefäßbildung unter vielen postnatalen pathophysiologischen Erkrankungenbei 15,16,17. MSCs sind pluripotente Stammzellen, die in pericyte differenzieren können und so zur Angiogenesebeitragen 18,19.
In früheren Berichten zeigten EFCCs und MSCs synergistische Effekte auf die In-vitro-Rohrbildung20, in vivo Neo-Vaskularisation21,22und verbesserte Reperfusion von ischämischen Geweben23,24. In der vorliegenden Studie wurden EFCCs und MSCs verwendet, um Co-Kultur-Sphäroide zu bilden und in Kollagengel Typ I eingebettet, um eine in vivo 3D-Umgebung widerzuspiegeln. Kollagen gilt als hauptbestandteil der extrazellulären Matrix (ECM) um ECs25. Das ECM spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Zellverhaltens26. Das hier vorgeschlagene Assay-Protokoll kann innerhalb von zwei Tagen mit gängigen Labortechniken einfach und schnell durchgeführt werden. Für eine effektive Zellverfolgung während des Keimvorgangs kann jeder Zelltyp mit einem Echtzeit-Zellrecorder fluoreszierend beschriftet und überwacht werden. Das neu eingerichtete 3D-Cokultur-Sphäroid-Angiogenese-Assay-System wurde entwickelt, um die Empfindlichkeit für die Bewertung potenzieller angiogener Modulatoren zu erhöhen und vorher im Vorfeld der in vivo-Studie vorhersagbare Informationen bereitzustellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:709px;" width="708">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.05 % Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25300-054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Bevacizumab</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:161px;">NA</td>
			<td>Commercial name: Avastin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dulbecco Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">11885-084</td>
			<td>DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">21600-010</td>
			<td>PBS (10X)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered saline (1X)</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">21-031-CVR</td>
			<td>PBS (1X)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Endothelial cell Growth medium MV2 kit</td>
			<td style="width:123px;">Promocell</td>
			<td style="width:161px;">C-22121</td>
			<td>ECGM-MV2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:123px;">Atlas</td>
			<td style="width:161px;">FP-0500A</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Gelatin</td>
			<td style="width:123px;">BD Sciences</td>
			<td style="width:161px;">214340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutamine&#8211;Penicillin&#8211;Streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10378-016</td>
			<td>GPS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Mesenchymal stem cell growth medium-2</td>
			<td style="width:123px;">Promocell</td>
			<td style="width:161px;">C-28009</td>
			<td>MSCGM-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">MINI26</td>
			<td>PKH26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">MINI67</td>
			<td>PKH67</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Type I collagen gel</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Vascular endothelial growth factor A</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:161px;">293-VE-010</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
	</tbody>
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three-dimensional angiogenesis assay system using co-culture spheroids formed by endothelial colony forming cells and mesenchymal stem cells

Studien auf dem Gebiet der Angiogenese haben in den letzten Jahrzehnten aggressiv zugenommen, mit der Erkenntnis, dass Angiogenese ein Kennzeichen von mehr als 50 verschiedenen pathologischen Erkrankungen ist, wie rheumatoide Arthritis, Okulopathie, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Tumormetastasen. Während der Entwicklung von Angiogenese-Medikamenten ist es entscheidend, In-vitro-Assay-Systeme mit geeigneten Zelltypen und geeigneten Bedingungen zu verwenden, um den physiologischen Angiogenese-Prozess widerzuspiegeln. Um die Einschränkungen der aktuellen In-vitro-Angiogenese-Assay-Systeme mit hauptsächlich Endothelzellen zu überwinden, haben wir ein dreidimensionales (3D) Co-Kultur-Sphäroid-Sprossen-Assay-System entwickelt. Co-Kultur-Sphäroide wurden von zwei menschlichen Gefäßzellvorläufern, endotheliaalen koloniebildenden Zellen (EFCCs) und mesenchymalen Stammzellen (MSCs) mit einem Verhältnis von 5 zu 1 hergestellt. EFCCs+MSCs Sphäroide wurden in die Kollagenmatrix typ I eingebettet, um die extrazelluläre In-vivo-Umgebung nachzuahmen. Ein Echtzeit-Zellrekorder wurde verwendet, um kontinuierlich das Fortschreiten des angiogenen Keimens von Sphäroiden für 24 h zu beobachten. Live-Zell-Fluoreszenz-Etikettierungstechnik wurde auch angewendet, um die Lokalisation jedes Zelltyps während der Sprossenbildung zu traktieren. Das angiogene Potential wurde quantifiziert, indem die Anzahl der Sprossen gezählt und die kumulative Länge der aus den einzelnen Sphäroiden erzeugten Sprossen gemessen wurde. Pro Versuchsgruppe wurden fünf zufällig ausgewählte Sphäroide analysiert. Vergleichsexperimente zeigten, dass EFCCs+MSCs Spheroide eine höhere Sprossenzahl und kumulative Sprossenlänge zeigten als EFCCs-Sphäroide. Bevacizumab, ein von der FDA zugelassener Angiogenese-Hemmer, wurde mit dem neu entwickelten Co-Culture-Sphäroid-Assay-System getestet, um sein Potenzial zur Untersuchung antiangiogener Medikamente zu überprüfen. Der IC50-Wert für EFCCs+MSCs-Sphäroide im Vergleich zu den EFCCs-Sphäroiden war näher an der effektiven Plasmakonzentration von Bevacizumab, die aus dem Xenograft-Tumor-Mausmodell gewonnen wurde. Die vorliegende Studie legt nahe, dass das Sphäroid-Angiogenese-Assay-System von 3D-EFCCs+MSCs für die physiologische Angiogenese relevant ist und eine effektive Plasmakonzentration im Vorfeld von Tierversuchen vorhersagen kann.

