Name: perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di start-up dell'Università della Florida centrale e dal National Heart, Lung, And Blood Institute del National Institute of Health sotto il premio K25HL132098.

1. Produrre gel poliacrilammide (PA)
<ol><li>
Preparazione del piatto Petri
	<ol>
<li>Preparare la soluzione legare la soluzione silarante mescolando 200 mL di acqua ultrapura con 80 .L acido acetico e 50 .L di 3-(trimethoxysilyl)methacrylato. Bind silane è una soluzione utilizzata per funzionalizzare la superficie della piastra Petri fondo di vetro per l'attacco idrogel.</li>
		<li>Mescolare la soluzione di sbarramento su una piastra di mescolare per almeno 1 h.</li>
		<li>Trattare il pozzo centrale ...

<ol>
	<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li><li>Style, R. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues.">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li><li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation.">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces.">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li><li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption.">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).</li><li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function.">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li><li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions.">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li><li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family.">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li><li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall.">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li><li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+phosphorylation+in+brain,+cardiac,+endothelial+and+epithelial+tissues.">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li><li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice.">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li><li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis.">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',5'-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation.">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li><li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+cytotoxicity+of+2,5-dihydroxychalcones+and+related+compounds.">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li></ol>

Il nostro gruppo, così come altri, ha utilizzato con successo TFM e MSM per sondare l'influenza delle giunzioni cellula-cellula in vari processi cellulari patologici e fisiologici in vitro7,15,18,27 . Per esempio, Hardin e altri hanno presentato uno studio molto approfondito che suggerisce guide di trasmissione intercellulare della trasmissione della stress la formazione di gap paracellulare n...

