Name: three-dimensional angiogenesis assay system using co-culture spheroids formed by endothelial colony forming cells and mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-09-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Denna forskning stöddes av ett bidrag (17172MFDS215) från ministeriet för livsmedels-och läkemedels säkerhet, National Research Foundation of Korea (NRF) Grant finansieras av Koreas regering (MSIP) (2017R1A2B4005463), och det grundläggande forskningsprogrammet genom National Research Foundation of Korea (NRF) finansierat av undervisningsministeriet (2016R1A6A1A03007648).

Humana ECFCs isolerades från mänskligt perifert blod enligt beskrivningen i en tidigare rapport27. Kortfattat, mononukleära cell skiktet var separerad från hela blodet med hjälp av Ficoll-Paque plus, och odlade i rätt medium tills endothelial-liknande kolonier dök upp. Kolonier samlades in och ECFCs isolerades med hjälp av CD31-belagda magnetiska pärlor. MSCs isolerades från den anhängare mononukleära cellen (MNC) fraktion av Human Adult benmärg. Studieprotokollet godkändes av den in...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents.">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).</li><li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays.">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li><li>Fina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+CD34+gene+in+vascular+endothelial+cells.">Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells.</a> Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).</li><li>Delia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+expression+is+regulated+reciprocally+with+adhesion+molecules+in+vascular+endothelial+cells+in+vitro.">CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro.</a> Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).</li><li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+forces+in+fibrillar+extracellular+matrices+control+directional+capillary+sprouting.">Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting.</a> Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).</li><li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+endothelial+cells+in+multicellular+spheroids+prevents+apoptosis+and+induces+differentiation.">Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation.</a> The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).</li><li>Gaengel, K., Genov&#233;, G., Armulik, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial-mural+cell+signaling+in+vascular+development+and+angiogenesis.">Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).</li><li>Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+offer+cancer+research+the+third+dimension.">Biomaterials offer cancer research the third dimension.</a> Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).</li><li>Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessel+maturation+in+a+3-dimensional+spheroidal+coculture+model:+direct+contact+with+smooth+muscle+cells+regulates+endothelial+cell+quiescence+and+abrogates+VEGF+responsiveness.">Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness.</a> FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).</li><li>Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+mouse+vascular+endothelium.+In+vitro+studies+of+lymphatic,+large+blood+vessel+and+microvascular+endothelial+cells.">Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).</li><li>Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-786C+polymorphism+of+the+NOS-3+gene+and+the+endothelial+cell+response+to+fluid+shear+stress-a+proteome+analysis.">T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis.</a> Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).</li><li>Melero-Martin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells.">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).</li><li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood.">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).</li><li>Murasawa, S., Asahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+progenitor+cells+for+vasculogenesis.">Endothelial progenitor cells for vasculogenesis.</a> Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).</li><li>Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+and+haematopoietic+stem+cells:+novel+targets+for+anti-angiogenesis+therapy.">Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy.</a> Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).</li><li>Shi, S., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+niche+of+postnatal+mesenchymal+stem+cells+in+human+bone+marrow+and+dental+pulp.">Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li><li>Lee, H., Kang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+tube+formation+assay+using+human+endothelial+colony+forming+cells+for+in+vitro+evaluation+of+angiogenesis.">Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis.</a> Korean Journal of Physiology &amp; Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).</li><li>Melero-Martin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells.">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).</li><li>Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+vascular+networks+transplanted+into+secondary+mice+reconnect+with+the+host+vasculature+and+re-establish+perfusion.">Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion.</a> Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).</li><li>Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vasculogenic+cells+form+functional+blood+vessels+and+mitigate+adverse+remodeling+after+ischemia+reperfusion+injury+in+rats.">Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats.</a> Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).</li><li>Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+colony+forming+cells+and+mesenchymal+progenitor+cells+form+blood+vessels+and+increase+blood+flow+in+ischemic+muscle.">Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle.</a> Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).</li><li>Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+in+post-natal+tissue+remodeling:+lymphatic+endothelial+cell+connection+with+its+environment.">Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment.</a> Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).</li><li>Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix:+a+dynamic+niche+in+cancer+progression.">The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression.</a> Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).</li><li>Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13.+An+in+vivo+experimental+model+for+postnatal+vasculogenesis.">Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis.</a> Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).</li><li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo.">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li><li>Leuning, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytokine+secretion+profile+of+mesenchymal+stromal+cells+is+determined+by+surface+structure+of+the+microenvironment.">The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).</li><li>Shah, S., Kang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Cell+Spheroid+Angiogenesis+Assay+System+Using+Both+Endothelial+Colony+Forming+Cells+and+Mesenchymal+Stem+Cells.">Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).</li></ol>

