Name: perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00
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इस काम के केंद्रीय फ्लोरिडा स्टार्ट-अप फंड और राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े, और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के रक्त संस्थान द्वारा पुरस्कार K25HL132098 के तहत समर्थित किया गया था.

1. पॉलीऐक्रिलमाइड (पीए) जैल बनाना
<ol><li>
पेट्री डिश की तैयारी
	<ol>
<li>200 एमएल अल्ट्राप्यूर पानी को 80 डिग्री सेल्सियस एसिटिक एसिड और 3-(ट्राइमेथॉक्सीसिलिल) के 50 डिग्री एल के साथ मिलाकर बांध सिलन घोल तैयार कर...

<ol>
	<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Colin-York, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+(STFM).">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+stress+reconstitution+from+traction+force+data.">Intercellular stress reconstitution from traction force data.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).</li><li>Islam, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear,+intercellular+stress,+and+endothelial+cell+alignment.">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+forces:+a+useful+parameter+in+cancer+research.">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li><li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues.">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li><li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation.">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces.">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li><li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption.">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).</li><li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function.">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li><li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions.">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li><li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family.">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li><li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall.">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li><li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis.">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',5'-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation.">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li><li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+cytotoxicity+of+2,5-dihydroxychalcones+and+related+compounds.">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li></ol>

हमारे समूह, साथ ही अन्य लोगों, सफलतापूर्वक TFM और एमएसएम का उपयोग कर रहा है विभिन्न रोग और शारीरिक सेलुलर प्रक्रियाओं में सेल सेल जंक्शनों के प्रभाव की जांच करने के लिएइनविट्रो 7,15,<sup ...