Il campo che si riferisce allo studio degli effetti delle forze fisiche e delle proprietà meccaniche sulla fisiologia e patologia cellulare e tissutale è noto come meccanobiologia1. Alcune tecniche utili che sono state utilizzate nella meccanobiologia sono la microscopia a stress monostrato e la microscopia a forza di trazione. La microscopia a forza di trazione consente il calcolo delle trazioni generate nell'interfaccia del substrato cellulare, mentre la microscopia a sollecitazione del monostrato consente il calcolo delle sollecitazioni intercellulari generate tra celle adiacenti all'interno di un monostrato2 ,3,4,5,6. I risultati ottenuti dai metodi precedenti hanno suggerito che le sollecitazioni meccaniche derivate dalle cellule svolgono un ruolo cruciale nel determinare il destino di una serie di processi cellulari3,4,5. Ad esempio, dopo l'esposizione a una forza meccanica esterna, un gruppo di cellule che migrano collettivamente può alterare la loro morfologia e polarizzare la loro forma per allineare e migrare lungo la direzione della forza applicata, in parte, generando trazioni7, 8. Le trazioni forniscono una metrica che può essere utilizzata per valutare la contrattilità delle celle e vengono calcolate utilizzando la microscopia della forza di trazione (TFM). La microscopia della forza di trazione (TFM) inizia con la determinazione delle deformazioni del substrato indotte dalle cellule seguita dal calcolo del campo di trazione utilizzando un approccio computazionale matematicamente rigoroso e basato sulla meccanica. Dal momento che la capacità di calcolare le trazioni è stata intorno per un bel po 'di tempo, i ricercatori hanno utilizzato TFM per rivelare l'impatto che le trazioni hanno su una serie di processi, tra cui il cancro9, guarigione della ferita10 e valutazione del cardiaco ingegnerizzato tessuto11.
L'implementazione di TFM e MSM insieme può essere suddivisa in tre fasi essenziali che devono essere eseguite nel seguente ordine: in primo luogo, vengono determinate le deformazioni dell'idrogel prodotte dalle cellule; in secondo luogo, le trazioni vengono recuperate dalle deformazioni degli idrogel; e terzo, un approccio a elemento finito viene utilizzato per calcolare le sollecitazioni intercellulari normali e di taglio all'interno dell'intero monostrato. Per calcolare gli spostamenti di gel, le immagini di perline di fluorescenza con le cellule sono state confrontate con l'immagine di perline di riferimento (senza cellule) utilizzando una routine di velocitàmetria dell'immagine di particella (PIV) scritta su misura. Le dimensioni e la sovrapposizione della finestra di correlazione incrociata per l'analisi PIV sono state scelte rispettivamente per 32 x 32 pixel e 0,5. A questo punto, gli spostamenti dei pixel sono stati convertiti in micron moltiplicandosi con un fattore di conversione da pixel a micron (per il nostro microscopio, questo fattore di conversione è 0,65) per ottenere spostamenti in piano. Gli errori associati all'ignorare gli spostamenti fuori piano sono trascurabili12,13. Dopo il calcolo degli spostamenti in gel, ci sono due tipi di misurazioni di trazione che possono essere utilizzate, trazioni vincolate e trazioni non vincolate8,14. Le trazioni non vincolate forniscono il campo di trazione per l'intero campo visivo (comprese le regioni con e senza celle), mentre le trazioni vincolate forniscono il campo di trazione solo per le regioni che includono le celle14. Quindi, le sollecitazioni intercellulari vengono calcolate utilizzando la microscopia a stress monomero (MSM), che è un'estensione della microscopia a forza di trazione. L'attuazione di MSM si basa sull'assunto che le trazioni locali esercitate da un monostrato di cellule nell'interfaccia cellulare-substrato devono essere bilanciate da forze meccaniche trasmesse tra le cellule all'interfaccia cellulare, come richiesto dalle leggi di Newton7 ,12,13. Un presupposto chiave qui è che il monostrato cellulare può essere trattato come un foglio elastico sottile perché la distribuzione di trazione nel monostrato è nota e l'equilibrio di forza non dipende dalle proprietà del materiale cellulare. Un'altra ipotesi chiave è che le forze di trazione sono bilanciate da sollecitazioni intercellulari locali all'interno del campo visivo ottico (all'interno del monostrato) e l'influenza di questo equilibrio di forza è minima nella regione distale (al di fuori del monostrato)13. Pertanto, le condizioni di contorno definite da sollecitazioni intercellulari, spostamenti o una combinazione di entrambi al limite del monostrato sono cruciali per eseguire MSM13. Tenendo conto delle informazioni di cui sopra, utilizziamo MSM per eseguire un'analisi degli elementi finiti (FEM) per recuperare la sollecitazione massima principale(-max) e la sollecitazione principale minima(zmin)ruotando il piano di sollecitazione in ogni punto all'interno del Monostrato. Queste sollecitazioni principali vengono successivamente utilizzate per calcolare la media 2Ddella normale sollecitazione intercellulare [(((max 12,13. Questa procedura è descritta in dettaglio da Tambe etal.
