Name: perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de University of Central Florida start-up funds en het National Heart, Lung en Blood Institute van het National Institute of Health under Award K25HL132098.

1. Polyacrylamide (PA) gels maken
<ol><li>
Voorbereiding van Petri schaaltje
	<ol>
<li>Bereid BIND silaan oplossing door het mengen van 200 mL ultrapuur water met 80 μL azijnzuur en 50 μL 3-(trimethoxysilyl) Propylmethacrylaat. BIND silaan is een oplossing die wordt gebruikt voor het functionaliseren van het glasbodem Petri schaaloppervlak voor hydrogel bevestiging.</li>
		<li>Roer de BIND silaan-oplossing op een roer plaat gedurende ten minste 1 uur.</li>
		<li>Behandel het centrum goed van de Petri...

<ol>
	<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Colin-York, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+(STFM).">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+stress+reconstitution+from+traction+force+data.">Intercellular stress reconstitution from traction force data.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).</li><li>Islam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Experimental+Methods+of+Cellular+Force+Sensing.">Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing.</a> Biomedical Journal of Science &amp; Technical Research. 17 (3), (2019).</li><li>Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear,+intercellular+stress,+and+endothelial+cell+alignment.">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+forces:+a+useful+parameter+in+cancer+research.">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li><li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues.">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li><li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation.">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces.">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li><li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption.">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).</li><li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function.">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li><li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions.">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li><li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family.">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li><li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall.">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li><li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+phosphorylation+in+brain,+cardiac,+endothelial+and+epithelial+tissues.">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li><li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice.">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li><li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis.">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',5'-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation.">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li><li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+cytotoxicity+of+2,5-dihydroxychalcones+and+related+compounds.">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li></ol>

Onze groep, evenals anderen, heeft met succes tfm en MSM gebruikt om de invloed van celcelknooppunten in verschillende pathologische en fysiologische cellulaire processen in vitro7,15,18,27 te sonde . Bijvoorbeeld, Hardin et al. presenteerde een zeer inzichtelijke studie die suggereert intercellulaire stress transmissie begeleidt paracellulaire gap vorming in endotheliale cellen<sup class="xref...

