Name: perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل من قبل جامعه فلوريدا المركزية بدء الأموال ومعهد القلب الوطني, الرئة, والدم من المعهد الوطني للصحة تحت جائزه K25HL132098.

1. صنع بولياكريلاميد (PA) الهلام
<ol><li>
اعداد طبق بيتري
	<ol>
<li>اعداد ربط سيلان الحل عن طريق خلط 200 mL نقاء المياه مع 80 μl حمض الخليك و 50 μl من 3-(trimethoxysilyl) بروبيل ميثاكريليت. ربط سيلان هو الحل المستخدمة لإضفاء الطابع الوظيفي علي سطح طبق بيتري الزجاج السفلي للمرفق هيدروجيل.</li>
		<li>يحرك محلول س...

<ol>
	<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Colin-York, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+(STFM).">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+stress+reconstitution+from+traction+force+data.">Intercellular stress reconstitution from traction force data.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).</li><li>Islam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Experimental+Methods+of+Cellular+Force+Sensing.">Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing.</a> Biomedical Journal of Science &amp; Technical Research. 17 (3), (2019).</li><li>Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear,+intercellular+stress,+and+endothelial+cell+alignment.">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+forces:+a+useful+parameter+in+cancer+research.">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li><li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues.">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li><li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation.">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces.">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li><li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption.">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).</li><li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function.">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li><li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions.">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li><li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family.">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li><li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall.">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li><li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+phosphorylation+in+brain,+cardiac,+endothelial+and+epithelial+tissues.">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li><li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice.">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li><li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis.">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',5'-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation.">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li><li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+cytotoxicity+of+2,5-dihydroxychalcones+and+related+compounds.">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li></ol>

مجموعتنا ، فضلا عن غيرها ، وقد تم بنجاح استخدام tfm و MSM لتحقيق تاثير تقاطعات خليه الخلية في مختلف العمليات الخلوية المرضية والفسيولوجية في المختبر7،15،18،27 . علي سبيل المثال ، Hardin وآخرون قدمت دراسة ثاقبه للغاية التي تشير إ...