La microscopia a stress monostrato (MSM) consente il calcolo delle sollecitazioni intercellulari cellulari generate all'interno di un monostrato6,7,8,12,13. Questi stress intercellulari sono stati suggeriti per essere importanti per la crescita e la riparazione dei tessuti, la guarigione delle ferite e la metastasi del cancro12,15,16,17. Inoltre, le sollecitazioni intercellulari sono state suggerite per essere importanti anche nella migrazione delle cellule endoteliali e nella funzione di barriera endoteliale17,18. Mentre le giunzioni cellulari-cellule come giunzioni strette e giunzioni di adesione sono state entrambe suggerite per svolgere un ruolo critico nella generazione e trasmissione della sollecitazione intercellulare endoteliale, il ruolo delle giunzioni gap rimane sfuggente. Le giunzioni gap collegano fisicamente celle adiacenti e forniscono un percorso per la corrente elettrica e le molecole (<1 KDa) per passare tra le celle vicine19,20,21. Sebbene le cellule endoteliali esprimano le giunzioni gap Cx37, Cx40 e Cx4319,22, Cx43 è probabilmente la più importante in termini di progressione della malattia23. Prova dell'importanza di Cx43 può essere trovato nel fatto che la delezione genetica di Cx43 nei topi si traduce in ipotensione24 e ha effetti negativi sull'angiogenesi25. Inoltre, Cx43 è stato documentato per essere importante per la migrazione cellulare e la proliferazione e nella progressione dell'aterosclerosi18,22,23,24,25 .
In questo protocollo, abbiamo usato TFM e MSM per studiare se la generazione di trazione e stress intercellulare all'interno del monostrato confluente e endoteliale sarebbe stata influenzata dall'interruzione della giunzione del gap endoteliale Cx43. Abbiamo interrotto Cx43 con 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), una molecola documentata per inibire l'espressione Cx4326. Chalcone è stato usato per interrompere cx43 invece di siRNA come chalcone è stato segnalato in precedenza da Lee et al. per interrompere l'espressione Cx4326. Inoltre, eravamo particolarmente interessati all'influenza di chalcone sull'endotelio in quanto è stato anche segnalato per essere un composto anti-infiammatorio e anti-platelet che può essere potenzialmente utilizzato per la prevenzione e il trattamento di vari vascolari patologie26. I trattamenti Chalcone sono stati eseguiti un'ora dopo l'inizio dell'esperimento, i monostrati trattati con chalcone sono stati immagini per un totale di sei ore e l'elaborazione delle immagini è stata eseguita con un codice MATLAB scritto su misura per determinare le trazioni e successivamente intercellulare Sottolinea. I nostri risultati hanno mostrato una diminuzione complessiva delle trazioni e delle sollecitazioni intercellulari, suggerendo che il Cx43 gioca un ruolo chiave nella biomeccanica endoteliale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td>Essential to flatten polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bis-acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610143</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8242;,5&#8242;-Dihydroxychalcone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>IDF00046</td>
			<td>To disrupt Cx43 structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2530-85-0</td>
			<td>Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Essential to make bind saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog # A-11001</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610700</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>To make blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005-100ML</td>
			<td>Use as a extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td>Buffer Saline needed for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>To dissolve chalcone and make stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8812</td>
			<td>0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Essential to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LVES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1460801</td>
			<td>Essential HUEVC media 200 supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M200500</td>
			<td>Essential media for HUVEC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog #13-8300</td>
			<td>Primary antibody for Cx43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm dia)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-20-1.5H</td>
			<td>35 mm petri dish with a 20 mm center well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td>102568-43-4</td>
			<td>Essential to functionalize polyacrylamide gel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW corning</td>
			<td>2646340</td>
			<td>Silicon elastomer with curing agent to make PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610801</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>To permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Used to detach cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption

Sono state create cellule endoteliali per generare sollecitazioni e trazioni intercellulari, ma il ruolo delle giunzioni gap giocate nella generazione di stress e trazione intercellulare endoteliale è attualmente sconosciuto. Pertanto, presentiamo qui un protocollo basato sulla meccanica per sondare l'influenza della giunzione gap connexin 43 (Cx43) ha sulla biomeccanica endoteliale esponendo monostrati endoteliali confluenti a un noto inibitore Cx43 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) e misurando l'impatto di questo inibitore sulle trazioni e sulle sollecitazioni intercellulari. Vi presentiamo risultati rappresentativi, che mostrano una diminuzione sia delle trazioni che delle sollecitazioni intercellulari sotto un alto dosaggio di chalcone (2 g/mL) rispetto al controllo. Questo protocollo può essere applicato non solo a Cx43, ma anche ad altre giunzioni di gap, supponendo che venga utilizzato l'inibitore appropriato. Crediamo che questo protocollo sarà utile nei campi della ricerca cardiovascolare e meccanobiologia.

Le immagini a contrasto di fase del controllo, 0,2 g/mL e 2 monostrati di chalcone trattati con chalcone di fase sono state scattate 30 minuti prima del trattamento dei chalcone (Figura 1A-C) e 2 ore dopo il trattamento dei chalcone (Figura 1D-F). Sono stati osservati spostamenti di perline indotta da cellule (m) diminuire sia nelle condizioni di chalcone a bassa dose che in condizioni di chalcon...

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Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Qui, presentiamo un protocollo basato sulla meccanica per interrompere la giunzione gap connexin 43 e misurare l'impatto successivo che questo ha sulla biomeccanica endoteliale attraverso l'osservazione di trazioni e sollecitazioni intercellulari.

