Name: perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת מרכז פלורידה הסטארט-up ואת הלב הלאומי, ריאות, ובדם המכון של המכון הלאומי לבריאות תחת הפרס K25HL132098.

1. ייצור ג'לים פוליאקרילאמיד (פי אי)
<ol><li>
הכנת צלחת פטרי
	<ol>
<li>להכין את הפתרון לאגד silane על ידי ערבוב 200 mL המים אלקטרופורזה עם 80 μl חומצה אצטית 50 μl של 3-(טרימתאוקסיסילקסיל) פרופיל מתיונין. Bind silane הוא פתרון המשמש לתפקד בתחתית הזכוכית משטח צלחת פטרי עבור הידרוג'ל מצורף.</li>
		<li>מערבבים את ה...

<ol>
	<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Colin-York, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+(STFM).">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+stress+reconstitution+from+traction+force+data.">Intercellular stress reconstitution from traction force data.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).</li><li>Islam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Experimental+Methods+of+Cellular+Force+Sensing.">Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing.</a> Biomedical Journal of Science &amp; Technical Research. 17 (3), (2019).</li><li>Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear,+intercellular+stress,+and+endothelial+cell+alignment.">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+forces:+a+useful+parameter+in+cancer+research.">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li><li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues.">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li><li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation.">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces.">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li><li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption.">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).</li><li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function.">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li><li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions.">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li><li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family.">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li><li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall.">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li><li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+phosphorylation+in+brain,+cardiac,+endothelial+and+epithelial+tissues.">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li><li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice.">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li><li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis.">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',5'-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation.">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li><li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+cytotoxicity+of+2,5-dihydroxychalcones+and+related+compounds.">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li></ol>

הקבוצה שלנו, כמו גם אחרים, כבר בהצלחה באמצעות tfm ו MSM כדי לחקור את ההשפעה של צמתים תא תא בתהליכים הסלולריים הפתולוגיים והפיסיולוגיים שונים בתוך מבחנה7,15,18,27 . לדוגמה, הארדין ואח ' הציג מחקר תובנה מאוד המציעה מדריכים העברת מ...

