Name: perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af University of Central Florida start-up fonde og national Heart, Lung, og Blood Institute af National Institute of Health under Award K25HL132098.

1. fremstilling af polyacrylamid (PA) geler
<ol><li>
Fremstilling af Petri skål
	<ol>
<li>Forbered binde silan-opløsningen ved at blande 200 ml ultrarent vand med 80 μl eddikesyre og 50 μl 3-(trimethoxysilyl) propylmethacrylat. Bind silan er en løsning, der bruges til at funktionalisere glasbunden Petri skål overflade til hydrogel fastgørelse.</li>
		<li>Bind silan opløsningen omrøres på en omrørings plade i mindst 1 time.</li>
		<li>Behandl centrum godt af Petri skålen med bind silan oplø...

<ol>
	<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Colin-York, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+(STFM).">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+stress+reconstitution+from+traction+force+data.">Intercellular stress reconstitution from traction force data.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).</li><li>Islam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Experimental+Methods+of+Cellular+Force+Sensing.">Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing.</a> Biomedical Journal of Science &amp; Technical Research. 17 (3), (2019).</li><li>Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear,+intercellular+stress,+and+endothelial+cell+alignment.">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+forces:+a+useful+parameter+in+cancer+research.">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li><li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues.">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li><li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation.">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces.">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li><li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption.">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).</li><li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function.">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li><li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions.">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li><li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family.">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li><li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall.">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li><li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+phosphorylation+in+brain,+cardiac,+endothelial+and+epithelial+tissues.">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li><li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice.">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li><li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis.">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',5'-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation.">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li><li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+cytotoxicity+of+2,5-dihydroxychalcones+and+related+compounds.">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li></ol>

Vores gruppe, såvel som andre, har med succes brugt TFM og MSM til at sonde indflydelse af celle-celle vejkryds i forskellige patologiske og fysiologiske cellulære processer in vitro7,15,18,27 . For eksempel præsenterede Hardin et al. en meget indsigtsfuld undersøgelse, der tyder på intercellulære stress transmission guider paracellulære Gap dannelse i endotelceller15</...