वह क्षेत्र जो कोशिकीय बलों और यांत्रिक गुणों के अध्ययन को को संदर्भित करता है , सेलुलर और ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान और विकृति पर इसे यांत्रिक जीव विज्ञान1के रूप में जाना जाता है . मेकोबायोलॉजी में उपयोग की गई कुछ उपयोगी तकनीकें मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी हैं। ट्रैक्शन बल माइक्रोस्कोपी सेल-सब्सट्रेट इंटरफ़ेस में उत्पन्न कर्षणों की गणना के लिए अनुमति देता है, जबकि मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी एक मोनोलेयर 2 के भीतर आसन्न कोशिकाओं के बीच उत्पन्न अंतरकोशिकीय तनावों की गणना के लिए अनुमति देता है ,3,4,5,6. पिछली विधियों से प्राप्त परिणामों से पता चलता है कि सेल व्युत्पन्न यांत्रिक तनाव अनेक सेल्यूलर प्रक्रियाओं3,4,5के भाग्य का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । उदाहरण के लिए, किसी बाह्य यांत्रिक बल के संपर्क में आने पर, सामूहिक रूप से प्रवास करने वाली कोशिकाओं का समूह अपनी आकृति विज्ञान को बदल सकता है और उनके आकार का ध्रुवीकरण कर सकता है ताकि वे अनुप्रयुक्त बल की दिशा के साथ संरेखित हो सकें और उसे आंशिक रूप से, कर्षण7उत्पन्न करसकें। 8. ट्रैक्शन ्स वे मीट्रिक प्रदान करते हैं जिनका उपयोग सेल अनुबंधता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है और उनकी गणना कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) का उपयोग करके की जाती है. ट्रैक्शन बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) एक गणितीय कठोर, यांत्रिकी आधारित अभिगणनायिक दृष्टिकोण का उपयोग करकर्षण क्षेत्र की गणना के बाद सेल प्रेरित सब्सट्रेट विकृतियों के निर्धारण के साथ शुरू होता है। कर्षण की गणना करने की क्षमता के बाद से काफी कुछ समय के लिए चारों ओर किया गया है, शोधकर्ताओं ने TFM का उपयोग किया है प्रभाव कर्षण पता चलता है प्रक्रियाओं के एक मेजबान पर है, कैंसरसहित 9, घाव भरने10 और इंजीनियर हृदय का आकलन ऊतक11|
TFM और MSM के कार्यान्वयन के साथ तीन आवश्यक कदम है कि निम्नलिखित क्रम में क्रियान्वित किया जाना चाहिए में विभाजित किया जा सकता है: पहले, कोशिकाओं द्वारा उत्पादित hydrogel विरूपण निर्धारित कर रहे हैं; दूसरा, कर्षण hydrogel विरूपण से बरामद कर रहे हैं; और तीसरे, एक परिमित तत्व दृष्टिकोण पूरे मोनोलेयर के भीतर सामान्य और कतरनी intercellular तनाव की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। जेल विस्थापन की गणना करने के लिए, कोशिकाओं के साथ फ्लोरोसेंट मनका छवियों एक कस्टम लिखा कण छवि velocimetry (PIV) दिनचर्या का उपयोग करके संदर्भ मनका छवि (कोशिकाओं के बिना) के साथ तुलना की गई। पार सहसंबंध विंडो आकार और PIV विश्लेषण के लिए ओवरलैप क्रमशः 32 x 32 पिक्सल और 0.5 होना चुना गया. इस समय, पिक्सेल बदलाव एक पिक्सेल-से-माइक्रोन रूपांतरण कारक (हमारे माइक्रोस्कोप के लिए, इस रूपांतरण कारक है 0.65) के साथ गुणा करके microns में परिवर्तित कर रहे थे में विमान विस्थापन प्राप्त करने के लिए. विमान के बाहर विस्थापन की अनदेखी के साथ जुड़े त्रुटियाँ नगण्य हैं12,13. जेल विस्थापन की गणना के बाद, वहाँ कर्षण माप के दो प्रकार है कि उपयोग किया जा सकता है, सीमित कर्षण और unconstrained कर्षण8,14. अप्रतिबंधित कर्षण दृश्य के संपूर्ण फ़ील्ड के लिए कर्षण फ़ील्ड प्रदान करते हैं (जिसमें कक्षों के साथ और उसके बिना क्षेत्र शामिल हैं), जबकि विवश कर्षण केवल उन क्षेत्रों के लिए कर्षण फ़ील्ड प्रदान करते हैं जिनमें कक्ष14शामिल हैं. फिर, intercellular तनाव मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी (एमएसएम) का उपयोग कर गणना कर रहे हैं, जो कर्षण बल माइक्रोस्कोपी का एक विस्तार है। एमएसएम का कार्यान्वयन इस धारणा पर आधारित है कि सेल-सबस्ट्रेट इंटरफ़ेस पर कोशिकाओं के मोनोलेयर द्वारा लगाए गए स्थानीय कर्षणों को सेल-सेल इंटरफ़ेस पर कोशिकाओं के बीच संचारित यांत्रिक बलों द्वारा संतुलित किया जाना चाहिए जैसा कि न्यूटन के नियमों 7 द्वारा मांग की गई है ,12,13. यहाँ एक महत्वपूर्ण धारणा यह है कि सेल मोनोलेयर को एक पतली लोचदार शीट के रूप में माना जा सकता है क्योंकि मोनोलेयर में कर्षण वितरण ज्ञात है और बल संतुलन सेल सामग्री गुणों पर निर्भर नहीं करता है। एक अन्य प्रमुख धारणा यह है कि कर्षण बल ऑप्टिकल क्षेत्र के भीतर स्थानीय अंतरकोशिकीय दबावों द्वारा संतुलित होते हैं (एकपरत के भीतर) और इस बल संतुलन का प्रभाव दूरस्थ क्षेत्र (एकपरत के बाहर)13में न्यूनतम है। अतः अंतरकोशिकीय तनावों, विस्थापनों, या मोनोलेयर सीमा पर दोनों के संयोजन द्वारा परिभाषित सीमा शर्तें एमएसएम13करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। उपरोक्त जानकारी को ध्यान में रखते हुए, हम एमएसएम का उपयोग एक परिमित तत्व विश्लेषण (फेम) को अधिकतम मुख्य तनाव(अधिकतम) और न्यूनतम मुख्य तनाव ($न्यूनतम) को ठीक करने के लिए प्रत्येक बिंदु पर तनाव तल को घुमाकर करते हैं मोनोलेयर। इन प्रमुख तनावों का उपयोग बाद में पूरे मोनोलेयर के भीतर 2D औसत सामान्य अंतरकोशिकीय प्रतिबल की गणना करने के लिए किया जाता है [([अधिकतम +मिनट) /2] और 2D अधिकतम कतरनी अंतरकोशिकीय प्रतिबल [([अधिकतम -$ न्यूनतम) /2 ] पूरे मोनोलेयर के भीतर 12,13. इस प्रक्रिया को और अधिक विस्तार से Tambe एट अल द्वारा वर्णित है12,13