ويعرف الحقل الذي يشير إلى دراسة اثار القوات البدنية والخواص الميكانيكية علي فسيولوجيا الخلايا والانسجه وعلم الامراض باسم البيولوجيا اليه1. وهناك عدد قليل من التقنيات المفيدة التي تم استخدامها في البيولوجيا الميكانيكية هي أحاديه الطبقة المجهر الإجهاد والمجهر قوه الجر. الجر قوه المجهر يسمح لحساب العمليات التي تم إنشاؤها في واجهه الخلية الركيزة ، في حين ان المجهر أحاديه الطبقة الإجهاد يسمح لحساب الضغوط بين الخلوية المتولدة بين الخلايا المجاورة داخل أحادي الطبقة2 ،3،4،5،6. وقد اقترحت النتائج التي أسفرت عنها الأساليب السابقة ان الإجهاد الميكانيكية المستمدة من الخلايا تلعب دورا حاسما في تحديد مصير مجموعه من العمليات الخلوية3,4,5. فعلي سبيل المثال ، عند التعرض لقوه ميكانيكيه خارجيه ، يمكن لمجموعه من الخلايا المهاجرة كجماعه ان تغير شكلها وتقوم باستقطاب اشكالها لمحاذاتها وترحيلها علي طول اتجاه القوه التطبيقية ، وذلك جزئيا بتوليد القصبات7، 8-الآن وتوفر عمليات التعقب مقياسا يمكن استخدامه لتقييم انقباض الخلية وتحسب باستخدام مجهر قوه الجر (TFM). يبدا المجهر قوه الجر (TFM) مع تحديد الخلايا التي يسببها تشوات الركيزة تليها حساب حقل الجر باستخدام صارمة رياضيا ، والميكانيكا المستندة إلى نهج الحسابية. منذ القدرة علي حساب التعقب وقد حول لبعض الوقت ، وقد استخدمت الباحثين TFM للكشف عن اثر القصبات لديها علي مجموعه من العمليات ، بما في ذلك السرطان9، التئام الجروح10 وتقييم القلب المهندسة الانسجه11.
يمكن تقسيم تنفيذ TFM و MSM معا إلى ثلاث خطوات أساسيه يجب تنفيذها بالترتيب التالي: أولا ، يتم تحديد التشوات هيدروجيل التي تنتجها الخلايا. الثانية ، يتم استرداد القصبات من التشوات هيدروجيل. وثالثا ، يتم استخدام نهج العنصر المحدود لحساب الإجهادات البينية العادية والقص داخل الطبقة الاحاديه بأكملها. لحساب الإزاحات هلام ، تم مقارنه الصور حبه مضان مع الخلايا مع صوره حبه المرجع (بدون خلايا) باستخدام قياس سرعه صوره الجسيمات المكتوبة حسب العرف (PIV) الروتينية. تم اختيار حجم اطار الارتباط التبادلي والتداخل لتحليل PIV ليكون 32 × 32 بكسل و 0.5 ، علي التوالي. في هذا الوقت ، تم تحويل بكسل التحولات إلى ميكرون عن طريق ضرب مع عامل تحويل بكسل إلى ميكرون (لمجهر لدينا ، وهذا عامل التحويل هو 0.65) للحصول علي النزوح في الطائرة. الأخطاء المرتبطة بتجاهل عمليات النزوح خارج الطائرة لا تذكر12,13. بعد حساب النزوح هلام ، وهناك نوعان من قياسات الجر التي يمكن استخدامها ، والانزلاقات المقيدة والمتعقبات غير مقيده8،14. توفر عمليات التعقب غير المقيدة حقل الجر لحقل العرض بأكمله (بما في ذلك المناطق التي بها خلايا وبدونها) ، بينما توفر عمليات التعقب المقيدة حقل الجر فقط للمناطق التي تتضمن الخلايا14. ثم يتم احتساب الضغوط البينية باستخدام مجهر الإجهاد أحادي الطبقة (MSM) ، وهو امتداد لمجهر قوه الجر. ويستند تنفيذ MSM قباله افتراض ان القصبات المحلية التي تمارسها أحاديه الطبقة من الخلايا في واجهه الخلية-الركيزة يجب ان تكون متوازنة من قبل القوات الميكانيكية المنقولة بين الخلايا في واجهه خليه خليه كما هو مطلوب من قبل قوانين نيوتن7 و12و13. ومن الافتراضات الرئيسية هنا ان الخلية أحاديه الطبقة يمكن ان تعامل علي انها ورقه مرنه رقيقه لان توزيع الجر في الطبقة الاحاديه معروف وان توازن القوه لا يعتمد علي خصائص المواد الخلوية. ومن الافتراضات الرئيسية الأخرى ان قوي الجر متوازنة بالضغوط المحلية البينية داخل المجال البصري للراي (داخل الطبقة الاحاديه) وان تاثير توازن القوه هذا هو الحد الأدنى في المنطقة البعيدة (خارج الطبقة الاحاديه)13. ولذلك ، فان الظروف الحدودية التي تحددها الضغوطات البينية ، أو الإزاحات ، أو الجمع بين كل من الحدود الاحاديه الطبقة ، هي شروط حاسمه لأداء MSM13. مع الأخذ بعين الاعتبار المعلومات المذكورة أعلاه ، ونحن نستخدم MSM لاجراء تحليل عنصر محدود (فيم) لاستعاده الحد الأقصى الإجهاد الرئيسي (σmax) والحد الأدنى من الإجهاد الرئيسي (σmin) عن طريق تدوير الطائرة الإجهاد في كل نقطه داخل أحادي. وتستخدم هذه الضغوط الرئيسية في وقت لاحق لحساب 2d متوسط الإجهاد البيني العادي [(σmax + σmin)/2] و 2d الحد الأقصى الإجهاد خلاياه [(σmax -σmin)/2] داخل الطبقة الاحاديه بأكملها 12,13. ويرد وصف هذا الاجراء بمزيد من التفصيل من قبل tambe وآخرون12،13
