Name: perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00
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Diese Arbeit wurde von den Start-up-Fonds der University of Central Florida und dem National Heart, Lung, And Blood Institute des National Institute of Health unter der Auszeichnung K25HL132098 unterstützt.

1. Herstellung von Polyacrylamid (PA) Gelen
<ol><li>
Zubereitung der Petrischale
	<ol>
<li>Bereiten Sie die Silanlösung bereit, indem Sie 200 ml Reinstwasser mit 80 l Essigsäure und 50 l 3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat mischen. Bind Silan ist eine Lösung zur Funktionalisierung der Glasboden Petrischale Oberfläche für Hydrogel-Befestigung.</li>
		<li>Die Bindesilanlösung mindestens 1 h auf einer Rührplatte rühren.</li>
		<li>Behandeln Sie die Mitte gut der Petrischale mit Bindung Silanlösu...

<ol>
	<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li><li>Style, R. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues.">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li><li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation.">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis.">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',5'-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation.">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li><li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+cytotoxicity+of+2,5-dihydroxychalcones+and+related+compounds.">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li></ol>

Unsere Gruppe, wie auch andere, hat erfolgreich TFM und MSM verwendet, um den Einfluss von Zell-Zell-Verbindungen in verschiedenen pathologischen und physiologischen zellulären Prozessen in vitro7,15,18,27 zu untersuchen . Zum Beispiel präsentierten Hardin et al. eine sehr aufschlussreiche Studie, die interzelluläre Spannungsübertragung schlägt parazelluläre Spaltbildung in Endothelzellen...