मोनोलेयर स्ट्रेस माइक्रोस्कोपी (एमएसएम) एक मोनोलेयर6,7,8,12,13के भीतर उत्पन्न सेल-सेल इंटरसेल्यूलर तनावों की गणना के लिए अनुमति देता है। इन अंतरकोशिकीय दबावों को ऊतक के विकास और मरम्मत , घाव भरने और कैंसर मेटास्टेसिस12,15 ,16,17के लिए महत्वपूर्ण होने का सुझाव दिया गया है . इसके अतिरिक्त, अंत:कोशिकीय कोशिका प्रवास तथा अंत:मंडलीय अवरोध फलन17,18में अंतरकोशिकीय तनावों को भी महत्वपूर्ण बनाने का सुझाव दिया गया है । जबकि तंग जंक्शनों और अनुयायियों जंक्शनों जैसे सेल-सेल जंक्शनों को एंडोथेलियल अंतरकोशिकीय तनाव उत्पादन और संचरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने का सुझाव दिया गया है, अंतराल जंक्शनों की भूमिका मायावी बनी हुई है। गैप जंक्शनों को शारीरिक रूप से आसन्न कोशिकाओं को जोड़ता है और विद्युत धारा और अणुओं (lt;1 KDa ) को पड़ोसी कोशिकाओं19,20,21के बीच से गुजरने के लिए एक मार्ग प्रदान करता है . यद्यपि अंत:प्रज्ञा कोशिकाएं Cx37, Cx40 और Cx43 अंतराल जंक्शनों19,22,Cx43 को व्यक्त करती हैं , रोग की प्रगति के मामले में निश्चित रूप से सबसे महत्वपूर्ण है23. Cx43 के महत्व के साक्ष्य तथ्य यह है कि चूहों में Cx43 के आनुवंशिक विलोपन हाइपोटेंशन24 में परिणाम और एंजियोजेनेसिस पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है में पाया जा सकता है25. इसके अलावा, Cx43 सेल प्रवास और प्रसार के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए प्रलेखित किया गया है और atherosclerosis की प्रगति में18,22,23,24,25 .
इस प्रोटोकॉल में, हम TFM और MSM का इस्तेमाल किया जांच करने के लिए कि क्या कर्षण और intercellular तनाव पीढ़ी confluent के भीतर, endothelial मोनोलेयर endothelial अंतराल जंक्शन Cx43 के विघटन से प्रभावित होगा. हम 2,5-dihydroxychalcone (चैलकोन) के साथ Cx43 बाधित, एक अणु Cx43 अभिव्यक्ति26को बाधित करने के लिए प्रलेखित . Chalcone SiRNA के बजाय Cx43 को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था के रूप में chalcone पहले ली एट अल द्वारा सूचित किया गया है Cx43 अभिव्यक्ति26को बाधित करने के लिए . इसके अलावा, हम विशेष रूप से endothelium पर chalcone के प्रभाव में रुचि रखते थे के रूप में यह भी एक विरोधी भड़काऊ और विरोधी प्लेटलेट यौगिक है कि संभवतः रोकथाम और विभिन्न संवहनी के उपचार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है होने की सूचना दी गई है रोग26| Chalcone उपचार प्रयोग शुरुआत के बाद एक घंटे प्रदर्शन किया गया, chalcone इलाज monolayers छह घंटे की कुल के लिए छवि थे, और छवि प्रसंस्करण एक कस्टम लिखा MATLAB कोड के साथ किया गया था कर्षण निर्धारित करने के लिए और बाद में intercellular तनाव. हमारे परिणाम कर्षण और intercellular तनाव में एक समग्र कमी से पता चला, सुझाव Cx43 endothelial biomechanics में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td>Essential to flatten polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bis-acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610143</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8242;,5&#8242;-Dihydroxychalcone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>IDF00046</td>
			<td>To disrupt Cx43 structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2530-85-0</td>
			<td>Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Essential to make bind saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog # A-11001</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610700</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>To make blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005-100ML</td>
			<td>Use as a extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td>Buffer Saline needed for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>To dissolve chalcone and make stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8812</td>
			<td>0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Essential to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LVES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1460801</td>
			<td>Essential HUEVC media 200 supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M200500</td>
			<td>Essential media for HUVEC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog #13-8300</td>
			<td>Primary antibody for Cx43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm dia)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-20-1.5H</td>
			<td>35 mm petri dish with a 20 mm center well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td>102568-43-4</td>
			<td>Essential to functionalize polyacrylamide gel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW corning</td>
			<td>2646340</td>
			<td>Silicon elastomer with curing agent to make PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610801</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>To permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Used to detach cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption

अंत:कोशिकीय कोशिकाओं को अंतरकोशिकीय तनाव और कर्षण उत्पन्न करने के लिए स्थापित किया गया है, लेकिन भूमिका अंतराल जंक्शनों endothelial intercellular तनाव और कर्षण पीढ़ी में खेलने वर्तमान में अज्ञात है. इसलिए, हम यहाँ एक यांत्रिकी आधारित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए अंतराल जंक्शन connexin 43 (Cx43) के प्रभाव की जांच करने के लिए endothelial biomechanics पर एक ज्ञात Cx43 अवरोध करनेवाला 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) और confluent endothelial monolayers उजागर द्वारा है प्रभाव को मापने इस अवरोधकरनेवाला कर्षण और intercellular तनाव पर है. हम प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करते हैं, जो नियंत्रण की तुलना में एक उच्च चालकोन खुराक (2 ग्राम/एमएल) के तहत दोनों कर्षण और अंतरकोशिकीय तनावों में कमी दिखाते हैं। इस प्रोटोकॉल न सिर्फ Cx43 के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन यह भी अन्य अंतराल जंक्शनों के रूप में अच्छी तरह से, यह मानते हुए उपयुक्त अवरोध करनेवाला प्रयोग किया जाता है. हमारा मानना है कि यह प्रोटोकॉल हृदय और मेकोबायोलॉजी अनुसंधान के क्षेत्र में उपयोगी होगा।

