Name: perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00
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这项工作得到了中佛罗里达大学启动基金和国家卫生研究院国家心肺血液研究所的K25HL132098资助。

1. 制造聚丙烯酰胺 （PA） 凝胶
<ol><li>
培养培养皿
	<ol>
<li>通过将 200 mL 超纯水与 80 μL 醋酸和 50 μL 3-（三聚氧硅）丙酸丙烯酸混合制备结合硅烷溶液。粘结硅烷是一种用于使玻璃底部培养皿表面功能化用于水凝胶附件的解决方案。</li>
		<li>在搅拌板上搅拌结合硅烷溶液至少 1 小时。</li>
		<li>用结合硅烷溶液处理培养皿的中心，45分钟。</li>
		<li>去除结合硅烷溶液，用超纯水2x-3x冲洗?...

<ol>
	<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li><li>Style, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear,+intercellular+stress,+and+endothelial+cell+alignment.">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+forces:+a+useful+parameter+in+cancer+research.">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li><li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues.">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li><li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation.">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces.">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li><li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption.">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).</li><li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function.">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li><li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions.">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li><li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family.">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li><li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall.">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li><li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+phosphorylation+in+brain,+cardiac,+endothelial+and+epithelial+tissues.">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li><li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice.">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li><li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis.">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',5'-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation.">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li><li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+cytotoxicity+of+2,5-dihydroxychalcones+and+related+compounds.">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li></ol>

我们小组，以及其他小组，已经成功地使用TFM和MSM来探索细胞-细胞结在体外7、15、18、27的各种病理和生理细胞过程中的影响.例如，哈丁等人提出了一个非常有见地的研究，表明细胞间应力传输指导了内皮细胞15的准细胞间隙形成。虽然我们在这里报告的 Cx43 相关更改与 Hardin 等人报...

