Name: three-dimensional angiogenesis assay system using co-culture spheroids formed by endothelial colony forming cells and mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-09-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענק (17172mfds215) מהמשרד של מזון ובטיחות סמים, הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF) גרנט ממומן על ידי ממשלת קוריאה (msip) (2017r1a2b4005463), ואת תוכנית המחקר הבסיסי המדע באמצעות ה הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF) במימון משרד החינוך (2016R1A6A1A03007648).

האדם האנושי היה מבודד מדם היקפי אנושי כפי שמתואר בדו ח הקודם27. בקצרה, שכבת התאים המונחדנה הופרזה מדם כולו באמצעות הפידול-פנק פלוס, ומתורבתים במדיום הנכון עד להופעת המושבות האנדותל. המושבות נאספו ו-ECFCs היו מבודדים באמצעות חרוזים מגנטיים CD31 מצופים. MSCs היו מבודדים תא מונמונומנט ב...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents.">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).</li><li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays.">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li><li>Fina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+CD34+gene+in+vascular+endothelial+cells.">Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells.</a> Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).</li><li>Delia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+expression+is+regulated+reciprocally+with+adhesion+molecules+in+vascular+endothelial+cells+in+vitro.">CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro.</a> Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).</li><li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+forces+in+fibrillar+extracellular+matrices+control+directional+capillary+sprouting.">Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting.</a> Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).</li><li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+endothelial+cells+in+multicellular+spheroids+prevents+apoptosis+and+induces+differentiation.">Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation.</a> The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).</li><li>Gaengel, K., Genov&#233;, G., Armulik, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial-mural+cell+signaling+in+vascular+development+and+angiogenesis.">Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).</li><li>Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+offer+cancer+research+the+third+dimension.">Biomaterials offer cancer research the third dimension.</a> Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).</li><li>Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessel+maturation+in+a+3-dimensional+spheroidal+coculture+model:+direct+contact+with+smooth+muscle+cells+regulates+endothelial+cell+quiescence+and+abrogates+VEGF+responsiveness.">Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness.</a> FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).</li><li>Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+mouse+vascular+endothelium.+In+vitro+studies+of+lymphatic,+large+blood+vessel+and+microvascular+endothelial+cells.">Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).</li><li>Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-786C+polymorphism+of+the+NOS-3+gene+and+the+endothelial+cell+response+to+fluid+shear+stress-a+proteome+analysis.">T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis.</a> Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).</li><li>Melero-Martin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells.">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).</li><li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood.">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).</li><li>Murasawa, S., Asahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+progenitor+cells+for+vasculogenesis.">Endothelial progenitor cells for vasculogenesis.</a> Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).</li><li>Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+and+haematopoietic+stem+cells:+novel+targets+for+anti-angiogenesis+therapy.">Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy.</a> Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).</li><li>Shi, S., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+niche+of+postnatal+mesenchymal+stem+cells+in+human+bone+marrow+and+dental+pulp.">Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li><li>Lee, H., Kang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+tube+formation+assay+using+human+endothelial+colony+forming+cells+for+in+vitro+evaluation+of+angiogenesis.">Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis.</a> Korean Journal of Physiology &amp; Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).</li><li>Melero-Martin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells.">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).</li><li>Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+vascular+networks+transplanted+into+secondary+mice+reconnect+with+the+host+vasculature+and+re-establish+perfusion.">Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion.</a> Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).</li><li>Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vasculogenic+cells+form+functional+blood+vessels+and+mitigate+adverse+remodeling+after+ischemia+reperfusion+injury+in+rats.">Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats.</a> Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).</li><li>Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+colony+forming+cells+and+mesenchymal+progenitor+cells+form+blood+vessels+and+increase+blood+flow+in+ischemic+muscle.">Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle.</a> Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).</li><li>Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+in+post-natal+tissue+remodeling:+lymphatic+endothelial+cell+connection+with+its+environment.">Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment.</a> Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).</li><li>Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix:+a+dynamic+niche+in+cancer+progression.">The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression.</a> Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).</li><li>Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13.+An+in+vivo+experimental+model+for+postnatal+vasculogenesis.">Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis.</a> Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).</li><li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo.">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li><li>Leuning, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytokine+secretion+profile+of+mesenchymal+stromal+cells+is+determined+by+surface+structure+of+the+microenvironment.">The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).</li><li>Shah, S., Kang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Cell+Spheroid+Angiogenesis+Assay+System+Using+Both+Endothelial+Colony+Forming+Cells+and+Mesenchymal+Stem+Cells.">Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).</li></ol>