Das Feld, das sich auf die Untersuchung der Auswirkungen physikalischer Kräfte und mechanischer Eigenschaften auf die Zell- und Gewebephysiologie und Pathologie bezieht, ist als Mechanobiologie1bekannt. Ein paar nützliche Techniken, die in der Mechanobiologie verwendet wurden, sind Monolayer-Stressmikroskopie und Traktionskraftmikroskopie. Die Traktionskraftmikroskopie ermöglicht die Berechnung von Traktionen, die an der Zell-Substrat-Schnittstelle erzeugt werden, während die monoschichtige Spannungsmikroskopie die Berechnung interzellulärer Spannungen ermöglicht, die zwischen benachbarten Zellen innerhalb einer Monoschicht erzeugt werden2 ,3,4,5,6. Die Ergebnisse früherer Methoden deuten darauf hin, dass zellabgeleitete mechanische Spannungen eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des Schicksals einer Vielzahl zellulärer Prozessespielen 3,4,5. Wenn z. B. eine externe mechanische Kraft ausgesetzt wird, kann eine Gruppe von Zellen, die als Kollektiv migrieren, ihre Morphologie verändern und ihre Form polarisieren, um die Richtung der angewendeten Kraft auszurichten und zu migrieren, indem sie teilweise Traktionen erzeugen7, 8. Traktionen bieten eine Metrik, die zur Bewertung der Zellkontraktilität verwendet werden kann und mittels Traktionskraftmikroskopie (TFM) berechnet wird. Die Traktionskraftmikroskopie (TFM) beginnt mit der Bestimmung zellinduzierter Substratverformungen, gefolgt von der Berechnung des Traktionsfeldes unter Verwendung eines mathematisch strengen, mechanikbasierten Berechnungsansatzes. Da die Fähigkeit, Traktionen zu berechnen, schon seit geraumer Zeit besteht, haben Forscher TFM genutzt, um die Auswirkungen von Traktionen auf eine Vielzahl von Prozessen zu offenbaren, einschließlich Krebs9,Wundheilung10 und Bewertung von technischen Herz Gewebe11.
Die Implementierung von TFM und MSM kann in drei wesentliche Schritte unterteilt werden, die in der folgenden Reihenfolge ausgeführt werden müssen: Erstens werden die von den Zellen erzeugten Hydrogelverformungen bestimmt; zweitens werden Traktionen aus Hydrogelverformungen zurückgewonnen; und drittens wird ein Finite-Elemente-Ansatz verwendet, um normale und scherende interzelluläre Spannungen innerhalb der gesamten Monolayer zu berechnen. Um Gelverschiebungen zu berechnen, wurden Fluoreszenzperlenbilder mit Zellen mit dem Referenzperlenbild (ohne Zellen) verglichen, indem eine benutzerdefinierte Partikelbild-Velocimetrie (PIV)-Routine verwendet wurde. Die Kreuzkorrelationsfenstergröße und -überlappung für die PIV-Analyse wurden für 32 x 32 Pixel bzw. 0,5 ausgewählt. Zu diesem Zeitpunkt wurden Pixelverschiebungen in Mikrometer umgewandelt, indem sie mit einem Pixel-zu-Mikron-Umrechnungsfaktor multipliziert wurden (für unser Mikroskop beträgt dieser Umrechnungsfaktor 0,65), um Verschiebungen in der Ebene zu erhalten. Fehler, die mit dem Ignorieren von Verschiebungen a-ebener Weise verbunden sind, sind vernachlässigbar12,13. Nach der Berechnung von Gelverschiebungen gibt es zwei Arten von Traktionsmessungen, die verwendet werden können, eingeschränkte Traktionen und uneingeschränkte Traktionen8,14. Unbeschränkte Traktionen stellen das Traktionsfeld für das gesamte Sichtfeld (einschließlich Regionen mit und ohne Zellen) bereit, während eingeschränkte Traktionen das Traktionsfeld nur für Regionen bereitstellen, die Zellen14enthalten. Anschließend werden interzelluläre Spannungen mittels Monolayer-Stressmikroskopie (MSM) berechnet, was eine Erweiterung der Traktionskraftmikroskopie darstellt. Die Implementierung von MSM basiert auf der Annahme, dass lokale Traktionen, die von einer Monoschicht von Zellen an der Zell-Substrat-Schnittstelle ausgeübt werden, durch mechanische Kräfte ausgeglichen werden müssen, die zwischen den Zellen an der Zell-Zell-Schnittstelle übertragen werden, wie es in Newtons Gesetzen gefordert wird7 ,12,13. Eine wichtige Annahme ist dabei, dass die Zellmonoschicht als dünnes elastisches Blatt behandelt werden kann, da die Traktionsverteilung in der Monoschicht bekannt ist und die Kraftbalance nicht von den Zellmaterialeigenschaften abhängt. Eine weitere wichtige Annahme ist, dass die Zugkräfte durch lokale interzelluläre Spannungen innerhalb des optischen Sichtfeldes (innerhalb der Monoschicht) ausgeglichen werden und der Einfluss dieses Kraftgleichgewichts im distalen Bereich (außerhalb der Monolayer) minimal ist13. Daher sind die Randbedingungen, die durch interzelluläre Spannungen, Verschiebungen oder eine Kombination aus beidem an der Einschichtgrenze definiert sind, entscheidend für die Ausführung von MSM13. Unter Berücksichtigung der oben genannten Informationen verwenden wir MSM, um eine Finite-Elemente-Analyse (FEM) durchzuführen, um die maximale Hauptspannung(max.) und die minimale Hauptspannung(min) durch Drehen der Spannungsebene an jedem Punkt innerhalb des Monolayer. Diese Hauptspannungen werden anschließend verwendet, um die durchschnittliche durchschnittliche normale interzelluläre Spannung von 2D [(max +min) /2] und die maximale 2D-Scherspannung[(max -min) /2] innerhalb der gesamten Monolayer zu berechnen. 12,13. Dieses Verfahren wird von Tambe et al.12,13 näher beschrieben.