Den nuvarande studien införa en förbättrad in vitro angiogenes assay system som utnyttjar Co-Culture spheroids bildas av två mänskliga vaskulär cell progenitorer, ecfcs och MSCS. co-Culture sfäroid system kan efterlikna in vivo vaskulär spira bildas, vilket är åstadkommas genom interaktion och inkorporering mellan endotelceller och pericyter. Jämfört med andra in vitro-analyser av angiogenes som endast återspeglar ECs-medierad angiogenes är detta Co-Culture-analyssystem mer representativt för i flera steg-...

Cirka 500 000 000 personer världen över förväntas dra nytta av angiogenes-modulerande terapi för vaskulär missbildning-associerade sjukdomar såsom reumatoid artrit, oculopathy, hjärt-kärlsjukdomar, och tumörmetastaser1. Således har utvecklingen av läkemedel som styr angiogenes blivit ett viktigt forskningsområde inom läkemedelsindustrin. Under läkemedelsutveckling, in vivo Djurstudier är nödvändigt att undersöka effekterna av läkemedelskandidater på fysiologiska funktioner och systemiska interaktioner mellan organ. Men etiska och kostnadsfrågor har ökat oron när det gäller djurförsök2. Därför behövs förbättrade in vitro-analyssystem för att få mer exakta och förutsägbara data som leder till bättre beslutsfattande innan djurförsök. Nuvarande in vitro angiogeneshassays mäter vanligtvis proliferation, invasion, migration, eller tubulär struktur bildning av endotelceller (ECs) seedade i tvådimensionella (2D) kultur tallrikar3. Dessa 2D angiogenes analyser är snabba, enkla, kvantitativa och kostnadseffektiva, och har avsevärt bidragit till upptäckten av angiogenes-modulerande läkemedel. Flera frågor återstår dock att förbättra.
Sådana 2D in vitro-analyssystem kan inte återspegla komplexa flerstegshändelser av angiogenes som uppträder i in vivo fysiologiska tillstånd, vilket leder till felaktiga resultat som orsakar avvikelser mellan in vitro-analysdata och resultat från kliniska prövningar4. 2D odlingsförhållanden inducerar också förändringen av cellulära fenotyper. Till exempel, efter spridning i 2D kultur plattor, ECs har en svag cellulär fenotyp som manifesteras genom minskat uttryck av CD34 och flera signaler som reglerar cellulära svar5,6. För att övervinna begränsningarna i 2D-kulturbaserade angiogeneshämmare system, har tredimensionella (3D) sfäroid angiogenes analyssystem utvecklats. Sprouting följt av tubulär struktur formation från spheroids bildas av ECs reflektera in vivo Neo-vascularization processer7,8. Sålunda, den 3D sfäroid angiogenes analysen har ansetts vara ett effektivt analyssystem för screening potentiella Pro-eller anti-angiogenes läkemedel.
De flesta 3D sfäroid angiogenes analyser utnyttjar endast ECs, främst mänskliga navel venen endotelceller (HUVECs) eller Human dermal mikrovaskulära endotelceller (HDMECs) att fokusera på cellulär respons av ECs under angiogenes. Emellertid, blod kapillärer består av två celltyper: ECs och pericyter. Att utveckla dubbelriktad interaktion mellan ECs och pericyter är avgörande för korrekt vaskulär integritet och funktion. Flera sjukdomar, såsom ärftlig stroke, diabetesretinopati, och venös missbildning, är förknippade med förändrade pericytbiologi densitet eller minskade pericytbiologi fastsättning till endotelet9. Pericyter är också känd som en viktig del av angiogena processen. Pericyter rekryteras för att stabilisera nybildade fartygs strukturer av ECs. I detta avseende, mono-kultur sfäroid angiogenes analysen inte innehåller pericyter7,10. Därför kan Co-Culture spheroids bildas av ECs och pericyter ge en värdefull metod för att närmare efterlikna fysiologiska angiogena händelser.