המחקר הנוכחי מציג שיפור מערכת האנגיוגנזה מחוץ למערכת שיטה ניצול שיתוף התרבות הנוצרת על ידי שני ושלתי cell האדם תא כלי דם, ECFCs ו MSCs. Co-תרבות ספרואיד מערכת יכול לחקות vivo כלי הדם נבט היווצרות, אשר הוא שבוצעה באמצעות אינטראקציה והתאגדות בין תאי האנדותל וכלי קרום הלב. לעומת אחרים באנגיוגנזה מתורבת...

כ 500,000,000 אנשים ברחבי העולם צפויים להפיק תועלת של אנגיוגנזה-מודלטינג טיפול עבור מחלות כלי דם משויכים כגון דלקת מפרקים שגרונית, מחלות לב וכלי דם, גרורות גידול1. לפיכך, התפתחות התרופות השולטות באנגיוגנזה הפכה לאזור מחקר חשוב בתעשיית הפרמצבטיקה. במהלך התפתחות התרופה, בחקר החיות הvivo יש צורך לבחון את ההשפעות של מועמדים לסמים בפונקציות פיזיולוגיות ואינטראקציות מערכתיות בין איברים. עם זאת, בעיות אתיות ועלויות הגדילו את החששות לגבי ניסויים בבעלי חיים2. לכן, יש צורך לשפר את מערכות המערכת החוץ-גופית כדי לקבל מידע מדויק וצפוי יותר שיוביל לקבלת החלטות טובה יותר לפני ניסויים בבעלי חיים. הזרם הנוכחי באנגיוגנזה, בדרך כלל למדוד התפשטות, פלישה, הגירה, או היווצרות המבנה הצינורי של תאי האנדותל (ECs) הנזרע דו מימדי (2D) לוחות התרבות3. האנגיוגנזה הדו מספר אלה הם מהירים, פשוטים, כמותיים וחסכוניים, ותרמו באופן משמעותי לגילוי הסמים המואפטים באנגיוגנזה. עם זאת, נותרו מספר נושאים שופרו.
2D כגון מערכות שיטת החוץ הגופית לא יכול לשקף אירועים מורכבים בשלב רב של אנגיוגנזה המתרחשת ב vivo התנאים הפיזיולוגיים, המוביל תוצאות לא מדויקות הגורמות לסתירות בין נתוני שיטת חוץ גופית ותוצאות ניסוי קליני4. התנאים תרבות 2D גם לגרום לשינוי של פנוטיפים סלולריים. לדוגמה, לאחר התפשטות בלוחות התרבות דו-ממדית, ecs יש פנוטיפ הסלולר חלש המתבטא על ידי ביטוי מופחת של CD34 ומספר אותות השולטים התגובות הסלולר5,6. כדי להתגבר על מגבלות מערכות שיטות האנגיוגנזה המבוססות על תרבות דו-ממדית, פותחו מערכות שיטת אנגיוגנזה תלת-ממדית (3D). לבלוב ואחריו היווצרות מבנה צינורי מתוך spheroids שנוצר על ידי ecs משקפים vivo ניאו-ואסיקולריזציה תהליכים7,8. לפיכך, שיטת האנגיוגנזה התלת-ממדית נחשבה למערכת שיטה יעילה לסינון תרופות פרו-אנאנציקליות פוטנציאליות.
רוב 3d האנגיוגנזה ספרואיד בחני לנצל רק ecs, בעיקר האדם וריד הטבור בתאי הטבורי (huvecs) או האדם מיקרוכלי הגוף האנושי מיקרו-סקולרית (hdmecs) כדי להתמקד בתגובה התאית של ecs במהלך האנגיוגנזה. עם זאת, נימים בדם מורכבים משני סוגי תאים: ECs ו כריתת קרום הלב. פירוט האינטראקציה הדו-כיוונית בין ECs לקרום הלב היא קריטית לשלמות כלי הדם הנכונים ולתפקוד. מספר מחלות, כגון שבץ תורשתי, רטינופתיה סוכרתית, ומומים ורידים, משויכים לצפיפות שונה בקרום הלב או לירידה המצורף לקרום הלב לאנדותל9. כלציטים מוכרות גם כמרכיב מרכזי בתהליך האנגיוגנטי. לייצב את מבני הספינה. שנוצרו מחדש ע י ECs בהקשר זה, שיטת האנגיוגנזה של מונו-תרבות, אינה משלבת כבלי קרום הלב7,10. לכן, הספרואידים של התרבות שנוצר על ידי ECs ו קרום הלב עשוי לספק גישה רבת ערך לחיקוי הדוק יותר של אירועים האנטי-אנגיוגנטיים הפיזיולוגיים.
המחקר הנוכחי שמטרתו לפתח שיתוף תרבות תלת-ממד בשילוב האנאיד אנגיוגנזה עם שילוב של מושבת האדם האנושי היוצרים תאים (ECFCs) ותאי גזע mesenchymal (MSCs) כדי לשקף יותר מקרוב vivo אנגיוגנזה. מערכת שיתוף תרבות ספרואיד כהרכבה בייצוג בלתי מתורבת של כלי דם רגיל הוקמה לראשונה על ידי Korff et al. ב 200111. הם שילבו HUVECs ואת עורק הטבור האנושי תאים השריר חלקה (HUSMCs), והפגינו כי שיתוף התרבות של שני תאים בוגרים כלי דם ירדו את הפוטנציאל לבלוב. Ecs בוגרת (huvecs) ידועים בהדרגה לאבד את יכולתם להתרבות ולהבדיל, אשר משפיע לרעה על תגובות האנגיוגנזה שלהם12,13. תאים בוגרים בעלי כלי דם (HUSMCs) יכולים לגרום להפעלת תא אנדותל באמצעות הארכה של מקדם הגידול של כלי הדם (באמצעות התגובה המתכלה)11. ההבדל העיקרי בין Korff לבין מערכת שיתוף התרבות שלנו ספרואיד הוא סוגי התא המשמשים. החלתי שני סמנים מוקדמים של כלי הדם, ECFCs ו MSCs, כדי ליצור מערכת שיטת אנגיוגנזה מתאימה למסך ולחקירת סוכנים פרו-או-אנטי-אנגיוגנטיים. ECFCs הם הקודמן של ECs. ל-ECFCs יש קיבולת הפצה איתנה לעומת ECs בוגרת14, המאפשרת להתגבר על המגבלה של ecs. Ecfcs תורמים להיווצרות כלי חדש בתנאים רביםשלאחר לידהלאחר לידה15,16,17. MSCs הם תאי גזע בעלי עוצמה גבוהה, שיש להם את היכולת להבדיל לתוך קרום הלב, ובכך לתרום לאנגיוגנזה18,19.