Het veld dat verwijst naar de studie van de effecten van fysieke krachten en van mechanische eigenschappen op cellulaire en weefsel fysiologie en pathologie staat bekend als Mechanobiology1. Een paar nuttige technieken die zijn gebruikt in de mechanobiologie zijn monolaag stress microscopie en tractiekracht microscopie. Tractiekracht microscopie maakt het mogelijk voor de berekening van tracties gegenereerd op de celsubstraat interface, terwijl monolaag stress microscopie maakt het mogelijk voor de berekening van intercellulaire spanningen gegenereerd tussen aangrenzende cellen binnen een monolaag2 ,3,4,5,6. Resultaten opgeleverd uit eerdere methoden hebben gesuggereerd dat cel-afgeleide mechanische spanningen spelen een cruciale rol bij het bepalen van het lot van een groot aantal cellulaire processen3,4,5. Bijvoorbeeld, bij blootstelling aan een externe mechanische kracht, een groep cellen migreren als een collectief kan hun morfologie veranderen en polariseren hun vorm te uitlijnen en te migreren langs de richting van de toegepaste kracht door, gedeeltelijk, het genereren van tractie7, 8. Tractions bieden een metriek die kan worden gebruikt voor het evalueren van de contractiliteit van de cel en worden berekend met behulp van tractiekracht microscopie (TFM). Tractiekracht microscopie (TFM) begint met de bepaling van celgeïnduceerde substraat vervormingen gevolgd door de berekening van het tractie veld met behulp van een wiskundig rigoureuze, op mechanica gebaseerde computationele benadering. Aangezien de mogelijkheid om te berekenen tractie al geruime tijd is geweest, onderzoekers hebben gebruikt tfm om te onthullen de impact tractie hebben op een groot aantal processen, met inbegrip van kanker9, wondgenezing10 en beoordeling van engineered cardiale weefsel11.
De implementatie van TFM en MSM samen kan worden onderverdeeld in drie essentiële stappen die in de volgende volgorde moeten worden uitgevoerd: ten eerste worden de door de cellen geproduceerde hydrogel vervormingen bepaald; Ten tweede worden tracties teruggewonnen uit hydrogel vervormingen; en ten derde wordt een eindige-element benadering gebruikt om de normale en shear intercellulaire spanningen binnen de gehele monolayer te berekenen. Om gelverplaatsingen te berekenen werden fluorescentie kraal beelden met cellen vergeleken met de referentie kraal afbeelding (zonder cellen) met behulp van een aangepaste-geschreven partikel afbeelding velocimetrie (PIV) routine. De cross-correlatie window grootte en overlapping voor PIV analyse werden gekozen als 32 x 32 pixels en 0,5, respectievelijk. Op dit moment werden pixel verschuivingen omgezet in micron door vermenigvuldiging met een pixel-naar-micron conversiefactor (voor onze Microscoop, deze omrekeningsfactor is 0,65) om in-plane verplaatsingen te verkrijgen. Fouten in verband met het negeren van verplaatsingen buiten het vlak zijn verwaarloosbaar12,13. Na de berekening van de gelverplaatsingen zijn er twee soorten tractie metingen die kunnen worden gebruikt, beperkte tracties en onbelemmerd tractie8,14. Onbeperkte tracties bieden het veld tractie voor het hele gezichtsveld (inclusief regio's met en zonder cellen), terwijl beperkte tractie het tractie veld alleen bieden voor regio's met cellen14. Vervolgens worden intercellulaire spanningen berekend met behulp van monolaag stress microscopie (MSM), wat een Verleng deel is van de tractiekracht microscopie. De implementatie van MSM is gebaseerd op de veronderstelling dat lokale tracties die worden uitgeoefend door een monolaag van cellen op de celsubstraat interface moeten worden afgewogen door mechanische krachten die worden overgebracht tussen cellen op de celcelinterface, zoals vereist door de wetten van Newton7 ,12,13. Een belangrijke aanname hier is dat de celmonolayer kan worden behandeld als een dun elastisch blad omdat de tractie verdeling in de monolaag bekend is en de kracht balans niet afhankelijk is van eigenschappen van het celmateriaal. Een andere belangrijke aanname is dat de tractie krachten worden gecompenseerd door lokale intercellulaire spanningen binnen het optische gezichtsveld (binnen de monolayer) en de invloed van deze kracht balans is minimaal in de distale regio (buiten de monolayer)13. Daarom zijn de grens omstandigheden die worden gedefinieerd door intercellulaire spanningen, verplaatsingen of een combinatie van beide op de monolaag-grens cruciaal voor het uitvoeren van MSM13. Rekening houdend met de bovenstaande informatie gebruiken we MSM om een eindige-elementanalyse (FEM) uit te voeren om de maximale hoofdspanning (σMax) en minimale hoofdbelasting (σmin) te herstellen door het stress vlak op elk punt in de monolaag. Deze belangrijkste spanningen worden vervolgens gebruikt om de gemiddelde normale intercellulaire stress van het 2D te berekenen [(σMax + σmin)/2] en 2D maximale shear intercellulaire stress [(σMax -σmin)/2] binnen de gehele monolaag 12,13. Deze procedure wordt uitvoeriger beschreven door tambe et al.12,13
Monolaag stress microscopie (MSM) zorgt voor de berekening van cel-cel intercellulaire spanningen gegenereerd binnen een monolaag6,7,8,12,13. Deze intercellulaire spanningen zijn gesuggereerd belangrijk voor weefsel groei en herstel, wondgenezing, en kanker metastasen12,15,16,17. Bovendien, intercellulaire spanningen zijn voorgesteld om ook belangrijk in de endotheliale Celmigratie en endotheliale barrièrefunctie17,18. Hoewel er beide zijn gesuggereerd om een cruciale rol te spelen in de endotheliale intercellulaire stress generatie en-transmissie, blijft de rol van de kloof knooppunten ongrijpbaar, terwijl de knooppunten van de celcellen, zoals nauwe kruisingen en aanhekings knooppunten, allebei een Gap-knooppunten verbinden fysiek aangrenzende cellen en zorgen voor een pad voor elektrische stroom en moleculen (< 1 kDa) om tussen de naburige cellen19,20,21te passeren. Hoewel endotheelcellen Express Cx37, Cx40, en Cx43 gap-knooppunten19,22, Cx43 is aantoonbaar de belangrijkste in termen van ziekteprogressie23. Bewijs van Cx43's belang kan worden gevonden in het feit dat genetische deletie van Cx43 in muizen resulteert in hypotensie24 en nadelige effecten heeft op angiogenese25. Daarnaast is Cx43 gedocumenteerd om belangrijk te zijn voor Celmigratie en proliferatie en in de progressie van atherosclerose18,22,23,24,25 .
In dit protocol gebruikten we tfm en MSM om te onderzoeken of tractie en intercellulaire stress generatie binnen de confluente, endotheliale monolaag zou worden beïnvloed door de verstoring van de endotheliale gap junction Cx43. We verstoorde Cx43 met 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), een molecuul gedocumenteerd voor de remming van Cx43 expressie26. Chalcon werd gebruikt om Cx43 te verstoren in plaats van siRNA, omdat Chalcon eerder werd gerapporteerd door Lee et al. om Cx43 uitdrukking26te verstoren. Daarnaast waren we vooral geïnteresseerd in de invloed van chalcone op het endotheel omdat het ook is gemeld dat het een anti-inflammatoire en anti-bloedplaatjes verbinding is die mogelijk kan worden gebruikt voor de preventie en behandeling van verschillende vasculaire pathologieën26. Chalcone behandelingen werden uitgevoerd een uur na het begin van het experiment, chalcone-behandelde monolagen werden afbeelding gemaakt voor een totaal van zes uur, en beeldverwerking werd uitgevoerd met een aangepaste geschreven MATLAB code om te bepalen tractie en vervolgens intercellulaire Benadrukt. Onze resultaten toonden een algehele afname van de tractie en intercellulaire spanningen, wat suggereert dat Cx43 een sleutelrol speelt in de endotheliale biomechanica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td>Essential to flatten polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bis-acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610143</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8242;,5&#8242;-Dihydroxychalcone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>IDF00046</td>
			<td>To disrupt Cx43 structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2530-85-0</td>
			<td>Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Essential to make bind saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog # A-11001</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610700</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>To make blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005-100ML</td>
			<td>Use as a extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td>Buffer Saline needed for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>To dissolve chalcone and make stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8812</td>
			<td>0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Essential to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LVES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1460801</td>
			<td>Essential HUEVC media 200 supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M200500</td>
			<td>Essential media for HUVEC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog #13-8300</td>
			<td>Primary antibody for Cx43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm dia)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-20-1.5H</td>
			<td>35 mm petri dish with a 20 mm center well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td>102568-43-4</td>
			<td>Essential to functionalize polyacrylamide gel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW corning</td>
			<td>2646340</td>
			<td>Silicon elastomer with curing agent to make PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610801</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>To permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Used to detach cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption

Endotheelcellen zijn opgericht voor het genereren van intercellulaire spanningen en tractie's, maar de rol gap knooppunten spelen in endotheliale intercellulaire stress en tractie generatie is momenteel onbekend. Daarom presenteren we hier een op mechanica gebaseerd protocol om de invloed van Gap Junction connexin 43 (Cx43) op endotheliale biomechanica te hebben door de confluente endotheliale monolagen bloot te stellen aan een bekende Cx43 remmer 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) en meten van de impact van deze remmer op tractie en intercellulaire spanningen. We presenteren representatieve resultaten, die een afname vertonen in zowel tractie en intercellulaire spanningen onder een hoge Chalcon dosering (2 μg/ml) in vergelijking met controle. Dit protocol kan worden toegepast op niet alleen Cx43, maar ook op andere tussen punten, mits de juiste remmer wordt gebruikt. Wij geloven dat dit protocol nuttig zal zijn op het gebied van cardiovasculaire en mechanobiologie onderzoek.

Fase contrast beelden van controle, 0,2 μg/ml, en 2 μg/ml Chalcon behandelde monolagen werden 30 minuten voor Chalcon behandeling (Figuur 1A-C) en 2 uur na Chalcon behandeling (figuur1D-F) genomen. Cel-geïnduceerde kraal verplaatsingen (μm) werden waargenomen te verminderen in zowel de lage dosis Chalcon en hoge dosis Chalcon voorwaarden (Figuur 2E, F</st...

Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Hier presenteren we een op mechanica gebaseerd protocol om de gap junction connexin 43 te verstoren en de daaropvolgende impact te meten die dit heeft op endotheliale biomechanica via observatie van tracties en intercellulaire spanningen.