Vergleichsexperimente wurden mit Monokultur-Sphäroiden (nur EFCCs) und Co-Culture-Sphäroiden (EFCCs+MSCs) durchgeführt, um zu untersuchen, ob MSCs eine bedeutende Rolle bei der von EFCCs vermittelten Angiogenese spielen. Die Sprossenbildung aus jedem Sphäroid wurde 24 stunden lang von einem Echtzeit-Zellrecorder überwacht, der das Fortschreiten des angiogenen Keimens aus Sphäroiden erfassen konnte. Das angiogene Potenzial wurde quantifiziert, indem die Anzahl der Sprossen gezählt und die kumulative Länge der aus ...

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Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Das dreidimensionale Co-Kultur-Sphäroid-Angiogenese-Assay-System wurde entwickelt, um die physiologische Angiogenese nachzuahmen. Co-Kultur-Sphäroide werden von zwei menschlichen Gefäßzellvorläufern, EFCCs und MSCs, gebildet und in Kollagengel eingebettet. Das neue System ist wirksam für die Bewertung angiogener Modulatoren und liefert relevantere Informationen für die in vivo-Studie.

Dreidimensionales Angiogenese-Assay-System mit Co-Culture-Spheroiden, die von endotheliaalen Koloniebildenden Zellen und mesenchymalen Stammzellen gebildet werden