नियंत्रण के चरण विपरीत छवियों, 0.2 g/mL, और 2 g/mL chalcone इलाज मोनोलेयर्स chalcone उपचार से पहले 30 मिनट लिया गया (चित्र 1ए -सी) और chalcone उपचार के बाद 2 घंटे (चित्र 1D-F) कोशिका-प्रेरि?...

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Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

यहाँ, हम अंतराल जंक्शन connexin 43 को बाधित करने के लिए एक यांत्रिकी आधारित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और बाद में प्रभाव को मापने के लिए यह कर्षण और intercellular तनाव के अवलोकन के माध्यम से endothelial biomechanics पर है.

कोनेक्सिन 43 स्ट्रक्चरल व्यवधान के माध्यम से परेशान एंडोथेलियल बायोमैकेनिक्स

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह उदाहरण के लिए घाव भरने और कैंसर मेटास्टेस जैसे कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में भूमिका सेलुलर बलों की स्पष्टता के लिए अनुमति देता है। इस यांत्रिकी आधारित तकनीक का मुख्य लाभ सेल-सेल जंक्शनों को एक साथ बाधित करने और सेल-जनित यांत्रिक बलों, मुख्य रूप से कर्षण और अंतरकोशिकीय तनावों पर इसके प्रभाव को मापने की क्षमता है। उदाहरण के लिए, हमारा प्रोटोकॉल कैंसर मेटास्टेस, एथेरोस्क्लेरोस और उच्च रक्तचाप जैसी रोगविज्ञानी प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होता है।हमारे तरीकों को अंग-ऑन-चिप मॉडल, बायो-इंजीनियर ऊतक निर्माण, इन विट्रो दवा वितरण प्रणाली और ऊतक सह-संस्कृति प्रणालियों के साथ जैव रासायनिक और जैव यांत्रिक विश्लेषण दोनों करने के लिए एकीकृत किया जा सकता है। हमारा प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए काफी सीधा है। हालांकि, हम पहली बार इस प्रोटोकॉल को करने वालों को धैर्य रखने और इस प्रोटोकॉल के कदमों से जल्दबाजी न करने की सलाह देते हैं ।हमारे प्रोटोकॉल में अद्वितीय कदम हैं जो पहली बार उपयोगकर्ताओं के लिए स्पष्ट नहीं हो सकते हैं। इसलिए, हम उपयोगकर्ताओं को हमारी लिखित चरण-दर-कदम प्रक्रियाओं का पालन करने और मार्गदर्शन के रूप में दृश्य प्रदर्शनों का उपयोग करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं। शुरू करने के लिए, 200 मिलीलीटर अल्ट्रा शुद्ध पानी को मिलाकर 80 माइक्रोलीटर एसिटिक एसिड और सिलेन मेथाक्रिलेट के 50 माइक्रोलीटर मिलाकर ब्लाइंड-सिलेन समाधान तैयार करें।कम से कम एक घंटे के लिए एक हलचल प्लेट पर बांध-सिलेन समाधान हिलाओ। 45 मिनट के लिए बांध-सिलेन समाधान के साथ एक पेट्री डिश के केंद्र को अच्छी तरह से इलाज करें। बिंद-सिलेन घोल निकालें और पेट्री डिश को अल्ट्रा प्योर वाटर से दो से तीन बार कुल्ला करें।पेट्री डिश सतह सूखी और भविष्य के उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर करें। हाइड्रोजेल समाधान तैयार करने के लिए, 15 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में 40% एक्रिलामाइड के 2.062 मिलीलीटर और 2% बिस्क्रियामाइड के 375 माइक्रोलीटर को 12.49 मिलीलीटर अल्ट्रा शुद्ध पानी मिलाएं। हाइड्रोजेल समाधान में फ्लोरोसेंट मोतियों के 80 माइक्रोलीटर जोड़ें।जेल के घोल के साथ मोतियों को मिलाने के लिए धीरे-धीरे ट्यूब को हिलाएं। कैप को सेंट्रलाइज ट्यूब पर ढीला रखें और इसे वैक्यूम चैंबर में रखें। वैक्यूम कक्ष में कम से कम 45 मिनट के लिए जेल समाधान को डी-गैस करें।हाइड्रोजेल को पॉलीमराइज करने के लिए, पहले 10% अमोनियम रिस्फफेट के 75 माइक्रोलीटर जोड़ें और फिर हाइड्रोजेल समाधान में TEMED के आठ माइक्रोलीटर जोड़ें। पेट्री डिश के केंद्र में हाइड्रोजेल सॉल्यूशन के 24 माइक्रोलीटर रखें। हाइड्रोगेल को समतल करने और लगभग 100 माइक्रोमीटर की ऊंचाई बनाने के लिए 18 मिलीमीटर कवर स्लिप के साथ हाइड्रोगेल पर दबाएं।जेल पॉलीमराइजेशन के लिए कम से कम 30 से 40 मिनट इंतजार करें। जेल निर्जलीकरण को रोकने के लिए अल्ट्रा शुद्ध पानी में बहुलक हाइड्रोजेल को जलमग्न करें। फ्लोरोसेंट मोतियों की फोटोब्लैचिंग को रोकने के लिए एल्यूमीनियम फॉयल के साथ पेट्री डिश को कवर करें और चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।सबसे पहले, पीडीएमएस सिलिकॉन बेस को सिलिकॉन क्यूरिंग एजेंट के साथ 50-मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में 20 से एक के अनुपात में मिलाएं। ट्यूब को उल्टा करें और पीडीएमएस समाधान के उचित मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए कई बार सख्ती से हिलाएं। पीडीएमएस समाधान में बुलबुले को 1 9 0 बार एक मिनट के लिए अपकेंद्री करके हटा दें जी 100 मिलीमीटर पेट्री डिश के केंद्र में पीडीएमएस समाधान के पांच से छह मिलीलीटर डालें और पकवान को तब तक उत्तेजित करें जब तक कि पीडीएमएस समाधान पूरे पेट्री डिश सतह को कवर नहीं करता।पीडीएमएस समाधान रात भर 50 से 60 डिग्री सेल्सियस पर इलाज करें। इसके बाद, एक छेद छिद्रक के साथ एक परिपत्र 16 मिलीमीटर व्यास पीडीएमएस स्टेंसिल निकालें। पीडीएमएस स्टेंसिल में छोटे छेद बनाने के लिए 1.25 मिलीमीटर व्यास बायोप्सी पंच का उपयोग करें।