Den nuvarande studien syftade till att utveckla en 3D-Co-kultur sfäroid angiogenicitetsanalys med en kombination av humana endoteliala kolonibildande celler (ecfcs) och mesenkymala stamceller (MSCS) för att närmare reflektera in vivo angiogenes. Co-Culture sfäroid system som en in vitro-representation församling av ett normalt blodkärl fastställdes först av Korff et al. i 200111. De kombinerade huvecs och mänskliga navel Strängs glatta muskelceller (husmcs), och visade att samodling av två mogna vaskulära celler minskade groning potential. Mogna ECs (huvecs) är kända för att successivt förlora sin förmåga att förgöra och differentiera, vilket negativt påverkar deras angiogenes svar12,13. Mogna perivaskulära celler (husmcs) kan orsaka endotelceller cell inaktivering genom upphävande av vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) lyhördhet11. Den största skillnaden mellan korffs och vår co-Culture sfäroid system är de celltyper som används. Vi tillämpade två vaskulära prekursorer, ECFCs och MSCs, att etablera en ordentlig angiogenes assay system för att avskärma och undersöka Pro-eller-antiangiogena medel. ECFCs är föregångaren till ECs. ECFCs har robust spridnings kapacitet jämfört med mature ECs14, vilket gör det möjligt att övervinna begränsningen av ECS. Ecfcs bidrar till ny fartygs bildning i många postnatal patofysiologiska tillstånd15,16,17. MSCS är pluripotenta stamceller som har förmågan att differentiera till pericyter, vilket bidrar till angiogenes18,19.
I tidigare rapporter, ecfcs och MSCS visade synergistiska effekter på in vitro-rör bildas20, in vivo Neo-vascularization21,22, och förbättrad reperfusion av ischemiska vävnader23,24. I den nuvarande studien användes ECFCs och MSCs för att bilda samkulturspheroider och bäddas in i typ I kollagen gel för att återspegla en in vivo 3D-miljö. Kollagen betraktas som en viktig beståndsdel i den extracellulära matrisen (ECM) kring ECs25. ECM spelar en kritisk roll i regleringen av cellens beteende26. Det analysprotokoll som föreslås här kan enkelt och snabbt utföras inom två dagar med hjälp av vanliga laboratorietekniker. För effektiv cell spårning under groning-processen kan varje celltyp fluorescerande märkas och övervakas med hjälp av en realtids cells inspelare. Den nyinrättade 3D Co-Culture sfäroid angiogenes assay system är utformat för att öka känsligheten för att utvärdera potentiella angiogena modulatorer och att ge förutsägbar information i förväg i in vivo studie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:709px;" width="708">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.05 % Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25300-054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Bevacizumab</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:161px;">NA</td>
			<td>Commercial name: Avastin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dulbecco Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">11885-084</td>
			<td>DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">21600-010</td>
			<td>PBS (10X)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered saline (1X)</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">21-031-CVR</td>
			<td>PBS (1X)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Endothelial cell Growth medium MV2 kit</td>
			<td style="width:123px;">Promocell</td>
			<td style="width:161px;">C-22121</td>
			<td>ECGM-MV2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:123px;">Atlas</td>
			<td style="width:161px;">FP-0500A</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Gelatin</td>
			<td style="width:123px;">BD Sciences</td>
			<td style="width:161px;">214340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutamine&#8211;Penicillin&#8211;Streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10378-016</td>
			<td>GPS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Mesenchymal stem cell growth medium-2</td>
			<td style="width:123px;">Promocell</td>
			<td style="width:161px;">C-28009</td>
			<td>MSCGM-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">MINI26</td>
			<td>PKH26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">MINI67</td>
			<td>PKH67</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Type I collagen gel</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Vascular endothelial growth factor A</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:161px;">293-VE-010</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional angiogenesis assay system using co-culture spheroids formed by endothelial colony forming cells and mesenchymal stem cells