בדוחות הקודמים, ecfcs ו MSCs הראו השפעות סינגיסטיים על היווצרות צינור מבחנה20, ב vivo ניאו-vascularization21,22, ו reperfusion משופר של רקמות האיסכמי23,24. במחקר הנוכחי, ECFCs ו MSCs שימשו ליצירת spheroids שיתוף תרבות ומוטבע סוג אני קולגן ג'ל כדי לשקף בסביבה vivo 3D. קולגן נחשב מרכיבים עיקריים של מטריצה החילוץ (ECM) סביב Ecm25. ה-ECM ממלאת תפקיד קריטי בוויסות התנהגות התא26. פרוטוקול השימוש המוצע כאן יכול להתבצע בקלות ובמהירות בתוך יומיים באמצעות טכניקות מעבדה נפוצות. עבור מעקב תאים אפקטיבי במהלך לבלוב התהליך, כל סוג תא יכול להיות מתויג באופן מפוקח ומנוטרים באמצעות מקליט תא בזמן אמת. המערכת החדשה הוקמה 3D שיתוף התרבות מערכת שיטת אנגיוגנזה מיועדת להגביר את הרגישות להערכת מודולטורים פוטנציאליים מודולים ולספק מידע צפוי מראש במחקר vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:709px;" width="708">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.05 % Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25300-054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Bevacizumab</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:161px;">NA</td>
			<td>Commercial name: Avastin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dulbecco Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">11885-084</td>
			<td>DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">21600-010</td>
			<td>PBS (10X)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered saline (1X)</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">21-031-CVR</td>
			<td>PBS (1X)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Endothelial cell Growth medium MV2 kit</td>
			<td style="width:123px;">Promocell</td>
			<td style="width:161px;">C-22121</td>
			<td>ECGM-MV2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:123px;">Atlas</td>
			<td style="width:161px;">FP-0500A</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Gelatin</td>
			<td style="width:123px;">BD Sciences</td>
			<td style="width:161px;">214340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutamine&#8211;Penicillin&#8211;Streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10378-016</td>
			<td>GPS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Mesenchymal stem cell growth medium-2</td>
			<td style="width:123px;">Promocell</td>
			<td style="width:161px;">C-28009</td>
			<td>MSCGM-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">MINI26</td>
			<td>PKH26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">MINI67</td>
			<td>PKH67</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Type I collagen gel</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Vascular endothelial growth factor A</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:161px;">293-VE-010</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional angiogenesis assay system using co-culture spheroids formed by endothelial colony forming cells and mesenchymal stem cells