השדה המתייחס לחקר ההשפעות של הכוחות הפיזיים והתכונות המכאניות של הפיזיולוגיה והפתולוגיה של רקמות הסלולר והרקמה מכונה בביולוגיה מכנית1. מספר טכניקות שימושיות שנוצלו באמצעות מכניאולוגיה הן מיקרוסקופ מתח מונאולייר ומיקרוסקופ כוח גרירה. מיקרוסקופ כוח גרירה מאפשר מיחשוב של מסקות שנוצרו בממשק התא-מצע, בעוד מיקרוסקופ הלחץ דופלקס מאפשר מיחשוב של מתחים בין תאיים שנוצר בין תאים סמוכים בתוך מונאולייר2 ,3,4,5,6 תוצאות הניבו מהשיטות הקודמות הציעו כי מדגיש מכני סלולרי לשחק תפקיד מכריע בקביעת גורלם של שורה של תהליכים סלולריים3,4,5. לדוגמה, בעת חשיפה לכוח מכני חיצוני, קבוצה של תאים העוברים כקולקטיב יכולה לשנות את המבנה שלהם ואת הצורה שלהם כדי ליישר ולהעביר לאורך כיוון הכוח המוחל על ידי, בין השאר, הפקת מעקב7, שמונה. Tractions מספקים מדד שניתן להשתמש בו להערכת כושר התאים ומחושבים באמצעות מיקרוסקופ כוח המתיחה (TFM). מיקרוסקופ כוח המתיחה (tfm) מתחיל עם הנחישות של המצע המושרה תאים דפורמציות ואחריו את החישוב של שדה המתיחה באמצעות מתמטית קפדנית, מכניקה מבוססי גישה חישובית. מאז היכולת לחשב תיחות כבר סביב די הרבה זמן, החוקרים משתמשים tfm לחשוף את תיחות ההשפעה יש על שורה של תהליכים, כולל סרטן9, פצע ריפוי10 והערכה של הלב מהונדסים . רקמה11
ניתן לחלק את יישום TFM ו-MSM ביחד לשלושה צעדים חיוניים שיש לבצע בסדר הבא: הראשון, הידרוג'ל דפורמציות המיוצרים על ידי התאים נקבעים; שנית, העקבות משוחזרים מתוך דפורמציות הידרוג'ל; ושלישית, גישה לאלמנט סופי משמשת לחישוב מתחים נורמליים ולהטיה בין-תאיים בתוך המונאולייר כולו. כדי לחשב את ג'ל displacements, תמונות הזריחה חרוז עם תאים הושוו עם תמונה חרוז התייחסות (ללא תאים) באמצעות מותאם אישית כתוב חלקיקים התמונה (PIV) השגרה. הקשר בין גודל חלון מתאם חפיפה עבור ניתוח PIV נבחרו להיות 32 x 32 פיקסלים ו 0.5, בהתאמה. בשלב זה, משמרות פיקסל הומרו מיקרון על ידי הכפלת עם מקדם פיקסל מיקרון המרה (עבור המיקרוסקופ שלנו, גורם ההמרה הזה הוא 0.65) כדי להשיג displacements המטוס. שגיאות המשויכות להתעלמות מdisplacements מחוץ למישור הן12,13. לאחר חישוב של ג'ל displacements, ישנם שני סוגים של מדידות המתיחה שיכול להיות מנוצל, הפרשות מוגבלו תיחות בלתימוגבל 8,14. תיחות לא מוגבל לספק את שדה המתיחה עבור השדה כולו של התצוגה (כולל אזורים עם וללא תאים), בעוד תיחות מוגבלת לספק את שדה המתיחה רק עבור אזורים הכוללים תאים14. לאחר מכן, הלחצים הבין-סלולאריים מחושבים באמצעות מיקרוסקופ לחץ מונאולייר (MSM), שהוא הרחבה של מיקרוסקופ כוח המתיחה. יישום ה-MSM מבוסס על ההנחה כי הפרשות המקומיות שהופעלו על ידי מונאולייר של תאים בממשק התא-מצע חייבים להיות מאוזנים על ידי כוחות מכניים ששודרו בין תאים בממשק תא התא כפי שדרש חוקי ניוטון7 ,12,13. ההנחה המפתח כאן היא כי המונרוייר התא יכול להיות מטופל כמו סדין אלסטי דק כי התפלגות המתיחה במונאולייר ידוע ומאזן הכוח אינו תלוי במאפייני חומר התא. ההנחה המפתח הנוסף היא כי כוחות המתיחה מאוזנים על ידי מדגיש בין הסלולר המקומי בתוך השדה האופטי של השקפה (בתוך המונאולייר) ואת ההשפעה של מאזן כוח זה הוא מינימלי באזור המרוחק (מחוץ המונאולייר)13. לכן, תנאי הגבול שהוגדרו על-ידי הלחצים הבינתאיים, הdisplacements, או שילוב של שניהם בגבול המונאולייר הינם חיוניים לביצוע MSM-13. בהתחשב במידע הנ ל, אנו משתמשים ב-MSM כדי לבצע ניתוח אלמנט סופי (פמ) כדי לשחזר את המתח העיקרי המקסימלי (σmax) והלחץ העיקרי מינימלי (σmin) על ידי סיבוב מטוס הלחץ בכל נקודה בתוך ה דופלקס. מדגיש אלה משמשים לאחר מכן כדי לחשב את ממוצע 2d המתח הבין-סלולארי נורמלי [(σmax + σmin)/2] ו-2d להטות מקסימום מתח התרבות [(σmax -σmin)/2] בתוך כל המונאולייר כולו 12,13. הליך זה מתואר ביתר פירוט על-ידי tambe et al.12,13