Studier inom angiogenes har ökat aggressivt under de senaste decennierna med erkännandet att angiogenes är ett kännetecken för mer än 50 olika sjukdomstillstånd, såsom reumatoid artrit, oculopati, hjärt-kärlsjukdomar , och tumörmetastaser. Under angiogenes läkemedelsutveckling, det är viktigt att använda in vitro-analyssystem med lämpliga celltyper och korrekta villkor för att återspegla fysiologisk angiogenes processen. För att övervinna begränsningar av nuvarande in vitro angiogenesen assay system med främst endotelceller, utvecklade vi en 3-dimensionell (3D) Co-Culture sfäroid groning assay system. Samkulturspheroids producerades av två humana vaskulära cellprekursorer, endoteliala kolonibildande celler (ECFCs) och mesenkymala stamceller (MSCs) med ett förhållande på 5 till 1. ECFCs + MSCs spheroids var inbäddade i typ I kollagen matris för att efterlikna den in vivo extracellulära miljön. En realtid cell Recorder utnyttjades för att kontinuerligt Observera utvecklingen av angiogena groning från spheroids för 24 h. levande cell fluorescerande märkning teknik tillämpades också för att tarmkanalen lokalisering av varje celltyp under spira bildas. Angiogen potential kvantifierades genom att räkna antalet groddar och mäta den kumulativa längden av groddar som genereras från de enskilda spheroids. Fem slumpmässigt utvalda spheroids analyserades per experimentell grupp. Jämförelse experiment visade att ECFCs + MSCs spheroids visade större spira och kumulativ spira längd jämfört med ECFCs-bara spheroids. Bevacizumab, en FDA-godkänd angiogeneshämmare, testades med den nyutvecklade Co-Culture sfäroid assay system för att kontrollera dess potential att avskärma antiangiogena läkemedel. IC50 värde för ecfcs + MSCS spheroids jämfört med ecfcs-bara spheroids var närmare den effektiva plasmakoncentrationen av bevacizumab erhållits från xenograft tumör musmodell. Den nuvarande studien tyder på att 3D ecfcs + MSCS sfäroid angiogenes assay system är relevant för fysiologisk angiogenes, och kan förutsäga en effektiv plasmakoncentration i förväg av djurförsök.

Jämförelse experiment utfördes med hjälp av mono-kultur spheroids (ECFCs-Only) och co-Culture spheroids (ECFCs + MSCs) att undersöka om MSCs spelar en betydande roll i ECFCs-medierad angiogenes. Groning bildas från varje sfäroid övervakades för 24 h av en realtid cell Recorder som skulle kunna fånga utvecklingen av angiogena groning från spheroids. Angiogen potential kvantifierades genom att räkna antalet groddar och mäta den kumulativa längden av groddar som genereras från enskilda spheroids. Fem slumpmä...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Tredimensionell Co-Culture sfäroid angiogenes assay system är utformat för att efterlikna fysiologisk angiogenes. Samkulturspheroids bildas av två humana vaskulära cellprekursorer, ECFCs och MSCs, och inbäddade i kollagen gel. Det nya systemet är effektivt för att utvärdera angiogena modulatorer, och ger mer relevant information till in vivo-studien.

Tredimensionellt Angiogeneshämningssystem med hjälp av Samkulturspheroider som bildas av Endotelkolonibildande celler och mesenkymala stamceller