מחקרים בתחום האנגיוגנזה גדלו באגרסיביות בעשורים האחרונים עם ההכרה שאנגיוגנזה הוא סימן ההיכר של יותר מ-50 מצבים פתולוגיים שונים, כגון דלקת מפרקים שגרונית, מחלות לב וכלי דם. , גרורות גידול. במהלך פיתוח התרופה לאנגיוגנזה, חיוני להשתמש במערכות של שיטות חוץ-גופית עם סוגי תאים מתאימים ותנאים נאותים כדי לשקף את תהליך האנגיוגנזה הפיזיולוגי. כדי להתגבר על המגבלות הנוכחיות של המערכות הקיימות במערכת השימוש בתאי האנגיוגנזה בעיקר, פיתחנו תלת מימדי (3D) שיתוף תרבות מערכת שיטת העיבוד. שיתוף תרבות הספרואידים הופקו על ידי שני תאים אנושיים בתאי כלי דם, המושבה אנדותל היוצרים תאים (ECFCs) ו-mesenchymal תאים גזע (MSCs) עם יחס של 5 אל 1. ECFCs + MSCs spheroids הוטבעו לסוג אני קולגן מטריצה כדי לחקות את הסביבה vivo מסחטות. מקליט תאים בזמן אמת היה מנוצל ברציפות להתבונן התקדמות של לבלוב אנגיוגנטית מן spheroids עבור 24 h. שיטת התיוג הפלואורסצנטי של תא חי החלה גם על בדרכי ההתאמה של כל סוג תא במהלך היווצרות נבט. פוטנציאל אנגיוגנטי היה כולל על ידי ספירת מספר נבטים ומדידת האורך המצטבר של נבטים שנוצרו מההרואידים הבודדים. חמש השפעות אקראיות שנבחרו. נותחו לכל קבוצה ניסיונית ניסויי השוואה הראו כי ECFCs + MSCs spheroids הראו מספר נבט גדול יותר ואורך נבט מצטבר בהשוואה ל ECFCs בלבד spheroids. Bevacizumab, שאושרו על-ידי ה-FDA מעכב אנגיוגנזה, נבדק עם מערכת החדשה שפותחה שיתוף תרבות ספרואיד במערכת כדי לאמת את הפוטנציאל שלה למסך תרופות אנטי-אנגיוגנטית. ערך IC50 עבור ecfcs + MSCs spheroids לעומת ecfcs בלבד הספרואידים היה קרוב יותר לריכוז פלזמה יעיל של אווסטין המתקבל ממודל העכבר הגידול של מבע. המחקר הנוכחי מצביע על כך 3D ECFCs + MSCs ספרואיד מערכת שיטת אנגיוגנזה רלוונטית לאנגיוגנזה פיזיולוגי, והוא יכול לחזות ריכוז פלזמה יעיל מראש של ניסויים בבעלי חיים.