מיקרוסקופ מונאולייר לחץ (MSM) מאפשר חישוב של מדגיש תאי תא בתא שנוצר בתוך מונאולייר6,7,8,12,13. אלה מדגיש התרבות הוצעו להיות חשובים לצמיחה רקמות ותיקון, הפצע ריפוי, סרטן גרורות12,15,16,17. בנוסף, הוצעו מתחים בין-סלולאריים להיות חשובים גם בהעברת תאים אנדותל ובפונקציית המכשול האנדותל17,18. בעוד שצמתים בתאי תא כגון צמתים הדוקים וצמתים מדומה, שניהם הוצעו לשחק תפקיד קריטי ביצירת מתח בין התאים הבינתאיים ושידור, התפקיד של צמתי הפער נשאר חמקמק. הפער בצמתים לחבר את התאים הסמוכים ולספק מסלול עבור זרם חשמלי ומולקולות (ב< 1 kda) לעבור בין תאים שכנים19,20,21. למרות התאים האנדותל אקספרס Cx37, Cx40, ו Cx43 הפער צמתים19,22, Cx43 הוא ללא ספק החשוב ביותר במונחים של התקדמות המחלה23. ראיות של חשיבות Cx43's ניתן למצוא בעובדה כי מחיקה גנטית של Cx43 בעכברים תוצאות לחץ דם24 ויש לו השפעות שליליות על אנגיוגנזה25. בנוסף, Cx43 תועד להיות חשוב עבור הגירה תא והתפשטות ובהתקדמות של טרשת עורקים18,22,23,24,25 .
בפרוטוקול זה, השתמשנו ב-TFM ו-MSM כדי לחקור אם המתיחה ויצירת הלחץ הבין-תאי בתוך הקשר, היתה מושפעים מהפרעה לצומת הפער האנדותל Cx43. אנחנו שיבשו Cx43 עם 2, 5-דיהידרוטסטוסטרון (chalחרוט), מולקולה מתועדת לעכב Cx43 ביטוי26. Chalcone שימש לשבש Cx43 במקום siRNA כמו chalcone כבר דיווחו בעבר על ידי לי et al. כדי לשבש את ביטוי Cx4326. בנוסף, התעניינו במיוחד בהשפעת הצ על האנדותל כפי שהיא גם דווחה כתרכובת אנטי-דלקתית ואנטי-טסיות שעלולה לשמש למניעה וטיפול בכלי דם שונים פתווגיות26. טיפולים chalcone בוצעו כשעה לאחר הופעת הניסוי, החלב שטופלו monolayers היו תמונות עבור סך של שש שעות, עיבוד תמונה בוצעה עם קוד מותאם אישית כתוב MATLAB כדי לקבוע מעקב ולאחר מכן התרבות דגיש. התוצאות שלנו הראו ירידה כוללת של מתחים והלחצים הבינתאיים, הרומז Cx43 ממלאת תפקיד מרכזי בביומכניקה של האנדותל.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td>Essential to flatten polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bis-acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610143</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8242;,5&#8242;-Dihydroxychalcone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>IDF00046</td>
			<td>To disrupt Cx43 structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2530-85-0</td>
			<td>Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Essential to make bind saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog # A-11001</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610700</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>To make blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005-100ML</td>
			<td>Use as a extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td>Buffer Saline needed for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>To dissolve chalcone and make stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8812</td>
			<td>0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Essential to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LVES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1460801</td>
			<td>Essential HUEVC media 200 supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M200500</td>
			<td>Essential media for HUVEC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog #13-8300</td>
			<td>Primary antibody for Cx43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm dia)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-20-1.5H</td>
			<td>35 mm petri dish with a 20 mm center well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td>102568-43-4</td>
			<td>Essential to functionalize polyacrylamide gel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW corning</td>
			<td>2646340</td>
			<td>Silicon elastomer with curing agent to make PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610801</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>To permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Used to detach cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption