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Dieses 3D-Cokultur-Sphäroidsystem wurde entwickelt, um physiologische Angiogenese nachzuahmen. Es wird wirksam sein, um potenzielle angiogene Modulatoren zu bewerten und liefert vorher im Vorfeld von In-vivo-Studien vorhersehbare Informationen. Dieses System nutzt Co-Kultur-Sphäroide, die von zwei vaskulären Vorläuferzellen gebildet werden und kann verwendet werden, um zelluläre Wechselwirkungen, Keimung und die tubuläre Reifung der physiologischen Angiogenese zu untersuchen.Wenn wir Patientenzellen verwenden können, um Co-Kultur-Sphäroide zu bilden, können wir dieses System verwenden, um personalisierte Behandlungen für abnormale Angiogenese-bedingte Krankheiten wie Krebs zu entwickeln. Dieses Assay-System kann die Empfindlichkeit und Effizienz von Studien der Angiogenese und der Arzneimittelentwicklung erhöhen. Beginnen Sie mit 05%trypsin-EDTA, um EFCCs und MSCs für drei bzw. fünf Minuten in einem Zellkultur-Inkubator von 80 bis 90 % konfluenten Zellkulturen zu trennen.Inaktivieren Sie Trypsin mit frischem kompletten DMEM-Medium, und pipette die Zellen ein paar Mal, um eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, gefolgt von zwei Washes mit serumfreiem Medium. Nach der zweiten Wäsche die EFCKw auf dreimal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter mittlerer Konzentration und die MSCs auf zwei mal 10 bis sechs Zellen pro Millimeter mittlerer Konzentration in einzelnen Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren verdünnen.Pellet die Zellen durch Zentrifugation, und sorgfältig aspirieren alle bis auf die letzten 15 bis 25 Mikroliter Überstand aus jeder Zellprobe. Als nächstes setzen Sie jedes Pellet in 250 Mikroliter Verdünnungsmittel C aus einem fluoreszierenden Farbstoff-Kit wieder auf und pipettedien die Zellsuspensionen sanft, um eine vollständige Dispersion zu gewährleisten. 250 Mikroliter frisch zubereitetes 20-Mikromolar PKH67 in die Röhre von EFCCs geben.Fügen Sie 250 Mikroliter 12-Mikromolar PKH26 in das Rohr von MSCs. Mischen Sie sofort beide Zellsuspensionen. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur mit Schütteln, vor Licht geschützt, stoppen Sie den Färbevorgang mit einer einminütigen Inkubation in 0,5 Milliliter FBS pro Tube.Am Ende der Inkubation, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, und sorgfältig entfernen Sie den Überstand, gefolgt von zwei Wäschen in zwei Milliliter frisches komplettes Medium pro Wäsche. Dann hängen die Zellen in dem jeweiligen Medium in 15-Milliliter-Röhren. Zur Sphäroiderzeugung, nach der zweiten Wäsche, zuerst verdünnen Sie die Zellsuspensionen in der entsprechenden Konzentration des Endothelialezellwachstumsmediums MV2, ergänzt mit 20%Methylcelluloselösung und 5%fetaler Rinderserumkonzentration.Als nächstes fügen Sie jede Zellsuspension in ein sterilisiertes rechteckiges Polystyrol-Reservoir. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um etwa 125-Mikroliter-Zelltröpfchen auf die Abdeckung einer 150-Millimeter-Kulturplatte zu geben. Wenn alle Zellen hinzugefügt wurden, invertieren Sie die Abdeckung über dem Boden einer Schale, die 15 Milliliter PBS enthält, und legen Sie die Platten 24 Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator.Am nächsten Tag spülen Sie die Tellerabdeckungen mit fünf Milliliterpbs in eine 50-Milliliter-Röhre pro Schale. Spülen Sie die Abdeckungen mit weiteren fünf MilliliterPBS, um alle verbleibenden Sphäroide zu sammeln, und pellet die Sphäroide durch Zentrifugation. Alle bis auf die letzten 100 bis 200 Mikroliter Überstand vorsichtig entsorgen und vorsichtig auf die Rohrwand tippen, so dass die Sphäroide im restlichen Überstand frei aufgehängt werden.Fügen Sie das entsprechende Volumen des Endothelialezellwachstumsmediums MV2 hinzu, das mit 5% fetalem Rinderserum und 40% Methylcelluloselösung zu jeder Röhre ergänzt wird, um die Sphäroide bei 100 Sphäroiden pro Milliliter mittlerer Konzentration wieder auszusetzen. Verwenden Sie eine ein Milliliter Pipette Spitze geschnitten auf einen Durchmesser von drei bis fünf Millimetern, um die Sphäroid-Aufhängungen sanft zu mischen. Verwenden Sie eine neue Breitspitzen-1-Milliliter-Pipette, um die Sphäroid-Suspensionslösung mit einem neutralisierten Kollagengel Typ I im Eins-zu-Eins-Verhältnis auf Eis zu mischen.Fügen Sie 900 Mikroliter jeder sphäroid-suspendierenden Kollagengellösung in die Brunnen einer vorgewärmten 24-Well-Platte ein. Lassen Sie die Suspensionen 30 Minuten im Zellkultur-Inkubator polymerisieren, bevor Sie die Sphäroide mit 100 Mikrolitern Endothelzellwachstumsmedium MV2 abdecken, ergänzt mit 2,5%FBS und 50 Nanogramm pro Milliliter VEGF zu den ECFC-only Sphäroiden und Medium, das nur zu den MSC- und ECFC-plus-MSC-Sphäroidkulturen ergänzt wird. Legen Sie dann jede Platte in einen Echtzeit-Zellrecorder, der in einem Zellkultur-Inkubator installiert ist, und konzentrieren Sie sich nach dem Zufallsprinzip auf fünf bis zehn Sphäroide bei einer 10-fachen Vergrößerung, um die keimende Bildung jedes fluoreszenzbeschriftten Sphäroids stündlich für 24 Stunden zu überwachen.Um das Sphäroid-Sprossen zu quantifizieren, importieren Sie die Bilddateien in ImageJ, und messen Sie die Anzahl und Länge der Sprossen, die das entsprechende Fluoreszenzsignal von fünf zufällig ausgewählten Sphäroiden pro experimenteller Gruppe ausdrücken. Bei ECFC-plus-MSC-Sphäroiden sind die Anzahl der Sprossen und die kumulative Sprossenlänge im Vergleich zu den ECFC-nur-Sphäroiden zu allen Zeitpunkten deutlich höher. Nur MSCs-Sphäroide bilden keine Sprossen, sondern zeigen eine individuelle Migration des MSC außerhalb von Sphäroiden.Die Kennzeichnung von ECFC mit grünfluoreszierendem Farbstoff und MSC mit Rotfluoreszenzfarbstoff vor der Kombination zur Erzeugung von ECFC-plus-MSC-Sphäroiden zeigt, dass ECFC-vermittelte Sprossenstrukturen mit MSCs abgedeckt sind, was darauf hindeutet, dass kombinierte MSCs während der Sprossenbildung als perivaskuläre Zellen fungieren, was die Stabilität und Haltbarkeit des Sprosens durch die enge Verbindung zwischen zwei Gefäßzellen verbessert. ECFC-plus-MSC-Sphäroide, die mit einem Angiogenese-Inhibitor vorbehandelt wurden, weisen eine verringerte Sprossenzahl und eine kumulative Sprossenlänge in dosisabhängiger Weise auf, verglichen mit der Kontrolle von ECFC-plus-MSC-Sphäroiden. In parallelen Experimenten zeigen ECFC-only Spheroide, die mit dem Inhibitor vorbehandelt werden, gefolgt von stimulation mit VEGF, ebenfalls eine verringerte Wachstumsfaktor-induzierte Sprossenzahl und kumulative Sprossenlänge auf dosisabhängige Weise.Bemerkenswert ist, dass eine höhere Konzentration von Angiogenese-Hemmern erforderlich ist, um ECFC-plus-MSC-Sphäroide im Vergleich zu NUR ECFC-Sphäroiden zu hemmen. Das Tumorwachstum wird bei hochdosierten Angiogenese-Hemmer-behandelten Tieren im Vergleich zu kontrollbehandelten Tieren und niedrig dosierten Angiogenese-Hemmer-behandelten Tieren in einem menschlichen Xenograft-Tumor-Mausmodell signifikant gehemmt. Die Plasmakonzentration von Bevacizumab bei hochdosierten Mäusen betrug 568 plus oder minus 40,62 Mikrogramm pro Milliliter, was näher am IC50-Wert von Bevacizumab lag, um die kumulative Sprossenlänge in ECFC-plus-MSC-Sphäroiden anstelle von ECFC-nur Sphäroiden zu hemmen.Dies deutet darauf hin, dass das CO-Kultur-Sphäroidsystem ECFC-plus-MSC für die Vorhersage effektiver Plasmakonzentrationen im Vorfeld einer Tierstudie geeignet ist. Die Verwendung einer breit-spitzen, ein-ml Pipetten, um die Sphäroide sanft zu mischen, während sie in Kollagengel auf Eis sind, ist wichtig für den Schutz der Integrität der Sphäroide. Wir können dieses System ändern, um andere Zelltypen wie Immunzellen und andere extrazelluläre Matrizen einzuführen, um Zellmatrix-Crosstalk während der Angiogenese zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Übertragung der Mamma-Drüsen-bildenden Fähigkeit zwischen Mamma-Basal-Epithelzellen und Mamma-Luminalzellen über extrazelluläre Vesikel / Exosomen

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Die Aorta Ring Kokultur Assay: Ein komfortables Werkzeug, um angiogenen Potenzial des mesenchymaler Stromazellen Zellen In Vitro zu bewerten

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Kennung des skelettartigen Muskels Satellitenzellen durch Immunfluoreszenz mit Pax7 und Laminin-Antikörper

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Ableitung und Differenzierung von Eckzahn Eierstock mesenchymalen Stammzellen

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...