المجهر الإجهاد أحاديه الطبقة (MSM) يسمح لحساب الخلايا خليه الضغوط الخلوية المتولدة داخل أحاديه الطبقات6،7،8،12،13. وقد اقترحت هذه الضغوط البينية لتكون مهمة لنمو الانسجه وإصلاح, التئام الجروح, والسرطان الانبثاث12,15,16,17. الاضافه إلى ذلك ، اقترحت الضغوط البينية لتكون أيضا مهمة في هجره الخلايا البطانية والحاجز البطانية وظيفة17،18. في حين ان تقاطعات الخلايا الخلوية مثل التقاطعات الضيقة والتقاطعات الملتصقة قد اقترحت للعب دورا حاسما في توليد الإجهاد الغشائي المتشابك وانتقال العدوى ، فان دور تقاطعات الفجوة لا يزال بعيد المنال. تقاطعات جاب تربط الخلايا المجاورة ماديا وتوفر مسارا لتيار كهربائي وجزيئات (< 1 كده) للمرور بين الخلايا المجاورة19،20،21. علي الرغم من ان الخلايا البطانية التعبير عن Cx37, Cx40, وتقاطعات الفجوة Cx4319,22, Cx43 ويمكن القول ان الأكثر اهميه من حيث تطور المرض23. ويمكن العثور علي أدله علي اهميه Cx43's في حقيقة ان الحذف الجيني من Cx43 في الفئران يؤدي إلى انخفاض ضغط الدم24 ولها اثار ضاره علي تولد الاوعيه25. الاضافه إلى ذلك ، تم توثيق Cx43 لتكون مهمة لهجره الخلايا وانتشار وفي تطور تصلب الشرايين18،22،23،24،25 .
في هذا البروتوكول ، استخدمنا TFM و MSM للتحقيق في ما إذا كان الجر وتوليد الإجهاد بين الخلايا داخل المتموج ، سيتاثر أحادي البطانة البطانية من خلال تعطيل مفرق الفجوة البطانية Cx43. قمنا بتعطيل Cx43 مع 2 ، 5-ديهيدروكسيكلالكون (الطباشير) ، وهو جزيء موثقه لمنع Cx43 التعبير26. استعملت [شلكون] كان ان يعطل Cx43 [اينستد وف] [سرنا] بما ان [شسكون] يتلقى يكون يفاد سابقا ب [لي] [آت ال]. ان يعطل Cx43 تعبير26. الاضافه إلى ذلك ، كنا مهتمين بشكل خاص في تاثير chalcone علي بطانة كما قيل أيضا ان يكون مركب مضاد للالتهابات والصفائح الدموية التي يمكن استخدامها للوقاية والعلاج من مختلف الاوعيه الدموية الامراض26. وقد أجريت العلاجات الكلدانية بعد ساعة من بداية التجربة ، وكانت أحادي الطبقات المعالجة الكلدانية لمده ست ساعات ، وتم اجراء معالجه الصور مع رمز MATLAB مكتوبه حسب العرف لتحديد التعقب وفيما بعد البينية تؤكد. أظهرت نتائجنا انخفاضا إجماليا في عمليات التعقب والإجهادات البينية ، مما يوحي بان Cx43 يلعب دورا رئيسيا في الميكانيكا الحيوية البطانية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td>Essential to flatten polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bis-acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610143</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8242;,5&#8242;-Dihydroxychalcone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>IDF00046</td>
			<td>To disrupt Cx43 structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2530-85-0</td>
			<td>Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Essential to make bind saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog # A-11001</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610700</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>To make blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005-100ML</td>
			<td>Use as a extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td>Buffer Saline needed for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>To dissolve chalcone and make stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8812</td>
			<td>0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Essential to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LVES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1460801</td>
			<td>Essential HUEVC media 200 supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M200500</td>
			<td>Essential media for HUVEC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog #13-8300</td>
			<td>Primary antibody for Cx43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm dia)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-20-1.5H</td>
			<td>35 mm petri dish with a 20 mm center well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td>102568-43-4</td>
			<td>Essential to functionalize polyacrylamide gel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW corning</td>
			<td>2646340</td>
			<td>Silicon elastomer with curing agent to make PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610801</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>To permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Used to detach cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption

وقد أنشئت الخلايا البطانية لتوليد الضغوط بين الخلايا والقصبات ، ولكن الدور تقاطعات الفجوة تلعب في الإجهاد بين الخلايا البطانية وتوليد الجر غير معروف حاليا. ولذلك ، فاننا نقدم هنا بروتوكول الميكانيكا القائم علي التحقيق في تاثير الفجوة تقاطع بال43 (Cx43) لديه علي الميكانيكا الحيوية البطانية من خلال تعريض متموج البطانات البطانية إلى المثبط Cx43 المعروفة 2 ، 5-ديهيدروكسيتشالكون (الكلداني) و قياس تاثير هذا المثبط علي القصبات والضغوط البينية. نقدم نتائج تمثيليه ، والتي تظهر انخفاضا في كل من القصبات والإجهادات البينية تحت جرعه عاليه المخروط (2 ميكروغرام/مل) بالمقارنة مع السيطرة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول ليس فقط Cx43 ، ولكن أيضا تقاطعات الفجوة الأخرى كذلك ، علي افتراض استخدام المثبط المناسب. ونحن نعتقد ان هذا البروتوكول سيكون مفيدا في مجالات القلب والاوعيه الدموية وبحوث البيولوجيا الميكانيكية.

صور التباين المرحلة من السيطرة ، 0.2 ميكروغرام/مل ، و 2 ميكروغرام/مل وقد اتخذت أحادي الطبقات المعالجة الكلدانية 30 دقيقه قبل العلاج الطباشير (الشكل 1ا-ج) وبعد ساعتين من المعالجة الكلدانية (الشكل 1مد-F). ولوحظ ان حالات التشرد ب?...

Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

هنا ، نقدم بروتوكولا علي أساس الميكانيكا لعرقله الفجوة تقاطع بمناسبه 43 وقياس الأثر اللاحق هذا له علي الميكانيكا الحيوية البطانية عن طريق مراقبه القصبات والإجهادات البينية.