תאי האנדותל הוקמו כדי ליצור מתחים ומלחצים בין-סלולאריים, אך הצמתים הפערים בתפקיד משחקים במתח הבינתאי וביצירת המתיחה כרגע לא ידוע. לכן, אנו מציגים כאן פרוטוקול מבוסס מכניקה כדי לחקור את ההשפעה של הצומת הפער קונשין 43 (Cx43) יש על ביומכניקה אנדותל על ידי חשיפת confluent אנדותל מונולאיירס מCx43 הידוע 2, 5-דיהידרוטסטוסטרון (chalחרוט) ו מדידת ההשפעה המדכא הזה יש על מדידות ומדגיש התרבות. אנו מציגים תוצאות הנציג, אשר מראים ירידה הן מעקב ומדגיש בין התאים תחת מינון כלקון גבוה (2 μg/mL) בהשוואה לשליטה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם לא רק Cx43, אלא גם מצמתי פער אחרים, בהנחה שניתן להשתמש במדכא המתאים. אנו מאמינים שפרוטוקול זה יהיה שימושי בתחומים של מחקר כללי וכלי דם ומכניאוביולוגיה.

חדות הפאזה תמונות של שליטה, 0.2 μg/mL, ו 2 μg/mL chalcone טופלו monolayers נלקחו 30 דקות לפני הטיפול chalcone (איור 1א-ג) ו 2 שעות לאחר טיפול chalcone (איור 1D-F). המושרה displacements חרוז (μm) נצפו כדי להקטין את שניהם חלב במינון נמוך ומינון גבוה התנאים chalcone (<...

Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מבוסס מכניקה כדי לשבש את צומת הפער קונשין 43 ולמדוד את ההשפעה הבאה זה יש על ביומכניקה של אנדותל באמצעות התבוננות של מעקב ומדגיש התרבות.