पीडीएमएस स्टेंसिल को दो से तीन मिनट के लिए 70% इथेनॉल में जलमग्न करके, अतिरिक्त इथेनॉल को बंद करके और फिर पांच मिनट के लिए यूवी लाइट के नीचे रखकर। किसी भी अतिरिक्त तरल को एस्पिरेट करें और हाइड्रोगेल से कवर स्लिप निकालें। पीडीएमएस स्टेंसिल को हाइड्रोजेल सतह पर रखें और पीडीएमएस स्टेंसिल और हाइड्रोजेल सतह के बीच पानी से तंग सील सुनिश्चित करने के लिए पीडीएमएस स्टेंसिल पर हल्का दबाव लागू करने के लिए चिमटी का उपयोग करें।हाइड्रोगेल की सतह को एक से 1, 000 की एकाग्रता पर 0.1 मोलर हेपेस बफर समाधान में भंग होने वाले सल्फो-सम्पा के साथ कवर करें और हाइड्रोगेल को आठ मिनट के लिए 36 वाट की शक्ति के साथ एक यूवी लैंप के नीचे रखें। अतिरिक्त सल्फो-सम्पा और एचईपीएस समाधान को एस्पिर करें और हाइड्रोगेल को 0.1 मोलर हेपेस के साथ दो बार कुल्ला करें और इसके बाद अल्ट्रा शुद्ध पानी के साथ एक अतिरिक्त दो कुल्ला करें। अतिरिक्त अल्ट्रा शुद्ध पानी को एस्पिरेट करें और कोलेजन-1 के मिलीलीटर प्रति 0.1 मिलीग्राम के साथ हाइड्रोगेल को कोट करने के लिए 200-माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करें।फ्लोरोसेंट मोतियों को फोटोब्लैचिंग से बचाने के लिए डिश को कवर करें और हाइड्रोगेल को रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें । अब, फ्लास्क में 1X ट्रिप्सिन के तीन मिलीलीटर जोड़ें और ऊतक संस्कृति फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग करने के लिए इसे तीन से पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें। ट्रिपसिनाइजेशन के बाद, फ्लास्क में सेल कल्चर मीडिया के तीन मिलीलीटर जोड़ें, मिश्रण करने के लिए भंवर, और मिश्रण को 15-मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।1, 710 बार जी पर तीन मिनट के लिए सेल समाधान अपकेंद्रित्र और फिर से मीडिया में कोशिकाओं को 50 गुना 10 की एकाग्रता के लिए प्रति मिलीलीटर चार कोशिकाओं को निलंबित करें। फ्रिज से हाइड्रोजेल डिश निकाल लें। हाइड्रोजेल से कोलेजन-1 निकालें और पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला।पीडीएमएस स्टेंसिल के शीर्ष पर तीसरी कोशिकाओं में 75 गुना 10 जोड़ें और कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में कम से कम एक घंटे के लिए हाइड्रोजेल सतह से 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर संलग्न करने की अनुमति दें। पीडीएमएस स्टेंसिल निकालें और किसी भी संलग्न कोशिकाओं को हटाने के लिए 10X ट्रिप्पसिन में पीडीएमएस स्टेंसिल को 10 से 15 सेकंड के लिए जलमग्न करें। पेट्री डिश में कम से कम दो मिलीलीटर मीडिया जोड़ें और 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव करके स्टेंसिल को स्टरलाइज करें, और फिर पांच मिनट के लिए यूवी लाइट के नीचे रखें।पेट्री डिश को इनक्यूबेटर में कम से कम 36 घंटे के लिए रखें, या जब तक एक कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर मनाया न जाए। चाल्कोन उपचार से पहले 30 मिनट की चरण विपरीत छवियों और चाल्कोन उपचार के दो घंटे बाद तुलना की गई। सेल-प्रेरित मनका विस्थापन को नियंत्रण एचयूवीसी मोनोलेयर की तुलना में कम खुराक वाले चाल्कोन और उच्च खुराक चाल्कोन स्थितियों में कमी करने के लिए देखा गया था।चाकोन उपचार से पहले, आरएमएस कर्षण सभी शर्तों के लिए लगभग 51 पास्कल थे। चाल्कोन उपचार के बाद, आरएमएस कर्षणों में कम खुराक वाले चाल्कोन उपचारित मोनोलेयर्स में 59 पास्कल में थोड़ी वृद्धि हुई और नियंत्रण की तुलना में उच्च खुराक चाल्कोन उपचारित मोनोलेयर्स में 18 पास्कल में आरएमएस कर्षणों में लगभग दो गुना कमी आई। चाल्कोन उपचार ने कम खुराक के साथ औसत सामान्य इंटरसेलुलर तनाव परिमाण में वृद्धि की, लेकिन नियंत्रण की तुलना में उच्च खुराक के साथ औसत सामान्य इंटरसेलुलर तनाव परिमाण में काफी कमी आई।चाल्कोन उपचार ने नियंत्रण की तुलना में कम और उच्च चाल्कोन एकाग्रता दोनों पर अधिकतम सरासर अंतरकोशिकीय तनाव में भी कमी आई। चाकोन उपचार का प्रभाव टी-परीक्षण और एकल कारक एवुनोवा परीक्षण दोनों के आधार पर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण है। जेल के शीर्ष पर पीडीएमएस स्टेंसिल रखते समय, सुनिश्चित करें कि जेल पीडीएमएस स्टेंसिल और जेल के बीच पानी-तंग सील सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त सूखा है।इस प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार के सेल-सेल जंक्शनों, साइटोस्केलेल प्रोटीन, सेल मैट्रिक्स आसंजन अणुओं, या लाइव इमेजिंग के साथ बाहुलर अणुओं के जैव यांत्रिक योगदान की जांच करने के लिए भी लागू किया जा सकता है। इस इन विट्रो प्रोटोकॉल के साथ, शोधकर्ता अब सफलतापूर्वक बायोमैकेनिकल के एक मेजबान की जांच कर सकते हैं, साथ ही ऊतक की मरम्मत, घाव भरने, या पशु मॉडल के बिना कैंसर मेटास्टेस के दौरान जैव रासायनिक गुणों । हम अपने दर्शकों को सलाह देते हैं कि वे चाकोन और डीएमएसओ को संभालते समय बहुत सावधान रहें क्योंकि इन दवाओं का साँस लेना हानिकारक बताया गया है ।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