Perturbing endotheliale biomechanica via Connexin 43 structurele verstoring

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Dit protocol is belangrijk omdat het het mogelijk maakt om opheldering te krijgen van de rol die cellulaire krachten spelen in veel fysiologische en pathologische processen, zoals wondgenezing en kankermetastasen, bijvoorbeeld. Het belangrijkste voordeel van deze op mechanica gebaseerde techniek is het vermogen om tegelijkertijd celcelverbindingen te verstoren en de impact ervan op celgegenereerde mechanische krachten, voornamelijk tracties en intercellulaire stressoren, te meten. Ons protocol is van toepassing op een breed scala aan pathofysiologische processen, zoals metastasen van kanker, atherosclerose en hypertensie, bijvoorbeeld.Onze methoden kunnen worden geïntegreerd om zowel biochemische als biomechanische analyse uit te voeren met organ-on-chip modellen, bio-engineered weefselconstructies, in vitro drug delivery systemen en weefsel co-cultuur systemen. Ons protocol is vrij eenvoudig uit te voeren. We raden degenen die dit protocol voor de eerste keer doen echter aan om geduld te hebben en niet door de stappen van dit protocol te haasten.Ons protocol heeft unieke stappen die mogelijk niet duidelijk zijn voor nieuwe gebruikers. Daarom moedigen we gebruikers aan om onze geschreven stapsgewijze procedures te volgen en visuele demonstraties als leidraad te gebruiken. Om te beginnen, bereid Blind-silane oplossing door het mengen van 200 milliliter ultra zuiver water met 80 microliter azijnzuur en 50 microliter van silaan methacrylaat.Roer de Bind-silane oplossing minstens een uur op een roerplaat. Behandel het midden goed van een petrischaaltje met de Bind-silane oplossing gedurende 45 minuten. Verwijder de Bind-silane oplossing en spoel de petrischaal twee tot drie keer af met ultra zuiver water.Droog het petrischaaloppervlak en bewaar op kamertemperatuur voor toekomstig gebruik. Om de hydrogeloplossing voor te bereiden, meng je 12,49 milliliter ultrazuiver water tot 2,062 milliliter van 40% acrylamide en 375 microliter van 2%bisacrylamide in een centrifugebuis van 15 milliliter. Voeg 80 microliter tl-kralen toe aan de hydrogeloplossing.Schud de buis voorzichtig om de kralen te mengen met de geloplossing. Houd de dop los op de centrifugebuis en plaats deze in een vacuümkamer. Ontgas de geloplossing gedurende ten minste 45 minuten in de vacuümkamer.Om de hydrogel te polymeriseren, voeg je eerst 75 microliters van 10% ammoniumpersulfaat toe en voeg dan acht microliters van TEMED toe aan de hydrogeloplossing. Plaats 24 microliter van de hydrogeloplossing in het midden van de petrischaal. Druk op de hydrogel met een afdekslip van 18 millimeter om de hydrogel plat te maken en maak een hoogte van ongeveer 100 micrometer.Wacht minstens 30 tot 40 minuten op gelpolymeerisatie. Dompel de gepolymeriseerde hydrogel onder in ultra zuiver water om geluitdroging te voorkomen. Bedek de petrischaal met aluminiumfolie om fotobleaching van fluorescerende kralen te voorkomen en op te slaan op vier graden Celsius.Meng eerst de PDMS siliconenbasis met het siliconen uithardingsmiddel met een verhouding van 20 tot één in een centrifugebuis van 50 milliliter. Keer de buis ondersteboven en schud meerdere keren krachtig om een goede mix van de PDMS-oplossing te garanderen. Verwijder de bellen in de PDMS-oplossing door één minuut te centrifugeren bij 190 keer G.Pour vijf tot zes milliliter van de PDMS-oplossing in het midden van een petrischaal van 100 millimeter en roer de schotel tot de PDMS-oplossing het gehele petrischaaloppervlak bedekt.Genees de PDMS-oplossing 's nachts op 50 tot 60 graden Celsius. Verwijder vervolgens een cirkelvormige PDMS-stencil met een gat puncher met een diameter van 16 millimeter. Gebruik een biopsiepunch met een diameter van 1,25 millimeter om kleine gaatjes in het PDMS-stencil te maken.Steriliseren PDMS stencils door ze onder te dompelen in 70% ethanol gedurende twee tot drie minuten, aspirating off overtollige ethanol en vervolgens onder een UV-licht gedurende vijf minuten. De overtollige vloeistof aanzuigen en de afdekslip uit de hydrogel verwijderen. Plaats het PDMS-stencil op het hydrogeloppervlak en gebruik een pincet om lichtdruk op het PDMS-stencil toe te passen om een waterdichte afdichting tussen het PDMS-stencil en het hydrogeloppervlak te garanderen.Bedek het oppervlak van de hydrogel met Sulfo-SAMPA opgelost in 0,1 molaire HEPES-bufferoplossing bij een concentratie van één tot 1.000 en plaats de hydrogel gedurende acht minuten onder een UV-lamp met een vermogen van 36 watt. Spoel de overtollige Sulfo-SAMPA- en HEPES-oplossing aan en spoel de hydrogel twee keer af met 0,1 molaire HEPES, gevolgd door nog eens twee spoelingen met ultra zuiver