الميكانيكا الحيوية المبطنة عن طريق الاضطرابات الهيكلية 43

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح لتوضيح الدور الذي تلعبه القوى الخلوية في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية ، مثل التئام الجروح وانبثاث السرطان ، على سبيل المثال. والميزة الرئيسية لهذه التقنية القائمة على الميكانيكا هي قدرتها على تعطيل تقاطعات الخلايا الخلوية وقياس تأثيرها على القوى الميكانيكية المولدة بالخلايا، وبشكل رئيسي الجرات والضغوطات بين الخلايا. بروتوكول لدينا ينطبق على مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية، مثل الانبثاث السرطان، ثيريوسكليروس، وارتفاع ضغط الدم، على سبيل المثال.ويمكن دمج أساليبنا لإجراء كل من التحليل الكيميائي الحيوي والميكانيكية الحيوية مع نماذج الأعضاء على رقاقة، وناميكيات الأنسجة المهندسة حيويا، في نظم تسليم المخدرات في المختبر، ونظم الأنسجة المشتركة في الثقافة. بروتوكولنا واضح إلى حد ما لأداء. ومع ذلك، فإننا ننصح أولئك الذين يقومون بهذا البروتوكول لأول مرة أن يتحلوا بالصبر وألا يتسرعوا في خطوات هذا البروتوكول.يحتوي البروتوكول على خطوات فريدة قد لا تكون واضحة للمستخدمين لأول مرة. لذلك، نشجع المستخدمين على اتباع إجراءاتنا المكتوبة خطوة بخطوة واستخدام العروض التوضيحية المرئية كتوجّهات. للبدء ، قم بإعداد محلول Blind-silane عن طريق خلط 200 ملليلتر من الماء النقي للغاية مع 80 ميكرولتر من حمض الخليك و 50 ميكرولترات من السيلان ميتهاكريلات.يُحرّك محلول Bind-silane على لوحة مُحرّكة لمدة ساعة واحدة على الأقل. علاج مركز جيدا من طبق بيتري مع حل ربط سيلاني لمدة 45 دقيقة. إزالة حل ربط سيلاني وشطف طبق بيتري مع المياه النقية جدا مرتين إلى ثلاث مرات.جفف سطح طبق بيتري واخزن في درجة حرارة الغرفة للاستخدام في المستقبل. لإعداد محلول الهيدروجيل، اخلط 12.49 ملليلتر من المياه النقية إلى 2.062 ملليلتر من 40٪ من الأكريلاميد و 375 ميكرولترات من 2٪ بياستريلاميد في أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر. إضافة 80 ميكرولترات من الخرز الفلورسنت إلى حل هيدروجيل.يهز بلطف أنبوب لخلط الخرز مع حل هلام. إبقاء الغطاء فضفاضة على أنبوب الطرد المركزي ووضعها في غرفة فراغ. إزالة الغاز حل هلام لمدة 45 دقيقة على الأقل في غرفة فراغ.لتبلمر الهيدرجيل، أولا إضافة 75 ميكرولترات من 10٪ persulphate الأمونيوم ومن ثم إضافة ثمانية ميكرولترات من TEMED إلى محلول هيدروجيل. ضع 24 ميكرولترات من محلول الهيدروجيل في وسط طبق بيتري. اضغط على الهيدرجيل مع زلة غطاء 18 ملليمتر لتسطيح الهيدروجيل وجعل ارتفاع ما يقرب من 100 ميكرومتر.انتظر على الأقل 30 إلى 40 دقيقة للبليمرة هلام. غمر الهيدروجيل البلمر في الماء النقي جدا لمنع الجفاف هلام. غطي طبق بيتري برقائق الألومنيوم لمنع الفوتبلاش من الخرز الفلورسنت وتخزينه عند أربع درجات مئوية.أولاً، اخلطي قاعدة سيليكون PDMS مع عامل معالجة السيليكون بنسبة 20 إلى واحد في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. عكس أنبوب رأسا على عقب وتهز بقوة عدة مرات لضمان خلط السليم من حل PDMS. إزالة الفقاعات في حل PDMS عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 190 مرة G.Pour 5 إلى 6 ملليلتر من حل PDMS في وسط طبق بيتري 100 ملليمتر وتهيج الطبق حتى الحل PDMS يغطي كامل سطح طبق بيتري.علاج حل PDMS بين عشية وضحاها في 50 إلى 60 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بإزالة استنسل PDMS دائري قطره 16 ملليمترًا مع فتحة ثقب. استخدام 1.25 ملليمتر قطر خزعة لكمة لخلق ثقوب صغيرة في استنسل PDMS.تعقيم الإستنسل PDMS عن طريق غمرها في 70٪ الإيثانول لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق، التعرق قبالة الإيثانول الزائد ومن ثم وضع تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق. التعرق أي فائض السائل وإزالة زلة الغطاء من الهيدروجيل. ضع استنسل PDMS على سطح الهيدروجيل واستخدم الملاقط لتطبيق ضغط خفيف على استنسل PDMS لضمان ختم محكم الماء بين استنسل PDMS وسطح الهيدروجيل.تغطية سطح الهيدرجيل مع Sulfo-SAMPA المذابة في 0.1 مولا HEPES حل العازلة بتركيز من واحد إلى 1،000 ووضع الهيدروجيل تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية مع قوة 36 واط لمدة ثماني دقائق. التعرق الزائدة Sulfo-SAMPA وHPES الحل وشطف هيدروجيل مرتين مع 0.1 0.1 الزأول HEPES تليها اثنين إضافية يشطف مع المياه النقية جدا. التعرق الزائدة المياه النقية جدا واستخدام ماصة 200 ميكرولتر لمعطف الهيدروجيل مع 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر من الكولاجين-1.