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Denna 3D-co-kultur sfäroid system är utformat för att efterlikna physiologic angiogenes. Det kommer att vara effektivt för att utvärdera potentiella angiogenic modulatorer och ger förutsägbar information i förväg av in vivo studier. Detta system utnyttjar co-kultur sfäroider som bildas av två vaskulär progenitor celler och kan användas för att undersöka cellulära interaktioner, groning, och den tubulära mognaden av physiologic angiogenes.Om vi kan använda patientceller för att bilda samkultur sfäroider, kan vi använda detta system för att utveckla personliga behandlingar för onormala angiogenes-relaterade sjukdomar, såsom cancer. Denna analys system kan öka känsligheten och effektiviteten av studier av angiogenes och läkemedelsutveckling. Börja med att använda 05%trypsin-EDTA för att lösgöra ECFCs och MSCs från 80 till 90%konfluenta cellkulturer i tre eller fem minuter i en inkubator för cellodling, respektive.Inaktivera trypsin med färska komplett DMEM medium, och pipettera cellerna några gånger för att generera en enda cell suspension. Samla upp cellerna genom centrifugering, följt av två tvättar med serumfritt medium. Efter den andra tvätten späd ECFCs till tre gånger 10 till de sex cellerna per milliliter medelhög koncentration och MSCs till en två gånger 10 till de sex cellerna per millimeter av medelhög koncentration i enskilda två-milliliter mikrocentrifugrör.Pellet cellerna genom centrifugering, och försiktigt aspirera alla utom de sista 15 till 25 mikroliter av supernatant från varje cellprov. Därefter resuspend varje pellet i 250 mikroliter av spädningsvätska C från en fluorescerande färgämne kit, och försiktigt pipetter cellen suspensioner för att säkerställa en fullständig spridning. Tillsätt 250 mikroliter av nyberedda 20-mikromolar PKH67 till röret av ECFCs.Lägg till 250 mikroliter av 12-mikromolar PKH26 till tuben av MSCs. Blanda omedelbart båda cellupphängningar. Efter fem minuter i rumstemperatur med skakningar, skyddad från ljus, stoppa färgningsprocessen med en minuts inkubation i 0,5 milliliter FBS per rör.Vid slutet av inkubationen, samla cellerna genom centrifugering, och försiktigt ta bort supernatanten, följt av två tvättar i två milliliter färskt komplett medium per tvätt. Sedan suspendera cellerna i respektive medium i 15-milliliter rör. För sfäroidgeneration, efter den andra tvätten, späd först cellen suspensioner i lämplig koncentration av endotel celltillväxt medium MV2 kompletteras med 20%metylcellulosalösning och 5%fetala bovin serum koncentration.Därefter lägger du till varje cellupphängning i en steriliserad polystyren rektangulär reservoar. Använd en flerkanalig pipett för att lägga till cirka 125-mikroliter droppar celler på omslaget till en 150-millimeters odlingsplatta. När alla celler har tillsatts, invertera locket över botten av en maträtt som innehåller 15 milliliter PBS, och placera plattorna i cellkulturen inkubatorn i 24 timmar.Nästa dag, skölj diskomslagen med fem milliliter PBS i en 50-milliliter rör per fat. Skölj täcklocken med ytterligare fem milliliter PBS för att samla eventuella återstående sfäroider, och pelleten sfäroiderna genom centrifugeringen. Kassera noggrant alla utom de sista 100 till 200 mikroliter av supernatant, och försiktigt knacka på väggen i röret så att sfäroiderna är fritt upphängda i resterande supernatant.Tillsätt lämplig volym endothelial celltillväxt medium MV2 kompletteras med 5%fetala nötkreatur serum och 40%metylcellulosalösning till varje rör för att återanvända sfäroiderna vid en 100 sfäroider per milliliter av medelhög koncentration. Använd en en-milliliter pipett spets skuren till en tre till fem millimeter diameter för att försiktigt blanda sfäroid suspensioner. Använd en ny bredspets, en milliliterpipett för att blanda den sfäroida fjädringslösningen med en neutraliserad collagen-gel av typ I vid ett 1-till-ett-förhållande på is.Tillsätt 900 mikroliter av varje sfäroid-suspendering kollagen gel lösning i brunnarna i en förvärkad 24-brunns platta. Låt suspensionerna polymerisera i 30 minuter i inkubatorn för cellodling, innan du täcker spheroidsna med 100 mikroliters av endotelcellstillväxtmedium MV2 kompletterat med 2.5%FBS och 50 nanogram per milliliter av VEGF till