研究物理力和机械特性对细胞和组织生理学和病理学的影响的领域被称为机械生物学1。在微量生物学中已经应用的一些有用的技术是单层应力显微镜和牵引力显微镜。牵引力显微镜允许计算在细胞基板界面生成的牵引力，而单层应力显微镜允许计算单层2内相邻细胞之间产生的细胞间应力 ，3，4，5，6.从以前的方法得出的结果表明，细胞源的机械应力在决定一系列细胞过程3、4、5的命运中起着至关重要的作用。例如，在暴露于外部机械力时，作为集体迁移的一组细胞可以改变其形态，使其形状极化，从而沿施加力的方向对齐和迁移，部分产生牵引力7， 8.牵引力提供可用于评估细胞收缩性且使用牵引力显微镜 （TFM） 计算的指标。牵引力显微镜 （TFM） 首先确定细胞引起的基板变形，然后使用数学严谨的基于力学的计算方法计算牵引场。由于计算牵引力的能力已经存在了相当长的时间，研究人员利用TFM揭示了牵引力对一系列过程的影响，包括癌症9、伤口愈合10和工程心脏评估组织11.
TFM和MSM的实现可以分为三个基本步骤，必须按以下顺序执行：第一，确定细胞产生的水凝胶变形;第二，从水凝胶变形中恢复牵引力;第三，使用有限元法计算整个单层内的法线和剪切细胞间应力。为了计算凝胶位移，使用自定义编写的粒子图像速度测量（PIV）例程，将具有细胞的荧光珠图像与参考珠图像（无细胞）进行比较。PIV 分析的交叉关联窗口大小和重叠分别选择为 32 x 32 像素和 0.5 像素。此时，像素偏移被转换为微米，通过乘以像素到微米的转换系数（对于我们的显微镜，此转换系数为 0.65）来获得平面内位移。与忽略平面外位移相关的错误可以忽略12，13。在计算凝胶位移后，可以使用两种类型的牵引力测量，约束牵引力和无约束牵引力8、14。无约束牵引力为整个视场（包括带单元和无单元的区域）提供牵引场，而约束牵引力仅为包含单元14的区域提供牵引场。然后，使用单层应力显微镜（MSM）计算细胞间应力，这是牵引力显微镜的延伸。MSM的实现基于以下假设：细胞基质界面上单层细胞施加的局部牵引力必须按照牛顿定律7 的要求，通过细胞-细胞界面上的细胞之间传输的机械力来平衡。 ，12，13.此处的一个关键假设是，细胞单层可以被视为薄弹性片，因为单层中的牵引力分布是已知的，并且力平衡不依赖于细胞材料属性。另一个关键假设是牵引力由光学视场（单层内）内的局部细胞间应力平衡，这种力平衡在远端区域（单层外）13中的影响最小。因此，由细胞间应力、位移或单层边界处两者的组合定义的边界条件对于执行 MSM13至关重要。考虑到上述信息，我们利用 MSM 执行有限元分析 （FEM）， 通过在膜。这些主应力随后用于计算整个单层内的 2D 平均正常细胞间应力[（[ 最大值] ±最小） /2] 和 2D 最大剪切细胞间应力 [（[最大值- ±最小] /2]12，13.Tambe等人12、13更详细地描述了这一过程。
单层应力显微镜（MSM）允许计算在单层6、7、8、12、13内产生的细胞细胞间应力。这些细胞间应力被建议是重要的组织生长和修复，伤口愈合，和癌症转移12，15，16，17。此外，细胞间应力也被认为在内皮细胞迁移和内皮屏障功能17，18也很重要。虽然细胞-细胞结，如紧密结和附着结都建议在内皮细胞间应力生成和传输中发挥关键作用，但间隙结的作用仍然难以捉摸。间隙结物理地连接相邻的细胞，为电流和分子（<1 KDa）在相邻细胞19、20、21之间传递提供一条通道。虽然内皮细胞表达Cx37，Cx40和Cx43间隙结19，22，Cx43可以说是最重要的疾病进展23。Cx43的重要性的证据可以发现的事实，在小鼠的Cx43基因删除导致低血压24，并有不良影响的血管生成25。此外，Cx43 已被记录为重要的细胞迁移和增殖和动脉粥样硬化的进展18，22，23，24，25.
在此协议中，我们使用 TFM 和 MSM 来调查在交波内皮单层内产生的牵引力和细胞间应力是否会受到内皮间隙结 Cx43 中断的影响。我们用2，5-二羟基沙酮（chalcone）扰乱了Cx43，一种被记录抑制Cx43表达26的分子。查尔酮被用来破坏Cx43，而不是siRNA，因为查尔酮以前曾被李等人报道，以扰乱Cx43表达26。此外，我们对沙酮对内皮的影响特别感兴趣，因为它也被报道为抗炎和抗血小板化合物，可能可用于预防和治疗各种血管病理学26。在实验开始一小时后进行切尔酮处理，对经过切尔酮处理的单层共成像6小时，并使用定制编写的MATLAB代码进行图像处理，以确定牵引力和随后的细胞间应力。我们的结果显示，牵引力和细胞间应力总体下降，这表明 Cx43 在内皮生物力学中起着关键作用。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td>Essential to flatten polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bis-acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610143</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8242;,5&#8242;-Dihydroxychalcone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>IDF00046</td>
			<td>To disrupt Cx43 structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2530-85-0</td>
			<td>Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Essential to make bind saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog # A-11001</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610700</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>To make blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005-100ML</td>
			<td>Use as a extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td>Buffer Saline needed for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>To dissolve chalcone and make stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8812</td>
			<td>0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Essential to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LVES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1460801</td>
			<td>Essential HUEVC media 200 supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M200500</td>
			<td>Essential media for HUVEC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog #13-8300</td>
			<td>Primary antibody for Cx43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm dia)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-20-1.5H</td>
			<td>35 mm petri dish with a 20 mm center well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td>102568-43-4</td>
			<td>Essential to functionalize polyacrylamide gel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW corning</td>
			<td>2646340</td>
			<td>Silicon elastomer with curing agent to make PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610801</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>To permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Used to detach cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption

内皮细胞已经建立，以产生细胞间应力和牵引，但间隙结在内皮细胞间应力和牵引生成中的作用目前尚不清楚。因此，我们在这里提出了一个基于力学的协议，通过向已知的Cx43抑制剂2，5-二羟基沙酮（chalcone）和测量该抑制剂对牵引力和细胞间应力的影响。我们提出了具有代表性的结果，与对照相比，在高沙酮剂量（2微克/mL）下，牵引力和细胞间应力均有所下降。该协议不仅适用于 Cx43，还适用于其他间隙结，前提是使用适当的抑制剂。我们相信，该协议将在心血管和美能生物学研究领域有用。

控制相对比图像，0.2 μg/mL，和2微克/mL锥形处理单层在沙酮处理前30分钟（图1A-C）和2小时后处理沙酮（图1D-F）。与对照HUVEC单层相比，观察到细胞诱导的珠位移位（μm）在低剂量沙酮和高剂量沙酮条件下（图2E，F）均减少（图2D）。...

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Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

在这里，我们提出了一个基于力学的协议，以破坏间隙结康康辛43，并通过观察牵引力和细胞间应力测量其对内皮生物力学的后续影响。

通过 Connexin 43 结构中断干扰内皮生物力学

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

该协议是重要的，因为它允许阐明细胞力在许多生理和病理过程中的作用，如伤口愈合和癌症转移，例如。这种基于力学的技术的主要优点是能够同时破坏细胞结，并测量其对细胞产生的机械力的影响，主要是牵引力和细胞间应力。我们的协议适用于广泛的病理生理过程，例如癌症转移、动脉结小和高血压。我们的方法可以集成，通过片上器官模型、生物工程组织构造、体外药物输送系统和组织共培养系统进行生化和生物力学分析。我们的协议执行起来相当简单。但是，我们建议那些第一次执行此协议的人要有耐心，不要急于完成此协议的步骤。我们的协议有独特的步骤，可能不清楚第一次用户。因此，我们鼓励用户遵循我们的书面分步过程，并使用可视化演示作为指导。首先，准备盲硅烷溶液，将200毫升超纯水与80微升醋酸和50微升硅烷甲酸酯混合。在搅拌板上搅拌粘合硅烷溶液至少一小时。使用绑定硅烷溶液处理 45 分钟的培养皿中心。取出粘合硅烷溶液，用超纯水冲洗培养皿两到三次。干燥培养皿表面，并在室温下储存，供将来使用。为了准备水凝胶溶液，在15毫升离心管中将12.49毫升的超纯水混合到2.062毫升40%丙烯酰胺和375微升2%丙烯酰胺。在水凝胶溶液中加入80微升荧光珠。轻轻摇动管子，将珠子与凝胶溶液混合。保持离心管上的盖子松动，并放在真空室中。在真空室中解气凝胶溶液至少 45 分钟。要聚合水凝胶，首先添加75微升10%的硫酸铵，然后在水凝胶溶液中加入8微升TEMED。将 24 微升水凝胶溶液放在培养皿的中心。用 18 毫米盖滑压到水凝胶上，使水凝胶变平，使高度达到大约 100 微米。等待至少 30 到 40 分钟进行凝胶聚合。将聚合水凝胶淹没在超纯水中，防止凝胶脱水。用铝箔盖住培养皿，防止荧光珠的光漂白，并储存在摄氏四度。首先，在50毫升离心管中，以20比1的比例将PDMS硅胶基座与硅胶固化剂混合。将管子倒置并多次大力摇动，以确保 PDMS 溶液正确混合。通过以 190 倍 G.将 PDMS 溶液的 5 到 6 毫升在 100 毫米培养皿的中心离心 1 分钟，并搅拌该盘，直到 PDMS 溶液覆盖整个 Petri 盘面，即可去除该溶液中的气泡。在 50 到 60 摄氏度下一夜之间治愈 PDMS 解决方案。接下来，用打孔器拆下直径为 16 毫米的圆形 PDMS 模具。使用直径为 1.25 毫米的活检冲孔在 PDMS 模具中创建小孔。将PDMS模具淹没在70%乙醇中两到三分钟，吸走多余的乙醇，然后在紫外线下放置五分钟，对它们进行消毒。