ניסויי השוואה בוצעו באמצעות spheroids מונו תרבות (ECFCs בלבד) ושיתוף תרבות משותף (ECFCs + MSCs) כדי לבדוק אם MSCs לשחק תפקיד ניכר ב-ECFCs-תיווך באנגיוגנזה. לבלוב היווצרות של כל ספרואיד היה מפוקח 24 שעות על ידי מקליט תא בזמן אמת שיכול ללכוד את ההתקדמות של לבלוב אנגיוגנטי מתוך הספרואידים. פוטנציאל אנגיוגנטי הי?...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

מערכת שיתוף התרבות התלת-ממדית של החברה מיועדת לחקות את האנגיוגנזה הפיזיולוגי. שיתוף תרבות הספרואידים נוצרות על ידי שני מקדים האדם תא כלי דם, ECFCs ו MSCs, ו מוטבע ג'ל קולגן. המערכת החדשה יעילה להערכת מאפטורים מאופגנטיים, ומספקת מידע רלבנטי יותר למחקר בvivo.

3-מימדי אנגיוגנזה שיטת מערכת באמצעות Spheroids שיתוף תרבות נוצר על ידי ויוצרים מושבת המושבה תאים ותאי גזע Mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

מערכת ספרואידית תלת מימדית זו נועדה לחקות אנגיוגנזה פיזיולוגית. זה יהיה יעיל להערכת אפנן אנגיוגני פוטנציאלי ומספק מידע צפוי מראש של מחקרי vivo. מערכת זו משתמשת בספירואידים של תרבות-חיים שנוצרו על-ידי שני תאי גוף וסקולריים ובאפשרותך להשתמש בהם כדי לחקור אינטראקציות תאיות, נבטים והתבגרות צינורית של אנגיוגנזה פיזיולוגית.אם אנחנו יכולים להשתמש בתאי המטופל כדי ליצור כדוריות שיתוף תרבות, אנחנו יכולים להשתמש במערכת זו כדי לפתח טיפולים מותאמים אישית עבור מחלות הקשורות אנגיוגנזה חריגה, כגון סרטן. מערכת זו assay יכול להגביר את הרגישות והיעילות של מחקרים של אנגיוגנזה ופיתוח תרופות. התחל בשימוש ב- 05%trypsin-EDTA כדי לנתק ECFCs ו- MSCs מ- 80% עד 90% תרבויות תאים קונפלנטיות למשך שלוש או חמש דקות ב חממה לתרבות תאים, בהתאמה.השבת טריפסין עם מדיום DMEM שלם טרי, ו pipette התאים כמה פעמים כדי ליצור השעיה תא יחיד. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, ואחריו שתי שטיפות עם מדיום ללא סרום. לאחר הכביסה השנייה, לדלל את ECFCs לשלוש פעמים 10 לשישה תאים למיליליטר של ריכוז בינוני MSCs ל 2 פעמים 10 לשישה תאים למילימטר של ריכוז בינוני בצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים שני מיליליטר.גלולה התאים על ידי צנטריפוגה, בזהירות לשאוף את כל אבל האחרון 15 כדי 25 microliters של supernatant מכל דגימת תא. לאחר מכן, יש לעכל כל גלולה ב-250 מיקרוליטרים של DILUENT C מערכת צבע פלואורסצנטי, ולפעום בעדינות את מתלי התא כדי להבטיח פיזור מלא. הוסיפו 250 מיקרוליטרים של PKH67 20 מיקרומולרים טריים לצינור של ECFCs.הוסף 250 microliters של PKH26 12 מיקרומולרי לצינור של MSCs. מיד לערבב את שני מתלי התא. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר עם רעידות, מוגן מפני אור, לעצור את תהליך הכתם עם דגירה של דקה אחת ב 0.5 מיליליטר של FBS לצינור.בסוף הדגירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant, ואחריו שתי שטיפות בשני מיליליטר של מדיום שלם טרי לכל לשטוף. ואז להשעות את התאים במדיום בהתאמה בצינורות 15 מיליליטר. עבור דור כדורית, לאחר הכביסה השנייה, תחילה לדלל את מתלי התא בריכוז המתאים של צמיחת תא אנדותל בינוני MV2 בתוספת 20% פתרון תאית מתיל ו 5% ריכוז סרום חזיר עוברי.לאחר מכן, הוסף כל מתלה תא לתוך מאגר מלבני פוליסטירן מעוקר. השתמש פיפטה רב ערוצית להוסיף כ 125-microliter טיפות של תאים על המכסה של צלחת תרבות 150 מילימטר. כאשר כל התאים נוספו, להפוך את הכיסוי על החלק התחתון של צלחת המכילה 15 מיליליטר של PBS, ולמקום את הצלחות באינקובטור תרבות התא במשך 24 שעות.למחרת, לשטוף את המנה מכסה עם חמישה מיליליטר של PBS לתוך צינור אחד 50 מיליליטר לכל מנה. לשטוף את הכיסויים עם חמישה מיליליטר נוספים של PBS כדי לאסוף את כל כדוריות שנותרו, ו גלולה את הכדורים על ידי צנטריפוגה. השלך בזהירות את כל 100 עד 200 המיקרוליטרים האחרונים של על-טבעי, והקש בעדינות על קיר הצינור כך שהספרואידים יושעו בחופשיות בשארית העל-טבעית.הוסף את הנפח המתאים של צמיחת תא אנדותל בינוני MV2 בתוספת 5% סרום חזיר עוברי ו 40% מתיל תאית פתרון לכל צינור כדי resuspend את הספרואידים ב 100 כדוריות למיליליטר של ריכוז בינוני. השתמשו בקצה פיפיטר של מיליליטר אחד שנחתך לקוטר של שלושה עד חמישה מילימטרים כדי לערבב בעדינות את המתלים הספרואידיים. השתמשו בפיפיטה רחבה ומיליליטר חדשה כדי לערבב את תטגם המתלים של הכדוריד עם ג'ל קולגן מסוג מנוטרל ביחס של אחד לאחד על קרח.הוסיפו 900 מיקרוליטרים של כל תוסף ג'ל קולגן תלוי ספרואיד לתוך בארות של צלחת 24 בארות מחוממת מראש. אפשר להשעיות לעשות פולימריזציה במשך 30 דקות בהטמית תרבות התאים, לפני כיסוי הספרואידים עם 100 microliters של צמיחת תא אנדותל בינוני MV2 בתוספת 2.5%FBS ו 50 ננוגרם למיליליטר של VEGF כדי כדוריות ECFC בלבד ובינוני בתוספת FBS רק לתרבויות כדורי MSC ו ECFC פלוס MSC. לאחר מכן מניחים כל צלחת במקליט תאים בזמן אמת המותקן באינקובטור של תרבות התאים, ומתמקדים באופן אקראי בחמישה עד עשרה כדורי עופרואידים בהגדלה של פי 10 כדי לפקח על היווצרות הנבטים של כל ספרואיד עם תווית פלואורסצנטיות כל שעה במשך 24 שעות.