Die Monolayer-Stressmikroskopie (MSM) ermöglicht die Berechnung von zellzellulären Spannungen, die in einer Monoschicht6,7,8,12,13erzeugt werden. Diese interzellulären Spannungen wurden vorgeschlagen, wichtig für Gewebewachstum und -reparatur, Wundheilung und Krebsmetastasen12,15,16,17zu sein. Darüber hinaus wurden interzelluläre Spannungen vorgeschlagen, auch bei der Endothelzellmigration und endotheliale Barrierefunktion17,18wichtig zu sein. Während Zell-Zell-Kreuzungen wie enge Kreuzungen und Adhäsivverbindungen beide als eine entscheidende Rolle bei der erzeugung und Transmission von endothelialen interzellulären Spannungen vorgeschlagen wurden, bleibt die Rolle von Spaltknoten schwer fassbar. Lückenknoten verbinden benachbarte Zellen physisch und bieten einen Weg für elektrischen Strom und Moleküle (<1 KDa), um zwischen benachbarten Zellen19,20,21zu passieren. Obwohl Endothelzellen Cx37, Cx40 und Cx43 Spaltknoten19,22ausdrücken, ist Cx43 wohl die wichtigste in Bezug auf die Krankheitsprogression23. Ein Beweis für die Bedeutung von Cx43 kann in der Tatsache gefunden werden, dass die genetische Deletion von Cx43 bei Mäusen zu Hypotonie24 führt und nachteilige Auswirkungen auf die Angiogenese25hat. Darüber hinaus wurde cx43 als wichtig für die Zellmigration und Proliferation und im Fortschreiten der Arteriosklerose18,22,23,24,25 .
In diesem Protokoll untersuchten wir mit TFM und MSM, ob Traktion und interzelluläre Spannungserzeugung innerhalb der konfluenten, endotheliaalen Monolayer durch die Störung der endotheliale Spaltkreuzung Cx43 beeinträchtigt würden. Wir störten Cx43 mit 2,5-Dihydroxychalcon (Chalcon), einem Molekül, das dokumentiert ist, um die Cx43-Expression26zu hemmen. Chalcone wurde verwendet, um Cx43 anstelle von siRNA zu stören, da Chalcone zuvor von Lee et al. berichtet wurde, um cx43 Expression26zu stören. Darüber hinaus waren wir besonders an chalcones Einfluss auf das Endothel interessiert, da es auch als entzündungshemmende und thromboplättliche Verbindung berichtet wurde, die potenziell zur Vorbeugung und Behandlung verschiedener Pathologien26. Chalcone-Behandlungen wurden eine Stunde nach Beginn des Experiments durchgeführt, mit Chalcone behandelte Monolayer wurden insgesamt sechs Stunden lang abgebildet, und die Bildverarbeitung wurde mit einem kundenspezifischen MATLAB-Code durchgeführt, um Traktionen und anschließend interzelluläre Betont. Unsere Ergebnisse zeigten eine allgemeine Abnahme der Traktionen und interzellulären Spannungen, was darauf hindeutet, dass Cx43 eine Schlüsselrolle in der endothelialen Biomechanik spielt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td>Essential to flatten polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bis-acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610143</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8242;,5&#8242;-Dihydroxychalcone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>IDF00046</td>
			<td>To disrupt Cx43 structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2530-85-0</td>
			<td>Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Essential to make bind saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog # A-11001</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610700</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>To make blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005-100ML</td>
			<td>Use as a extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td>Buffer Saline needed for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>To dissolve chalcone and make stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8812</td>
			<td>0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Essential to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LVES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1460801</td>
			<td>Essential HUEVC media 200 supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M200500</td>
			<td>Essential media for HUVEC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog #13-8300</td>
			<td>Primary antibody for Cx43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm dia)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-20-1.5H</td>
			<td>35 mm petri dish with a 20 mm center well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td>102568-43-4</td>
			<td>Essential to functionalize polyacrylamide gel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW corning</td>
			<td>2646340</td>
			<td>Silicon elastomer with curing agent to make PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610801</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>To permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Used to detach cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption

Endothelzellen wurden etabliert, um interzelluläre Spannungen und Traktionen zu erzeugen, aber die Rolle, die Lückenknoten bei endothelialen interzellulären Spannungen und Traktionsgenerierung spielen, ist derzeit nicht bekannt. Daher stellen wir hier ein mechanikbasiertes Protokoll vor, um den Einfluss des Spaltknotens Connexin 43 (Cx43) auf die endotheliale Biomechanik zu untersuchen, indem konfluente endotheliale Monolayer einem bekannten Cx43-Inhibitor 2,5-Dihydroxychalcon (Chalcon) und Messung der Auswirkungen dieses Inhibitors auf Traktionen und interzelluläre Spannungen. Wir präsentieren repräsentative Ergebnisse, die eine Abnahme sowohl der Traktionen als auch der interzellulären Spannungen unter einer hohen Chalcon-Dosierung (2 g/ml) im Vergleich zur Kontrolle zeigen. Dieses Protokoll kann nicht nur auf Cx43 angewendet werden, sondern auch auf andere Spaltknoten, vorausgesetzt, der entsprechende Inhibitor wird verwendet. Wir glauben, dass dieses Protokoll in den Bereichen kardiovaskuläre und mechanobiologische Forschung nützlich sein wird.

Phasenkontrastbilder der Steuerung, 0,2 g/ml und 2 g/ml-Chalcone-behandelte Monolayer wurden 30 Minuten vor der Chalcon-Behandlung (Abbildung 1A-C) und 2 Stunden nach der Chalcon-Behandlung (Abbildung 1D-F) aufgenommen. Es wurden zellinduzierte Perlenverschiebungen (m) beobachtet, die sowohl bei niedrig dosierten Chalcone- als auch bei hochdosierten Chalcon-Bedingungen abnehmen (<strong class="xf...

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Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Hier stellen wir ein mechanikbasiertes Protokoll vor, um den Spaltknoten-Anschluss 43 zu stören und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die endotheliale Biomechanik durch Beobachtung von Traktionen und interzellulären Spannungen zu messen.