Det felt, der refererer til studiet af virkningerne af fysiske kræfter og mekaniske egenskaber på cellulære og vævs fysiologi og patologi er kendt som mechanobiology1. Et par nyttige teknikker, der er blevet udnyttet i mechanobiologi er enkeltlags stress mikroskopi og trækkraft mikroskopi. Trækkraft mikroskopi giver mulighed for beregning af distraktionerne genereret på celle-substrat interface, mens enkeltlags stress mikroskopi giver mulighed for beregning af intercellulære belastninger genereret mellem tilstødende celler inden for en enkeltlags2 ,3,4,5,6. Resultater fra tidligere metoder har antydet, at celle-afledte mekaniske belastninger spiller en afgørende rolle i fastsættelsen af skæbnen for et væld af cellulære processer3,4,5. For eksempel, ved udsættelse for en ekstern mekanisk kraft, en gruppe af celler migrere som en kollektiv kan ændre deres morfologi og polarisere deres form til at justere og migrere langs retningen af anvendt kraft ved, delvis, generering af distraktionerne7, 8. Tractions giver en måling, der kan bruges til at evaluere celle kontraktilitet og beregnes ved hjælp af Traction Force mikroskopi (TFM). Trækkraft mikroskopi (TFM) begynder med bestemmelsen af celle-induceret substrat deformationer efterfulgt af beregningen af trækkraft felt ved hjælp af en matematisk stringent, mekanik-baserede beregningsmæssige tilgang. Da evnen til at beregne distraktionerne har eksisteret i temmelig lang tid, forskere har udnyttet TFM at afsløre virkningen distraktionerne har på en række processer, herunder kræft9, sårheling10 og vurdering af manipuleret hjerte tissue11.
Gennemførelsen af TFM og MSM sammen kan opdeles i tre væsentlige trin, der skal udføres i følgende rækkefølge: for det første bestemmes de hydrogel deformationer, der produceres af cellerne; for det andet, distraktionerne er genvundet fra hydrogel deformationer; og for det tredje, en finite element tilgang bruges til at beregne normale og shear intercellulære belastninger i hele monolayer. For at beregne gel-fordrivelser blev fluorescens perle billeder med celler sammenlignet med reference vulst billedet (uden celler) ved hjælp af en Special skrevet partikel billede velocimetry (PIV) rutine. Korrelations vinduets størrelse og overlap for PIV-analyse blev valgt til henholdsvis 32 x 32 pixels og 0,5. På dette tidspunkt blev pixel Skift konverteret til mikron ved at multiplicere med en pixel-til-Micron-konverteringsfaktor (for vores mikroskop er denne omregningsfaktor 0,65) for at opnå in-plane forskydninger. Fejl, der er forbundet med at ignorere forskydninger uden for flyet, er ubetydelige12,13. Efter beregning af gel forskydninger, der er to typer af trækkraft målinger, der kan udnyttes, begrænset distraktionerne og uhæmmet distraktionerne8,14. Uindskrænket distraktionerne giver trækkraft feltet for hele synsfeltet (herunder regioner med og uden celler), mens begrænset distraktionerne giver trækkraft feltet kun for regioner, der omfatter celler14. Derefter, intercellulære belastninger beregnes ved hjælp af enkeltlags stress mikroskopi (MSM), som er en forlængelse af trækkraft mikroskopi. Gennemførelsen af MSM er baseret ud fra den antagelse, at lokale spor, der udøves af en enkeltlags af celler på celle-substrat grænsefladen skal afbalanceres af mekaniske kræfter overføres mellem celler ved celle-celle grænsefladen som krævet af Newtons love7 ,12,13. En vigtig antagelse her er, at cellen enkeltlags kan behandles som en tynd elastisk ark, fordi trækkraft fordelingen i enkeltlags er kendt og kraftbalancen ikke afhænger af cellemateriale egenskaber. En anden vigtig antagelse er, at trækkraft kræfterne opvejes af lokale intercellulære belastninger inden for det optiske synsfelt (inden for monolayer), og indflydelsen af denne styrke balance er minimal i den distale region (uden for monolayer)13. Derfor er de Grænsebetingelser, der er defineret af intercellulære belastninger, forskydninger, eller en kombination af begge ved enkeltlags grænsen afgørende for at udføre MSM13. Under hensyntagen til ovenstående oplysninger anvender vi MSM til at udføre en finite element analyse (FEM) for at genvinde den maksimale hoved belastning (σMax) og minimal hoved belastning (σmin) ved at rotere stress planet på hvert punkt i enkeltlags. Disse primære belastninger anvendes efterfølgende til at beregne 2D-gennemsnittet af normal intercellulære stress [(σMax + σmin)/2] og 2D Maximum shear intercellulære stress [(σMax -σmin)/2] inden for hele enkeltlags 12,13. Denne procedure er beskrevet mere detaljeret af Tambe et al.12,13
Enkeltlags stress mikroskopi (MSM) giver mulighed for beregning af celle-celle intercellulære belastninger genereret i en enkeltlags6,7,8,12,13. Disse intercellulære belastninger er blevet foreslået at være vigtige for vævsvækst og reparation, sårheling, og kræft metastaser12,15,16,17. Desuden, intercellulære understreger er blevet foreslået at også være vigtigt i endotel celle migration og endotel barriere funktion17,18. Mens celle celle vejkryds såsom stramme kryds og overholder kryds er begge blevet foreslået for at spille en afgørende rolle i endotel intercellulære stress generation og transmission, den rolle, Gap vejkryds forbliver flygtig. Gap kryds fysisk forbinde tilstødende celler og give en vej til elektrisk strøm og molekyler (< 1 kDa) at passere mellem tilstødende celler19,20,21. Selvom endotelceller udtrykker Cx37, Cx40 og Cx43 Gap-kryds19,22, Cx43 er formentlig det vigtigste med hensyn til sygdomsprogression23. Tegn på Cx43's betydning kan findes i det faktum, at genetisk sletning af Cx43 i mus resulterer i hypotension24 og har negative virkninger på angiogenese25. Desuden, Cx43 er blevet dokumenteret at være vigtigt for celle migration og spredning og i progression af åreforkalkning18,22,23,24,25 .
I denne protokol brugte vi TFM og MSM til at undersøge, om trækkraft og intercellulære stress generering inden for confluent, endotel enkeltlags ville blive påvirket af afbrydelsen af endotel Gap Junction Cx43. Vi afbrød Cx43 med 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), et molekyle dokumenteret for at hæmme Cx43 udtryk26. Chalcone blev brugt til at afbryde Cx43 i stedet for siRNA, da chalcone tidligere er blevet rapporteret af Lee et al. for at forstyrre Cx43 Expression26. Derudover var vi særligt interesserede i chalcone indflydelse på endotelet, da det også er blevet rapporteret at være en anti-inflammatorisk og anti-trombocytstof, der potentielt kan anvendes til forebyggelse og behandling af forskellige vaskulære patologier26. Chalcone behandlinger blev udført en time efter forsøget debut, chalcone-behandlede monolag blev afbildet i alt seks timer, og billedbehandling blev udført med en Custom-skrevet MATLAB kode til at bestemme distraktionerne og efterfølgende intercellulære Understreger. Vores resultater viste en samlet nedgang i distraktionerne og intercellulære belastninger, tyder Cx43 spiller en central rolle i endotelal biomekanik.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td>Essential to flatten polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bis-acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610143</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8242;,5&#8242;-Dihydroxychalcone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>IDF00046</td>
			<td>To disrupt Cx43 structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2530-85-0</td>
			<td>Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Essential to make bind saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog # A-11001</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610700</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>To make blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005-100ML</td>
			<td>Use as a extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td>Buffer Saline needed for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>To dissolve chalcone and make stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8812</td>
			<td>0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Essential to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LVES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1460801</td>
			<td>Essential HUEVC media 200 supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M200500</td>
			<td>Essential media for HUVEC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog #13-8300</td>
			<td>Primary antibody for Cx43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm dia)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-20-1.5H</td>
			<td>35 mm petri dish with a 20 mm center well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td>102568-43-4</td>
			<td>Essential to functionalize polyacrylamide gel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW corning</td>
			<td>2646340</td>
			<td>Silicon elastomer with curing agent to make PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610801</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>To permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Used to detach cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption

Endotelceller er blevet etableret for at generere intercellulære spændinger og tractions, men rolle Gap kryds spiller i endotelal intercellulære stress og trækkraft generation er i øjeblikket ukendte. Derfor præsenterer vi her en mekanik-baseret protokol til at sonde indflydelse af Gap Junction connexin 43 (Cx43) har på endotel biomekanik ved at udsætte flydende endotel monolag til en kendt Cx43 inhibitor 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) og måling af virkningen denne inhibitor har på distraktionerne og intercellulære belastninger. Vi præsenterer repræsentative resultater, som viser et fald i både distraktionerne og intercellulære belastninger under en høj chalcone dosering (2 μg/ml) i forhold til kontrol. Denne protokol kan anvendes til ikke blot Cx43, men også andre Gap kryds samt, forudsat den relevante inhibitor anvendes. Vi mener, at denne protokol vil være nyttig inden for områderne kardiovaskulær og mechanobiologi forskning.

Fasekontrast billeder af kontrol, 0,2 μg/ml, og 2 μg/ml chalcone behandlet monolag blev taget 30 minutter før behandling med chalcone (figur 1A-C) og 2 timer efter behandling med chalcone (figur 1D-F). Celle inducerede perle forskydninger (μm) blev observeret for at falde i både lavdosis-chalcone-og højdosis-chalcone-tilstande (figur 2E, F) sam...

Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Her præsenterer vi en mekanik-baseret protokol til at forstyrre Gap Junction connexin 43 og måle den efterfølgende indvirkning, dette har på endotelal biomekanik via observation af distraktionerne og intercellulære belastninger.