Perturbing אנדותל ביומכניקה דרך קונשין 43 מבנית שיבוש

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי כפי שהוא מאפשר להבהיר את התפקיד כוחות הסלולר לשחק בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון ריפוי פצעים גרורות סרטן, למשל. היתרון העיקרי של טכניקה מבוססת מכניקה זו הוא יכולתה לשבש בו זמנית צמתים של תאים ולמדוד את השפעתה על כוחות מכניים שנוצרו על ידי תאים, בעיקר מתיחה ומלחצים בין תאיים. הפרוטוקול שלנו ישים על מגוון רחב של תהליכים פתופיזיולוגיים, כגון גרורות סרטן, טרשת יותרת המוח, יתר לחץ דם, למשל.ניתן לשלב את השיטות שלנו לביצוע ניתוח ביוכימי וביומכני עם מודלים של איברים על שבבים, מבני רקמות מהונדסים ביולוגית, מערכות אספקת תרופות במבחנה ומערכות תרבות-רקמות. הפרוטוקול שלנו הוא די פשוט לבצע. עם זאת, אנו ממליצים לאלה שעושים פרוטוקול זה בפעם הראשונה יש סבלנות ולא למהר דרך השלבים של פרוטוקול זה.הפרוטוקול שלנו כולל שלבים ייחודיים שעשויים שלא להיות ברורים למשתמשים בפעם הראשונה. לכן, אנו מעודדים את המשתמשים לפעול בהתאם לנהלים הכתובים שלנו צעד אחר צעד ולהשתמש בהדגמות חזותיות כהדרכה. כדי להתחיל, להכין פתרון עיוור-סילאן על ידי ערבוב 200 מיליליטר של מים טהורים במיוחד עם 80 microliters של חומצה אצטית ו 50 microliters של סילאן מתאקרילאט.מערבבים את תטגם Bind-silane על צלחת ערבוב במשך שעה אחת לפחות. יש לטפל היטב במרכזה של צלחת פטרי עם פתרון Bind-silane למשך 45 דקות. מוציאים את תסנון ה-Bind-silane ושטיפת צלחת פטרי במים טהורים במיוחד פעמיים עד שלוש פעמים.יבש את משטח צלחת פטרי ולאחסן בטמפרטורת החדר לשימוש עתידי. כדי להכין את פתרון הידרוג'ל, יש לערבב 12.49 מיליליטר של מים טהורים במיוחד ל-2.062 מיליליטר של 40% אקרילאמיד ו-375 מיקרוליטר של 2%bisacrylamide בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. הוסיפו 80 מיקרוליטרים של גם גם פדילי פלורסנט לתספורת ההידרוגל.בעדינות לנער את הצינור כדי לערבב את חרוזים עם פתרון ג'ל. שמור את הכובע רופף על צינור הצנטריפוגה ולמקום אותו בתא ואקום. דה גז פתרון הג'ל לפחות 45 דקות בתא ואקום.כדי להפוך את ההידרוג'ל לפילמור, הוסיפו תחילה 75 מיקרוליטרים של 10% אמוניום פרסולפט ולאחר מכן הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של TEMED לתתסמת ההידרוגל. מניחים 24 מיקרוליטרים של פתרון הידרוג'ל במרכז צלחת פטרי. לחץ על הידרוג'ל עם להחליק כיסוי 18 מילימטר כדי לשטח את הידרוג'ל ולעשות גובה של כ 100 מיקרומטר.המתן לפחות 30 עד 40 דקות לפולימריזציה של ג'ל. תטביעו את ההידרוגל המפולמר במים טהורים במיוחד כדי למנוע התייבשות ג'ל. מכסים את צלחת פטרי בנייר אלומיניום כדי למנוע פוטובלאצ'ים של חרוזים פלואורסצנטיים ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס.ראשית, מערבבים את בסיס הסיליקון PDMS עם סוכן ריפוי הסיליקון ביחס של 20 לאחד בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. הפוך את הצינור במהופך ורעד במרץ מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב נכון של פתרון PDMS. הסר את הבועות בתסכת PDMS על ידי צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 190 פעמים G.Pour חמישה עד שישה מיליליטר של פתרון PDMS במרכז צלחת פטרי 100 מילימטר להתסיס את המנה עד פתרון PDMS מכסה את כל משטח צלחת פטרי.לרפא את פתרון PDMS לילה ב 50 עד 60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר סטנסיל PDMS מעגלי בקוטר 16 מ"מ עם מחץ חורים. השתמש בניקוב ביופסיה בקוטר 1.25 מילימטר כדי ליצור חורים קטנים בסטנסיל PDMS.סטרילייז PDMS stencils על ידי טבילת אותם 70%אתנול במשך שתיים עד שלוש דקות, שאפתן את אתנול עודף ולאחר מכן הצבת תחת אור UV במשך חמש דקות. שאף כל נוזל עודף והסר את החלקת המכסה מההידרוג'ל. מניחים את סטנסיל PDMS על פני השטח הידרוג'ל ולהשתמש פינצטה כדי להפעיל לחץ אור על סטנסיל PDMS כדי להבטיח חותם אטום מים הדוק בין סטנסיל PDMS משטח הידרוג'ל.לכסות את פני השטח של הידרוג'ל עם Sulfo-SAMPA מומס 0.1 פתרון חיץ HEPES טוחן בריכוז של אחד עד 1, 000 ולמקום הידרוג'ל תחת מנורת UV עם כוח של 36 וואט במשך שמונה דקות. שאפו את פתרון ה-Sulfo-SAMPA וה-HEPES העודף ושטוף את ההידרחון פעמיים עם 0.1 HEPES טוחן ואחריו שתי שטיפות נוספות עם מים טהורים במיוחד. שאפו עודפי מים טהורים במיוחד ולהשתמש פיפט 200 מיקרוליטר כדי לצפות את הידרוג'ל עם 0.1 מיליגרם למיליליטר של קולגן-1.