water. Aspirate overtollig ultra zuiver water en gebruik een 200-microliter pipet om de hydrogel te coaten met 0,1 milligram per milliliter collageen-1.Bedek de schotel om de tl-kralen te beschermen tegen fotobleaching en bewaar de hydrogel op vier graden Celsius 's nachts. Voeg nu drie milliliter 1X Trypsine toe in de kolf en plaats deze drie tot vijf minuten in de couveuse bij 37 graden Celsius om de cellen los te maken van de weefselkweekkolf. Na trypsinization, voeg drie milliliter van celcultuur media in de kolf, werveling om te mengen, en breng het mengsel in een 15-milliliter centrifuge buis.Centrifugeer de celoplossing gedurende drie minuten bij 1, 710 keer G.Aspirate de supernatant en schort de cellen in media opnieuw op tot een concentratie van 50 keer 10 tot de vier cellen per milliliter. Haal de hydrogelschotel uit de koelkast. Haal het collageen-1 uit de hydrogel en spoel één keer af met PBS.Voeg 75 keer 10 aan de derde cellen toe aan de bovenkant van het PDMS-stencil en laat de cellen zich minstens een uur hechten aan het hydrogeloppervlak in de couveuse bij 37 graden Celsius en 5%kooldioxide. Verwijder het PDMS-stencil en dompel het PDMS-stencil gedurende 10 tot 15 seconden onder in 10x Trypsin om eventuele aangesloten cellen te verwijderen. Voeg ten minste twee milliliter media toe aan de petrischaal en steriliseer het stencil door te spuiten met 70% ethanol en plaats vervolgens vijf minuten onder het UV-licht.Plaats de petrischaal minstens 36 uur in de couveuse, of totdat een confluent monolayer wordt waargenomen. Fasecontrastbeelden van 30 minuten voor de behandeling met chalcone en twee uur na de behandeling met chalcone werden vergeleken. Cel-geïnduceerde kraal verplaatsingen werden waargenomen te verminderen in zowel lage dosis chalcone en hoge dosis chalcone voorwaarden in vergelijking met controle HUVEC monolagen.Voorafgaand aan chalcone behandeling, RMS tracties waren ongeveer 51 Pascals voor alle voorwaarden. Na een chalcone behandeling was er een kleine toename van RMS-tracties tot 59 Pascals in met lage dosis chalcone behandelde monolagen en een bijna tweevoudige afname van RMS-tracties tot 18 Pascals in met hoge dosis behandelde monolagen in vergelijking met de controle. Chalcone behandeling verhoogde de gemiddelde normale intercellulaire stress omvang met lage dosis, maar aanzienlijk verminderde de gemiddelde normale intercellulaire stress omvang met een hoge dosis in vergelijking met controle.De chalcone behandeling verminderde ook de maximale pure intercellulaire spanningen bij zowel lage als hoge chalcone concentratie in vergelijking met de controle. Het effect van chalcone behandeling is statistisch significant op basis van zowel T-tests en single factor ANOVA-test. Terwijl u PDMS-stencil bovenop de gel plaatst, moet u ervoor zorgen dat de gel droog genoeg is om een waterdichte afdichting tussen het PDMS-stencil en de gel te garanderen.Dit protocol kan ook worden toegepast om de biomechanische bijdrage van een verscheidenheid van cel-celverbindingen, cytoskeletale proteïnen, celmatrix adhesiemoleculen, of extracellulaire molecules met levende beeldvorming te onderzoeken. Met dit in vitro protocol kunnen onderzoekers nu met succes een groot aantal biomechanische, evenals biochemische eigenschappen onderzoeken tijdens weefselherstel, wondgenezing of kankermetastasen zonder diermodel. We raden onze kijkers aan om heel voorzichtig te zijn tijdens de behandeling van chalcone en DMSO, omdat het inademen van deze geneesmiddelen schadelijk wordt gemeld.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Reconstructie van Nucleosomen met Differentieel Isotopen-gelabelde Sister Histon

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS Gedetailleerde karakterisering en kwantificering van glutamine en asparagine Deamidatie in Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Structurele karakterisering van Mannan celwand polysacchariden in installaties die gebruikmaken van tempo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Wijzigen Baculovirus expressievectoren voor de productie van plantaardige eiwitten in Insect cellen uitgescheiden

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Structurele Studies van macromoleculen in oplossing met behulp van kleine Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analyse van SEC-SAXS-gegevens via EFA-deconvolution en Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Kristallisatie en structurele bepaling van een enzym: substraatcomplex door seriële kristallografie in een veelzijdige microfluïdische chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Snelle rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste cryo-elektronenmicroscopie

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...