Perturbing Endothelial biomekanik via Connexin 43 strukturel forstyrrelse

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Denne protokol er betydelig, da det giver mulighed for belysning af den rolle, cellulære kræfter spiller i mange fysiologiske og patologiske processer, såsom sårheling og kræft metastaser, for eksempel. Den største fordel ved denne mekanikbaserede teknik er dens evne til samtidig at forstyrre cellecellekryds og måle dens indvirkning på cellegenererede mekaniske kræfter, primært trækkrafter og intercellulære stressfaktorer. Vores protokol gælder for en bred vifte af patofysiologiske processer, såsom kræftmetastaser, atherosklerrose, og hypertension, for eksempel.Vores metoder kan integreres til at udføre både biokemisk og biomekanisk analyse med organ-on-chip modeller, bio-manipuleret væv konstruktioner, in vitro drug delivery systemer, og væv co-kultur systemer. Vores protokol er ret ligetil at udføre. Men vi råder dem, der gør denne protokol for første gang at have tålmodighed og ikke haste gennem trinene i denne protokol.Vores protokol har unikke trin, der muligvis ikke er tydelige for første gangsbrugere. Derfor opfordrer vi brugerne til at følge vores skriftlige trinvise procedurer og bruge visuelle demonstrationer som vejledning. Til at begynde, forberede Blind-silan opløsning ved at blande 200 milliliter ultra rent vand med 80 mikroliter eddikesyre og 50 mikroliter silan methacrylat.Bind-silanopløsningen omrøres på en røreplade i mindst en time. Behandl midten godt af en petriskål med Bind-silanopløsningen i 45 minutter. Bind silanopløsningen fjernes, og petriskålen skylles med ultra rent vand to til tre gange.Tør petriskålens overflade og opbevares ved stuetemperatur til fremtidig brug. Hydrogelopløsningen klargøres 12,49 milliliter ultra rent vand til 2,062 milliliter 40%acrylamid og 375 mikroliter 2% bisalakamid i et 15-milliliter centrifugerør. Tilsæt 80 mikroliter fluorescerende perler til hydrogelopløsningen.Ryst forsigtigt røret for at blande perlerne med gelopløsningen. Hold hætten løs på centrifugerøret, og læg den i et vakuumkammer. Gasser gelopløsningen i mindst 45 minutter i vakuumkammeret.For at polymerisere hydrogel, først tilføje 75 mikroliter af 10% ammonium persulfat og derefter tilføje otte mikroliter af TEMED til hydrogel løsning. Placer 24 mikroliter af hydrogel opløsningen i midten af petriskålen. Tryk på hydrogel med en 18 millimeter dæksel slip at flade hydrogel og gøre en højde på ca 100 mikrometer.Vent mindst 30 til 40 minutter for gel polymerisering. Nedsænk den polymeriserede hydrogel i ultra rent vand for at forhindre geldehydrering. Dæk petriskålen med aluminiumsfolie for at forhindre fotobleaching af fluorescerende perler og opbevar dem ved fire grader Celsius.Bland først PDMS silikonebasen med silikonehærdingsmidlet i et forhold på 20 til et i et 50-milliliter centrifugerør. Inverter røret på hovedet og ryst kraftigt flere gange for at sikre korrekt blanding af PDMS-opløsningen. Fjern boblerne i PDMS-opløsningen ved centrifugering i et minut ved 190 gange G.Pour fem til seks milliliter af PDMS-opløsningen i midten af en 100-millimeter petriskål og agitret skålen, indtil PDMS-opløsningen dækker hele petriskålens overflade.Op kurer PDMS-løsningen natten over ved 50 til 60 grader Celsius. Fjern derefter en cirkulær 16-millimeter diameter PDMS stencil med en hulpunch. Brug en biopsipunst med en diameter på 1,25 millimeter til at skabe små huller i PDMS-stencilen.Steriliser PDMS stencils ved nedsænkning dem i 70% ethanol i to til tre minutter, aspirerende off overskydende ethanol og derefter placere under en UV-lys i fem minutter. Aspirere overskydende væske og fjern dækslet fra hydrogelen. Placer PDMS-stencilen på hydrogeloverfladen, og brug pincet til at trykke let på PDMS-stencilen for at sikre en vandtæt forsegling mellem PDMS stencilen og hydrogeloverfladen.Dæk hydrogelens overflade med Sulfo-SAMPA opløst i 0,1 molar HEPES bufferopløsning ved en koncentration på 1 til 1.000, og placer hydrogelen under en UV-lampe med en effekt på 36 watt i otte minutter. Aspirere den overskydende Sulfo-SAMPA og HEPES opløsning og skyl hydrogel to gange med 0,1 molar HEPES efterfulgt af yderligere to skylninger med ultra rent vand. Aspirate overskydende ultra rent vand og bruge en 200-mikroliter pipette til pels hydrogel med 0,1 milligram per milliliter kollagen-1.Dæk skålen for at beskytte fluorescerende perler fra photobleaching