吸气任何多余的液体，并去除水凝胶的盖滑。将 PDMS 模具放在水凝胶表面，并使用钳子对 PDMS 模具施加轻压，以确保 PDMS 模具与水凝胶表面之间有防水密封。用 Sulfo-SAMPA 溶解在浓度为 1 至 1，000 的 0.1 摩尔 HEPES 缓冲溶液中，将水凝胶表面覆盖，将水凝胶放在功率为 36 瓦的 UV 灯下 8 分钟。吸出多余的 Sulfo-SAMPA 和 HEPES 溶液，用 0.1 摩尔 HEPES 冲洗水凝胶两次，然后用超纯水再冲洗两次。吸气多余的超纯水，并使用200微升移液器涂覆水凝胶，每毫升胶原蛋白-1为0.1毫克。盖上盘子，保护荧光珠不光漂白，并在夜间将水凝胶储存在四摄氏度。现在，在烧瓶中加入三毫升1X Trypsin，并在37摄氏度的培养箱中放入3至5分钟，将细胞从组织培养瓶中分离出来。三辛化后，将三毫升细胞培养培养剂加入烧瓶中，旋转混合，并将混合物转移到15毫升的离心管中。将细胞溶液在1，710倍G下离心3分钟，吸升液，将介质中的细胞重新悬浮到每毫升4个细胞的浓度为50倍10。从冰箱里拿出水凝胶盘。从水凝胶中去除胶原蛋白-1，然后用PBS冲洗一次。将75倍10添加到PDMS模具顶部的第三个细胞，使细胞在37摄氏度和5%的二氧化碳的培养箱中至少附着在水凝胶表面一小时。取出 PDMS 模具，将 PDMS 模具淹没在 10X Trypsin 中 10 至 15 秒，以取出任何连接的电池。在培养皿中加入至少两毫升的介质，然后用70%乙醇喷洒，然后在紫外线下放置5分钟，对模具进行消毒。将培养皿放在培养箱中至少 36 小时，或直到观察到汇合单层。比较了沙康治疗前30分钟和沙康治疗后2小时相对比图像。与控制HUVEC单层相比，观察到细胞诱导珠位移在低剂量的沙科内和高剂量的沙科内条件下均减少。在进行沙康治疗之前，RMS 的牵引力在所有条件下约为 51 帕斯卡。在沙科内治疗后，低剂量的沙科内治疗单层 RMS 牵引力小到 59 帕斯卡，与控制相比，在高剂量的高孔治疗单层中，RMS 牵引力几乎减少了 18 帕斯卡。Chalcone 治疗增加了低剂量的平均正常细胞间应力量级，但与控制相比，用高剂量显著降低了平均正常细胞间应力量级。与对照相比，沙康治疗还减少了低和高沙康浓度的最大细胞间应力。基于T-test和单因子 ANOVA 测试，沙康治疗的影响具有统计学意义。将 PDMS 模具放在凝胶顶部时，请确保凝胶足够干燥，以确保 PDMS 模具和凝胶之间有防水密封。该协议还可用于探测各种细胞结、细胞骨骼蛋白、细胞基质粘附分子或带活成像的细胞外分子的生物力学贡献。有了这种体外方案，研究人员现在可以成功地研究一系列生物力学，以及组织修复、伤口愈合或癌症转移期间的生物力学特性。我们建议观众在处理沙康和DMSO时要非常小心，因为吸入这些药物是有害的。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

核小体的重建与差异同位素标记的姐妹组蛋白

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

科研

生物化学

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS进行深入表征和谷氨酰胺的定量和天冬酰胺脱酰胺在鸟枪蛋白质组学

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

碳水化合物转运基质结合蛋白 SP0092 的生化和结构表征

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

植物甘露聚糖细胞壁多糖的结构表征

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

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