de ECFC-only sfäroiderna och medel kompletterat med FBS endast till de MSC och ECFC-plus-MSC-spheroidkulturerna. Placera sedan varje platta i en realtidscellinspelare installerad i en inkubator för cellkultur, och fokusera slumpmässigt på fem till tio sfäroider vid en 10x förstoring för att övervaka groningsbildningen av varje fluorescens-märkt sfäroid varje timme i 24 timmar.För att kvantifiera sfäroidgrodden, importera bildfilerna till ImageJ, och mäta antalet groddar och som uttrycker lämplig lysrörssignal från fem slumpmässigt utvalda sfäroider per experimentgrupp. För ECFC-plus-MSC-sfäroider är antalet groddar och kumulativ groddarlängd betydligt högre jämfört med dem hos ECFC-bara sfäroider vid alla tidpunkter. MSCs-bara sfäroider bildar inte groddar men visar en individuell migration av MSC utanför sfäroider.Märkningen av ECFC med grön-fluorescerande färgämne och MSC med röd-fluorescerande färgämne innan de kombineras för att generera ECFC-plus-MSC-sfäroider visar att ECFC-medierad grodd strukturer är täckta med MSCs, vilket tyder på att kombinerade MSCs fungerar som perivaskulära celler under groddarbildning, förbättra spirande stabilitet och hållbarhet genom den snäva associationen mellan två vaskulära celler. ECFC-plus-MSC-sfäroider som behandlats med en angiogeneshämmare visar ett minskat spiratal och en kumulativ groddarlängd på ett dosberoende sätt jämfört med kontroll ECFC-plus-MSC-sfäroider. I parallella experiment, ECFC-bara sfäroider som behandlats med inhibitorn följt av stimulering med VEGF visar också en minskad tillväxtfaktor-inducerad sprout antal och kumulativa groddar längd i en dos-beroende sätt.Att notera, en högre koncentration av angiogenes hämmare behövs för att hämma ECFC-plus-MSC sfäroider jämfört med ECFC-bara sfäroider. Tumörtillväxt hämmas signifikant i hög dos angiogeneshämmare-behandlade djur jämfört med både kontrollbehandlade djur och låg dos angiogeneshämmare-behandlade djur i en human xenograft tumör mus modell. Plasmakoncentrationen av bevacizumab hos högdosbehandlade möss var 568 plus eller minus 40,62 mikrogram per milliliter, vilket var närmare IC50-värdet av bevacizumab för att hämma kumulativ groddlängd i ECFC-plus MSC-sfäroider snarare än ECFC-bara sfäroider.Detta tyder på att ECFC-plus-MSC samkultur sfäroid systemet är lämplig för att förutsäga effektiva plasmakoncentrationer före en djurstudie. Med hjälp av en bred-tip, one-mL pipetter för att försiktigt blanda sfäroider medan de är i kollagen gel på is är viktigt för att skydda integriteten hos sfäroider. Vi kan ändra detta system för att införa andra celltyper såsom immunceller och andra extracellulära matriser att undersöka cell-matrix överhörning under angiogenes.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tredimensionell Kvantifiering av Dendritutskotten från Pyramidal nervceller Härstammar från Human inducerade pluripotenta stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen av pluripotenta stamceller från mus fostervatten celler med användning av en transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolering och karakterisering av mesenkymala stromala celler från human navelsträng och Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Överföring av magsjukdomskapande förmåga mellan mammalbasala epitelceller och mamma-luminala celler via extracellulära vesiklar / exosomer

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Aorta Ring samtidig kultur analysen: Ett bekvämt verktyg för att bedöma angiogena Potential mesenkymala stromaceller In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontell helmontering: Ett nytt bearbetnings- och bildprotokoll för tjocka, tredimensionella vävnads tvärsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion i levande intakt zebrafiskar

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifiering av skelettmuskulaturen satellit celler genom immunofluorescens med Pax7 och Laminin antikroppar

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational analys av den Caenorhabditis elegans könsceller att studera fördelningen av atomkärnor, proteiner och cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Härledning och differentiering av hundarnas cystor mesenkymala stamceller

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...