विभिन्न आइसोटोप लेबल बहन histones साथ nucleosomes का पुनर्गठन

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-एमएस / एमएस में गहन विशेषता के लिए और Glutamine की मात्रा और asparagine Deamidation शॉटगन प्रोटिओमिक्स में

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

जैव रासायनिक और कार्बोहाइड्रेट परिवहन सब्सट्रेट-बाध्यकारी-प्रोटीन SP0092 के संरचनात्मक लक्षण वर्णन

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

पौधों में Mannan कोशिका दीवार Polysaccharides के संरचनात्मक लक्षण का उपयोग कर गति

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

अंशांकन-मुक्त इन विट्रो ठहराव में प्रोटीन होमो-oligomerization का उपयोग कर वाणिज्यिक इंस्ट्रूमेंटेशन और नि: शुल्क, खुला स्रोत चमक विश्लेषण सॉफ्टवेयर

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

संशोधित Baculovirus अभिव्यक्ति वैक्टर कीट कोशिकाओं में स्रावित संयंत्र प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

समाधान में अणुओं के संरचनात्मक अध्ययन छोटे कोण एक्स-रे कैटरिंग का उपयोग

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

ईएफए डीकॉन्वोल्यूशन और स्कैटर के माध्यम से एसईसी-एसएक्सएस डेटा का विश्लेषण

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

एक एंजाइम का क्रिस्टलीकरण और संरचनात्मक निर्धारण: एक बहुमुखी माइक्रोफ्लुइडिक चिप में सीरियल क्रिस्टलोग्राफी द्वारा सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

समय-हल क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए फास्ट ग्रिड तैयारी

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...