Störende Endothelial Biomechanik über Connexin 43 Strukturelle Störung

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine Aufklärung der Rolle ermöglicht, die zelluläre Kräfte in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen spielen, wie z. B. Wundheilung und Krebsmetastasen. Der Hauptvorteil dieser mechanikbasierten Technik ist ihre Fähigkeit, Zell-Zell-Verbindungen gleichzeitig zu unterbrechen und ihre Auswirkungen auf zellgenerierte mechanische Kräfte, vor allem Traktionen und interzelluläre Stressoren, zu messen. Unser Protokoll ist auf eine Breite von pathophysiologischen Prozessen anwendbar, wie z. B. Krebsmetastasen, Atherosklerosen und Bluthochdruck.Unsere Methoden können integriert werden, um sowohl biochemische als auch biomechanische Analysen mit Organ-on-Chip-Modellen, biotechnischen Gewebekonstrukten, In-vitro-Medikamentenabgabesystemen und Gewebe-Cokultursystemen durchzuführen. Unser Protokoll ist ziemlich einfach durchzuführen. Wir raten jedoch denjenigen, die dieses Protokoll zum ersten Mal tun, Geduld zu haben und nicht durch die Schritte dieses Protokolls zu eilen.Unser Protokoll verfügt über einzigartige Schritte, die für Erstbenutzer möglicherweise nicht klar sind. Daher empfehlen wir Benutzern, unsere schriftlichen Schritt-für-Schritt-Verfahren zu befolgen und visuelle Demonstrationen als Anleitung zu verwenden. Zu Beginn bereiten Sie Blind-Silan-Lösung durch Mischen von 200 Milliliter ultrareinem Wasser mit 80 Mikroliter Essigsäure und 50 Mikroliter Silanmethacrylat.Die Bind-Silan-Lösung mindestens eine Stunde lang auf einer Rührplatte rühren. Behandeln Sie die Mitte gut einer Petrischale mit der Bind-Silan-Lösung für 45 Minuten. Entfernen Sie die Bind-Silan-Lösung und spülen Sie die Petrischale zwei- bis dreimal mit ultrareinem Wasser ab.Trocknen Sie die Petrischale Oberfläche und lagern Sie bei Raumtemperatur für die zukünftige Verwendung. Zur Herstellung der Hydrogellösung 12,49 Milliliter Reinstwasser in 2,062 Milliliter 40%Acrylamid und 375 Mikroliter 2%Bisacrylamid in einem 15-Milliliter-Zentrifugenrohr mischen. Fügen Sie der Hydrogellösung 80 Mikroliter fluoreszierende Perlen hinzu.Schütteln Sie die Röhre vorsichtig, um die Perlen mit der Gellösung zu mischen. Halten Sie die Kappe locker auf dem Zentrifugenrohr und legen Sie sie in eine Vakuumkammer. Entgasen Sie die Gellösung für mindestens 45 Minuten in der Vakuumkammer.Um das Hydrogel zu polymerisieren, fügen Sie zunächst 75 Mikroliter 10%Ammoniumpersulfat hinzu und fügen Sie dann acht Mikroliter TEMED in die Hydrogellösung ein. 24 Mikroliter der Hydrogellösung in die Mitte der Petrischale stellen. Drücken Sie auf das Hydrogel mit einem 18-Millimeter-Abdeckungsschlupf, um das Hydrogel abzuflachen und eine Höhe von ca. 100 Mikrometern zu erreichen.Warten Sie mindestens 30 bis 40 Minuten auf die Gelpolymerisation. Tauchen Sie das polymerisierte Hydrogel in reines Ultrawasser ein, um eine Gelaustrocknung zu verhindern. Bedecken Sie die Petrischale mit Aluminiumfolie, um das Photobleichen von fluoreszierenden Perlen zu verhindern und bei vier Grad Celsius aufzubewahren.Mischen Sie zunächst die PDMS-Silikonbasis mit dem Silikonhärtemittel im Verhältnis 20 zu eins in einem 50-Milliliter-Zentrifugenrohr. Invertieren Sie das Rohr auf den Kopf und schütteln Sie kräftig mehrmals, um eine ordnungsgemäße Durchmischung der PDMS-Lösung zu gewährleisten. Entfernen Sie die Blasen in der PDMS-Lösung, indem Sie eine Minute lang bei 190-fachen G.Pour fünf bis sechs Milliliter der PDMS-Lösung in der Mitte einer 100-Millimeter-Petrischale zentrieren, und erregen Sie die Schale, bis die PDMS-Lösung die gesamte Petrischalenoberfläche abdeckt.Härten Sie die PDMS-Lösung über Nacht bei 50 bis 60 Grad Celsius. Entfernen Sie anschließend eine kreisförmige PDMS-Schablone mit einem Lochstanzer mit einem Durchmesser von 16 Millimetern. Verwenden Sie einen Biopsies-Punch mit einem Durchmesser von 1,25 Millimetern, um kleine Löcher in der PDMS-Schablone zu erstellen.Sterilisieren Sie PDMS-Schablonen, indem Sie sie zwei bis drei Minuten lang in 70% Ethanol eintauchen, überschüssiges Ethanol absanieren und dann fünf Minuten unter UV-Licht stellen. Alle überschüssigen Flüssigkeiten ansaugen und den Deckelschlupf aus dem Hydrogel entfernen. Legen Sie die PDMS-Schablone auf die Hydrogeloberfläche und verwenden Sie eine Pinzette, um leichten Druck auf die PDMS-Schablone auszuüben, um eine wasserdichte Abdichtung zwischen der PDMS-Schablone und der Hydrogeloberfläche zu gewährleisten.Bedecken Sie die Hydrogeloberfläche mit Sulfo-SAMPA gelöst in 0,1 Molaren-HEPES-Pufferlösung in einer Konzentration von 1 bis 1 000 und legen Sie das Hydrogel acht Minuten lang unter eine UV-Lampe mit einer Leistung von 36 Watt. Die überschüssige Sulfo-SAMPA- und HEPES-Lösung ansaugen und das Hydrogel zweimal mit 0,1 