تغطية الطبق لحماية الخرز الفلورسنت من photobleaching وتخزين هيدروجيل في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. الآن، إضافة ثلاثة ملليلترات من 1X تريبسين في القارورة ووضعها في الحاضنة في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق لفصل الخلايا من قارورة زراعة الأنسجة. بعد التبسيني، إضافة ثلاثة ملليلتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية في قارورة، دوامة لخلط، ونقل الخليط إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر.الطرد المركزي حل الخلية لمدة ثلاث دقائق في 1، 710 مرات G.Aspirate االكبيرة وإعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام إلى تركيز 50 مرة 10 إلى الخلايا الأربع لكل ملليلتر. أخرج طبق الهيدروجيل من الثلاجة. إزالة الكولاجين-1 من الهيدرجيل وشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.إضافة 75 مرات 10 إلى الخلايا الثالثة إلى أعلى استنسل PDMS والسماح للخلايا لإرفاق إلى سطح الهيدروجيل لمدة ساعة واحدة على الأقل في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بإزالة استنسل PDMS وغمر استنسل PDMS في 10X Trypsin لمدة 10 إلى 15 ثانية لإزالة أي خلايا مرفقة. إضافة ما لا يقل عن ملليلتر من وسائل الإعلام إلى طبق بيتري وتعقيم الاستنسل عن طريق الرش مع 70٪ الإيثانول، ومن ثم وضع تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق.ضع طبق بيتري في الحاضنة لمدة 36 ساعة على الأقل ، أو حتى يتم ملاحظة طبقة أحادية اة. تم مقارنة صور الطور التباين من 30 دقيقة قبل العلاج chalcone وساعتين بعد العلاج الشالكون. ولوحظ أن حالات الإزاحة التي تسببها الخلية في الخرز تقل في كل من الزلكون المنخفض الجرعة والحالات التشالكونية ذات الجرعة العالية عند مقارنتها بالسيطرة على الطبقات الأحادية HUVEC.قبل العلاج chalcone، كان الجر RMS حوالي 51 باسكال لجميع الظروف. بعد العلاج chalcone, كان هناك زيادة صغيرة في الجر RMS إلى 59 باسكال في جرعة منخفضة يعامل الشالكون monolayers وانخفاض ما يقرب من الضعفين في الجر RMS إلى 18 باسكال في جرعة عالية chalcone تعامل monolayers بالمقارنة مع السيطرة. زاد علاج الشالكون متوسط حجم الإجهاد العادي بين الخلايا مع جرعة منخفضة ، ولكنه انخفض بشكل كبير متوسط حجم الإجهاد العادي بين الخلايا مع جرعة عالية بالمقارنة مع التحكم.كما انخفض علاج التشالكون أقصى الضغوط بين الخلايا في كل من تركيز التشالكون المنخفض والعالي بالمقارنة مع التحكم. تأثير علاج التشالكون مهم إحصائياً استناداً إلى كل من T-tests واختبار ANOVA واحد عامل. أثناء وضع استنسل PDMS على رأس الجل ، تأكد من أن الجل جاف بما يكفي لضمان ختم محكم الماء بين استنسل PDMS والجل.ويمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول للتحقيق في مساهمة البيوميكانيكية لمجموعة متنوعة من تقاطعات الخلايا الخلوية، والبروتينات الهيكلية الهيكلية، وجزيئات التصاق مصفوفة الخلية، أو الجزيئات خارج الخلية مع التصوير الحي. مع هذا البروتوكول في المختبر، يمكن للباحثين الآن التحقيق بنجاح مجموعة من الميكانيكا الحيوية، فضلا عن الخصائص الكيميائية الحيوية أثناء إصلاح الأنسجة، والتئام الجروح، أو الانبثاث السرطانية دون نموذج حيواني. ونحن ننصح المشاهدين لدينا أن نكون حذرين جدا أثناء التعامل مع الشالكون وDMSO كما يقال استنشاق هذه الأدوية أن تكون ضارة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

إعادة تشكيل جسيم نووي مع الهستونات الأخت المسمى النظائر-تفاضلي

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS للمتعمقة توصيف والكمي لالجلوتامين والهليونين نزع الأميد في البندقية البروتيوميات

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

وصف SP0092 الركيزة-ملزمة-بروتين النقل الكربوهيدرات البيوكيميائية والهيكلية

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

توصيف الهيكلية من السكريات جدار الخلية المنان في النباتات باستخدام خطي

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

تعديل ناقلات التعبير باكولوفيروس لإنتاج يفرز البروتينات النباتية في خلايا الحشرات

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

الدراسات الهيكلية "للجزيئات الكبيرة" في الحل باستخدام "تبعثر الأشعة السينية زاوية صغيرة"

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

تحليل بيانات لجنة الأوراق المالية والبورصة -SAXS عن طريق إزالة الفولفورة والإيفاد في EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

التبلور والتصميم الهيكلي للانزيم: مجمع الركيزة بواسطة البلورات التسلسلية في رقاقة Microfluidic متعددة الاستخدامات

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

إعداد الشبكة السريعة للمجهر Cryo-Electron الذي تم حله زمنيا

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...