מכסים את המנה כדי להגן על החרוזים הפלואורסצנטיים מפני פוטובלאצ'ים ולאחסן את ההידרוגל בארבע מעלות צלזיוס בן לילה. עכשיו, להוסיף שלושה מיליליטר של 1X טריפסין לתוך הבקבוק ולמקם אותו באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד חמש דקות כדי לנתק את התאים מבקבוק תרבות הרקמה. לאחר טריפסיניזציה, מוסיפים שלושה מיליליטר של מדיה לתרבות התאים לתוך הבקבוק, מסתחררים כדי לערבב, ולהעביר את התערובת לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.צנטריפוגה פתרון התא במשך שלוש דקות ב 1, 710 פעמים G.Aspirate supernatant מחדש להשעות את התאים במדיה לריכוז של 50 פעמים 10 לארבעה תאים למיליליטר. מוציאים את צלחת ההידרוגל מהמקרר. מוציאים את הקולגן-1 מההידרוגל ושטיפת פעם אחת עם PBS.הוסף 75 פעמים 10 לתאים השלישיים לראש סטנסיל PDMS ולאפשר לתאים לצרף את פני השטח הידרוג'ל לפחות שעה אחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. הסר את הסטנסיל PDMS וטביעת הסטנסיל PDMS ב טריפסין 10X למשך 10 עד 15 שניות כדי להסיר תאים מחוברים. מוסיפים לפחות שני מיליליטר של מדיה לצלחת פטרי ומעקרים את הסטנסיל על ידי ריסוס עם 70% אתנול, ולאחר מכן מניחים תחת אור UV במשך חמש דקות.מניחים את צלחת פטרי באינקובטור לפחות 36 שעות, או עד מונולייזר confluent הוא ציין. תמונות ניגודיות פאזה של 30 דקות לפני הטיפול chalcone ו שעתיים לאחר הטיפול chalcone הושוו. תזוזות חרוזים הנגרמות על ידי התא נצפו כדי להקטין הן chalcone במינון נמוך ותנאי chalcone במינון גבוה בהשוואה לשליטה HUVEC monolayers.לפני טיפול chalcone, המתיחה RMS היו סביב 51 פסקל עבור כל התנאים. לאחר טיפול chalcone, חלה עלייה קטנה המתיחה RMS ל 59 פסקל במינון נמוך chalcone מטופלים monolayers וירידה כמעט כפולה במתיחה RMS ל 18 פסקל במינון גבוה chalcone מטופלים monolayers לעומת הבקרה. טיפול Chalcone גדל סדר הגודל הממוצע נורמלי מתח בין תאי עם מינון נמוך, אבל ירד באופן משמעותי את גודל הלחץ הבין תאי הנורמלי הממוצע עם מינון גבוה בהשוואה לשליטה.הטיפול בצ'לקוניה גם הפחית את הלחצים הבין-תאיים המרביים בריכוז זיכרון נמוך וגבה בהשוואה לשליטה. ההשפעה של טיפול chalcone היא מובהקת סטטיסטית מבוסס על שני T-בדיקות ומבחן ANOVA גורם יחיד. בזמן הנחת סטנסיל PDMS על גבי הג'ל, ודאו שהג'ל יבש מספיק כדי להבטיח איטום הדוק למים בין סטנסיל PDMS לג'ל.פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם כדי לחקור את התרומה הביומכנית של מגוון של צמתים תאים, חלבונים cytoskeletal, מולקולות הידבקות מטריצת התא, או מולקולות חוץ תאיים עם הדמיה חיה. עם פרוטוקול במבחנה זה, החוקרים יכולים כעת לחקור בהצלחה שורה של תכונות ביומכניות, כמו גם ביוכימיות במהלך תיקון רקמות, ריפוי פצעים, או גרורות סרטן ללא מודל בעלי חיים. אנו ממליצים לצופים שלנו להיות זהירים מאוד בעת טיפול chalcone ו DMSO כמו שאיפה של תרופות אלה הוא דיווח להיות מזיק.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

כינון של נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו היסטונים אחות

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS עבור אפיון מעמיק וכימות של גלוטמין ו asparagine Deamidation ב פרוטאומיקה Shotgun

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

אפיון מבניים של מנן פוליסכרידים דופן התא בצמחים באמצעות קצב

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

שינוי Baculovirus וקטורים ביטוי לייצר מופרש צמח חלבונים בתאי חרקים

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

לימודי המבנית של מקרומולקולות בפתרון באמצעות פיזור קרני רנטגן זווית קטנה

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

ניתוח נתוני SEC-SAXS באמצעות פירוק ופיזור EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

התגבשות וקביעת מבנה של אנזים:קומפלקס מצע על ידי התגבשות סדרתית בשבב מיקרופלואידי רב-תכליתי

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

הכנת רשת מהירה למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית שנפתרה בזמן

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...