כדי לכמת את הנבטים הכדוריים, יבא את קובצי התמונה ל- ImageJ, ולמדוד את מספר ואורך הנבטים המבטאות את אות הפלואורסצנט המתאים מחמישה כדורי ספורואידים שנבחרו באקראי לכל קבוצת ניסוי. עבור כדוריות ECFC פלוס-MSC, מספר הנבטים ואורך הנבט המצטבר גבוהים משמעותית בהשוואה לאלה של כדוריות ECFC בלבד בכל נקודות הזמן. MSCs בלבד כדוריות אינן יוצרות נבטים אלא מדגימות הגירה אינדיבידואלית של MSC מחוץ לספרואידים.התיוג של ECFC עם צבע ירוק-פלואורסצנטי ו- MSC עם צבע פלואורסצנטי אדום לפני השילוב כדי ליצור כדוריות ECFC פלוס MSC מדגים כי מבני נבטים מתווכים ECFC מכוסים MSCs, מה שמרמז כי MSCs משולב לתפקד כתאים perivascular במהלך היווצרות נבטים, שיפור יציבות נבט ועמידות על ידי הקשר ההדוק בין שני תאים כלי דם. כדוריות ECFC פלוס-MSC מטופלים מראש עם מעכב אנגיוגנזה להראות מספר נבט ירד ואורך נבט מצטבר באופן תלוי מינון בהשוואה לשליטה ECFC פלוס MSC כדוריות. בניסויים מקבילים, כדוריות ECFC בלבד מטופלים מראש עם המעכב ואחריו גירוי עם VEGF גם להדגים מספר נבט גורם גדילה ירידה ואורך נבט מצטבר באופן תלוי מינון.שימו לב, יש צורך בריכוז גבוה יותר של מעכב אנגיוגנזה כדי לעכב כדורי עופרואידים ECFC פלוס-MSC בהשוואה לספרואידים ECFC בלבד. גידול הגידול מעוכב באופן משמעותי בבעלי חיים שטופלו במעכבי אנגיוגנזה במינון גבוה בהשוואה לבעלי חיים שטופלו בשליטה ובעלי חיים שטופלו במעכבי אנגיוגנזה במינון נמוך במודל עכבר גידול קסנוגרפט אנושי. ריכוז הפלזמה של bevacizumab בעכברים במינון גבוה שטופלו היה 568 פלוס או מינוס 40.62 מיקרוגרם למיליליטר, שהיה קרוב יותר לערך IC50 של אוואצומפ לעיכוב אורך נבט מצטבר בספירואידים ECFC פלוס-MSC ולא כדוריות ECFC בלבד.הדבר מצביע על כך שמערכת הכדורידים השותף של ECFC פלוס MSC מתאימה לחיזוי ריכוזי פלזמה יעילים לקראת מחקר בבעלי חיים. שימוש פיפטה רחב קצה, אחד מ"ל לערבב בעדינות את הכדורואידים בזמן שהם בג'ל קולגן על קרח חשוב להגנה על שלמות הכדורואידים. אנחנו יכולים לשנות את המערכת הזאת כדי להציג סוגי תאים אחרים כגון תאים חיסוניים מטריצות חוץ תאיות אחרות כדי לחקור crosstalk מטריצת התא במהלך אנגיוגנזה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

העברת בלוטת החלב ביצירת יכולת בין תאי אפיתל בסל החלב תאים לומיני החלב באמצעות שלפוחיות תאיים / אקסוסומות

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

וזמינותו תרבות משותפת הטבעת אבי העורקים: כלי נוח כדי להעריך את הפוטנציאל אנגיוגנזה של תאי סטרומה Mesenchymal במבחנה

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

גזירת ובידול של הכלבים השחלות בתאי גזע Mesenchymal

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...