og opbevar hydrogelen ved fire grader Celsius natten over. Nu tilsættes tre milliliter 1X Trypsin i kolben og læg den i inkubatoren ved 37 grader Celsius i tre til fem minutter for at frigøre cellerne fra vævskulturkolben. Efter trypsinisering tilsættes tre milliliter cellekulturmedier i kolben, hvirvles for at blande og overføre blandingen til et 15-milliliter centrifugerør.Centrifuge celleopløsningen i tre minutter ved 1, 710 gange G.Aspirate supernatanten og re-suspendere cellerne i medierne til en koncentration på 50 gange 10 til de fire celler pr. milliliter. Tag hydrogelskålen ud af køleskabet. Fjern Kollagen-1 fra hydrogel og skyl én gang med PBS.Der tilsættes 75 gange 10 til de tredje celler til toppen af PDMS-stencilen, og cellerne fastgøres til hydrogeloverfladen i mindst en time i inkubatoren ved 37 grader Celsius og 5 % kuldioxid. Fjern PDMS-stencilen, og nedsænk PDMS-stencilen i 10X Trypsin i 10 til 15 sekunder for at fjerne eventuelle tilknyttede celler. Tilsæt mindst to milliliter medier til petriskålen og sterilisere stencilen ved sprøjtning med 70% ethanol, og derefter placere under UV-lys i fem minutter.Petriskålen hældes i rugemaskinen i mindst 36 timer, eller indtil der observeres et sammenflettmonslaget. Fase kontrast billeder af 30 minutter før chalcone behandling og to timer efter chalcone behandling blev sammenlignet. Celleinducerede perleforskydninger blev observeret for at falde i både lavdosischalcone og højdosis chalcone betingelser sammenlignet med kontrol HUVEC monolag.Før chalcone behandling, RMS trækkraft var omkring 51 Pascals for alle betingelser. Efter chalcone behandling, var der en lille stigning i RMS trækkraft til 59 Pascals i lav-dosis chalcone behandlet monolayers og en næsten dobbelt fald i RMS trækkraft til 18 Pascals i høj-dosis chalcone behandlet monolag sammenlignet med kontrol. Behandlingen med Chalcone øgede den gennemsnitlige normale intercellulære stressstørrelse med lav dosis, men reducerede signifikant den gennemsnitlige normale intercellulære stressstørrelse med høj dosis sammenlignet med kontrol.Chalcone behandlingen også nedsat den maksimale ren og skær intercellulære belastninger på både lav og høj chalcone koncentration i forhold til kontrol. Virkningen af chalcone behandling er statistisk signifikant baseret på både T-test og single faktor ANOVA test. Mens du placerer PDMS stencil på toppen af gelen, skal du sørge for, at gelen er tør nok til at sikre en vandtæt forsegling mellem PDMS stencil og gelen.Denne protokol kan også anvendes til at sonde det biomekaniske bidrag fra en række cellecellekryds, cytoskeletale proteiner, cellematrixadhæsionsmolekyler eller ekstracellulære molekyler med levende billeddannelse. Med denne in vitro-protokol, forskere kan nu med held undersøge et væld af biomekaniske, samt biokemiske egenskaber under væv reparation, sårheling, eller kræft metastaser uden dyremodel. Vi råder vores seere til at være meget forsigtige, mens håndtering chalcone og DMSO som indånding af disse stoffer er rapporteret at være skadelige.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Rekonstituering af nucleosomer med differentielt isotopmærkede Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS for Indgående Karakterisering og Kvantificering af glutamin og asparagin deamidering i Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrat Transport substrat-bindende-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Strukturel karakterisering af Mannan cellevæg polysaccharider i anlaeg, der anvender PACE

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantificering af Protein Homo-oligomerisering ved hjælp af kommercielle instrumentering og gratis, Open Source lysstyrke analyse Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Ændre Baculovirus udtryk vektorer til at producere udskilles vegetabilske proteiner i insekt celler

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle undersøgelser af makromolekyler i løsning ved hjælp af små vinkel X-Ray spredning

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analyse af SEC-SAXS-data via EFA-deconvolution og Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Krystallisering og strukturel bestemmelse af et enzym:Substratkompleks ved seriel krystallografi i en alsidig mikrofluidisk chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Hurtig gitterforberedelse til tidstilslutt kryo-elektronmikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...