Mol-HEPES abspülen, gefolgt von zwei zusätzlichen Spülungen mit reinem Ultrawasser. Aspirieren Sie überschüssiges ultrareines Wasser und verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um das Hydrogel mit 0,1 Milligramm pro Milliliter Kollagen-1 zu beschichten.Bedecken Sie die Schale, um die fluoreszierenden Perlen vor Photobleichungen zu schützen, und lagern Sie das Hydrogel über Nacht bei vier Grad Celsius. Fügen Sie nun drei Milliliter 1X Trypsin in den Kolben und legen Sie es in den Inkubator bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten, um die Zellen von der Gewebekultur-Flasche zu lösen. Nach der Trypsinisierung drei Milliliter Zellkulturmedien in den Kolben geben, wirbeln und die Mischung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr geben.Zentrifugieren Sie die Zelllösung für drei Minuten bei 1, 710 mal G.Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in den Medien auf eine Konzentration von 50 mal 10 zu den vier Zellen pro Milliliter wieder aus. Nehmen Sie die Hydrogelschale aus dem Kühlschrank. Entfernen Sie das Collagen-1 aus dem Hydrogel und spülen Sie es einmal mit PBS ab.Fügen Sie 75 mal 10 zu den dritten Zellen an der Spitze der PDMS-Schablone hinzu und lassen Sie die Zellen mindestens eine Stunde lang im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid an der Hydrogeloberfläche anhaften. Entfernen Sie die PDMS-Schablone und tauchen Sie die PDMS-Schablone 10 x 15 Sekunden lang in 10-fache Trypsin-Datei unter, um alle angeschlossenen Zellen zu entfernen. Fügen Sie mindestens zwei Milliliter Medien in die Petrischale und sterilisieren Sie die Schablone, indem Sie mit 70% Ethanol sprühen und dann fünf Minuten unter das UV-Licht stellen.Legen Sie die Petrischale mindestens 36 Stunden im Inkubator oder bis eine konfluente Monoschicht beobachtet wird. Phasenkontrastbilder von 30 Minuten vor der Chalcone-Behandlung und zwei Stunden nach der Chalcone-Behandlung wurden verglichen. Zellinduzierte Perlenverschiebungen wurden beobachtet, um sowohl bei niedrig dosierten Chalcone- als auch bei hochdosierten Chalcon-Bedingungen im Vergleich zu HUVEC-Monolayern zu verringern.Vor der Chalcone-Behandlung lagen die RMS-Traktionen für alle Erkrankungen bei rund 51 Pascal. Nach der Chalcone-Behandlung gab es einen leichten Anstieg der RMS-Traktionen auf 59 Pascal in niedrig dosierten, mit Chalcon behandelten Monolayern und eine fast zweifache Abnahme der RMS-Traktionen auf 18 Pascal in hochdosierten, mit Chalkonbehandelten Monolayern im Vergleich zur Kontrolle. Die Chalcone-Behandlung erhöhte die durchschnittliche normale interzelluläre Stressgröße mit niedriger Dosis, verringerte aber signifikant die durchschnittliche normale interzelluläre Stressgröße mit hoher Dosis im Vergleich zur Kontrolle.Die Chalcone-Behandlung verringerte auch die maximale reinzelluläre Belastung bei niedriger und hoher Chalcone-Konzentration im Vergleich zur Kontrolle. Die Auswirkungen der Chalcone-Behandlung sind statistisch signifikant, basierend auf T-Tests und Einem-Faktor-ANOVA-Tests. Stellen Sie beim Auflegen der PDMS-Schablone auf das Gel sicher, dass das Gel trocken genug ist, um eine wasserdichte Abdichtung zwischen der PDMS-Schablone und dem Gel zu gewährleisten.Dieses Protokoll kann auch angewendet werden, um den biomechanischen Beitrag einer Vielzahl von Zell-Zell-Verbindungen, Zytoskelettproteinen, Zellmatrix-Adhäsionsmolekülen oder extrazellulären Molekülen mit Live-Bildgebung zu untersuchen. Mit diesem In-vitro-Protokoll können Forscher nun erfolgreich eine Vielzahl biomechanischer sowie biochemischer Eigenschaften bei Gewebereparatur, Wundheilung oder Krebsmetastasen ohne Tiermodell untersuchen. Wir raten unseren Zuschauern, sehr vorsichtig zu sein, während chalcone und DMSO als Inhalation dieser Medikamente wird berichtet, schädlich zu sein.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Forschung

Biochemie

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS für eingehende Charakterisierung und Quantifizierung von Glutamin und Asparagin Desamidierung in Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Strukturelle Charakterisierung von Mannan Zellwand Polysaccharide in Anlagen, in denen Tempo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle Studien von Makromolekülen in Lösung mit kleinen Winkel Röntgenstreuung

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analyse von SEC-SAXS-Daten über EFA-Dekonvolution und Streuung

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Kristallisation und strukturelle Bestimmung eines Enzyms: Substratkomplex durch serielle Kristallisation in einem vielseitigen mikrofluidischen Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Schnelle Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Kryo-Elektronenmikroskopie

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...