Biomeccanica edonteliale perturbatrice tramite Connexin 43 Disgregazione strutturale

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Questo protocollo è significativo in quanto consente di inucidare il ruolo delle forze cellulari in molti processi fisiologici e patologici, come la guarigione delle ferite e le metastasi tumorali, per esempio. Il principale vantaggio di questa tecnica basata sulla meccanica è la sua capacità di interrompere simultaneamente le giunzioni cellulari e misurare il suo impatto sulle forze meccaniche generate dalle cellule, principalmente trazioni e fattori di stress intercellulari. Il nostro protocollo è applicabile a una vasta gamma di processi fisiopatologici, come metastasi tumorali, aterosclerose e ipertensione, per esempio.I nostri metodi possono essere integrati per eseguire analisi biochimiche e biomeccaniche con modelli organo su chip, costrutti di tessuti bio-ingegnerizzati, sistemi di somministrazione di farmaci in vitro e sistemi di co-coltura tissutale. Il nostro protocollo è abbastanza semplice da eseguire. Tuttavia, consigliamo a coloro che es fanno questo protocollo per la prima volta di avere pazienza e di non affrettarsi attraverso i passaggi di questo protocollo.Il nostro protocollo ha passaggi unici che potrebbero non essere chiari per gli utenti per la prima volta. Pertanto, incoraggiamo gli utenti a seguire le nostre procedure dettagliate scritte e a utilizzare le dimostrazioni visive come guida. Per iniziare, preparare la soluzione blind-silane mescolando 200 millilitri di acqua ultra pura con 80 microlitri di acido acetico e 50 microlitri di metacrilato di silane.Mescolare la soluzione Bind-silane su una piastra di agitazione per almeno un'ora. Trattare il pozzo centrale di una piastra di Petri con la soluzione Bind-silane per 45 minuti. Rimuovere la soluzione Bind-silane e sciacquare la piastra di Petri con acqua ultra pura da due a tre volte.Asciugare la superficie della piastra di Petri e conservare a temperatura ambiente per un uso futuro. Per preparare la soluzione di idrogel, mescolare 12,49 millilitri di acqua ultra pura a 2,062 millilitri di acrilammide al 40% e 375 microlitri di 2%bisacrilammide in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Aggiungere 80 microlitri di perline fluorescenti alla soluzione di idrogel.Agitare delicatamente il tubo per mescolare le perline con la soluzione di gel. Tenere il cappuccio sciolto sul tubo di centrifuga e posizionarlo in una camera a vuoto. De-gas la soluzione di gel per almeno 45 minuti nella camera a vuoto.Per polimerizzare l'idrogel, aggiungere prima 75 microlitri di persolfato di ammonio al 10%, quindi aggiungere otto microlitri di TEMED alla soluzione di idrogel. Posizionare 24 microlitri della soluzione di idrogel al centro della piastra di Petri. Premere sull'idrogel con un coperchio di 18 millimetri scivolare per appiattire l'idrogel e fare un'altezza di circa 100 micrometri.Attendere almeno 30-40 minuti per la polimerizzazione del gel. Immergere l'idrogel polimerizzato in acqua ultra pura per prevenire la disidratazione del gel. Coprire la piastra di Petri con un foglio di alluminio per evitare il fotolicenza delle perline fluorescenti e conservare a quattro gradi Celsius.In primo luogo, mescolare la base in silicone PDMS con l'agente polimerizzante in silicone con un rapporto di 20 a uno in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Invertire il tubo capovolto e agitare vigorosamente più volte per garantire una corretta miscelazione della soluzione PDMS. Rimuovere le bolle nella soluzione PDMS centrifugando per un minuto a 190 volte G.Versare da cinque a sei millilitri della soluzione PDMS al centro di una piastra di Petri da 100 millimetri e agitare la piastra fino a quando la soluzione PDMS copre l'intera superficie della piastra di Petri.Curare la soluzione PDMS durante la notte a 50-60 gradi Celsius. Quindi, rimuovere uno stencil PDMS circolare di 16 millimetri di diametro con un perforatore. Utilizzare un punzone di biopsia di 1,25 millimetri di diametro per creare piccoli fori nello stencil PDMS.Sterilizzare gli stencil PDMS immergendoli in etanolo al 70% per due o tre minuti, aspirando l'etanolo in eccesso e quindi posizionandoli sotto una luce UV per cinque minuti. Aspirare qualsiasi liquido in eccesso e rimuovere lo scivolo di copertura dall'idrogel. Posizionare lo stencil PDMS sulla superficie dell'idrogel e utilizzare le pinzette per applicare una leggera pressione allo stencil PDMS per garantire una tenuta a tenuta d'acqua tra lo stencil PDMS e la superficie dell'idrogel.Coprire la superficie dell'idrogel con Sulfo-SAMPA sciolto in soluzione tampone HEPES molare 0.1 ad una concentrazione da uno a 1.000 e posizionare l'idrogel sotto una lampada UV con una potenza di 36 watt per otto minuti. Aspirare l'eccesso di soluzione Sulfo-SAMPA e HEPES e sciacquare l'idrogel due volte con HEPES molare 0.1 seguito da altri due risciacqui con acqua ultra pura. Aspirare l'acqua ultra pura in eccesso e utilizzare una pipetta da 200 microlitri per rivestire l'idrogel con 0,1 milligrammi per millilitro di Collagene-1.Coprire il piatto per proteggere le perline fluorescenti dal fotolicenza e conservare l'idrogel a quattro gradi Celsius durante la notte. Ora, aggiungere tre millilitri di 1X Tripina nel pallone e posizionarlo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per tre o cinque minuti per staccare le cellule dal pallone di coltura tissutale. Dopo la tripsidenza, aggiungere tre millilitri di mezzi di coltura cellulare nel pallone, ruotare per mescolare e trasferire la miscela in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.Centrifugare la soluzione cellulare per tre minuti a 1.710 volte G.Aspirare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in mezzo a una concentrazione di 50 volte 10 alle quattro cellule per millilitro. Eserti il piatto di idrogel dal frigorifero. Rimuovere il Collagene-1 dall'idrogel e risciacquare una volta con PBS.Aggiungere 75 per 10 alle terze cellule nella parte superiore dello stencil PDMS e consentire alle cellule di attaccarsi alla superficie dell'idrogel per almeno un'ora nell'incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Rimuovere lo stencil PDMS e immergere lo stencil PDMS in 10X Trypsin per 10-15 secondi per rimuovere eventuali celle collegate. Aggiungere almeno due millilitri di supporto alla piastra di Petri e sterilizzare lo stencil spruzzando con il 70% di etanolo, quindi posizionandolo sotto la luce UV per cinque minuti.Posizionare la piastra di Petri nell'incubatrice per almeno 36 ore o fino a quando non si osserva un monostrato confluente. Immagini di contrasto di fase di 30 minuti prima del trattamento concalcono e due ore dopo il confronto del trattamento con il calcone. Gli spostamenti di perline indotti dalle cellule sono stati osservati diminuire sia in condizioni di calcone a bassa dose che di calcone ad alta dose rispetto ai monostrati HUVEC di controllo.Prima del trattamento con chalcone, le trazione RMS erano circa 51 Pascal per tutte le condizioni. Dopo il trattamento con calcone, c'è stato un piccolo aumento delle trazioni RMS a 59 Pascal nei monostrati trattati con calcone a basse dosi e una diminuzione quasi doppia delle trazioni RMS a 18 Pascal in monostrati trattati con calcone ad alta dose rispetto al controllo. Il trattamento con Chalcone ha aumentato la magnitudine media normale dello stress intercellulare con bassa dose, ma ha diminuito significativamente la magnitudine media normale dello stress intercellulare con dose elevata rispetto al controllo.Il trattamento concalcono ha anche diminuito le sollecitazioni intercellulari massime a bassa e alta concentrazione di calcone rispetto al controllo. L'impatto del trattamento con calcone è statisticamente significativo sulla base sia dei test T che del test ANOVA a fattore singolo. Durante il posizionamento dello stencil PDMS sopra il gel, assicurarsi che il gel sia abbastanza asciutto da garantire una tenuta a tenuta d'acqua tra lo stencil PDMS e il gel.Questo protocollo può anche essere applicato per sondare il contributo biomeccanico di una varietà di giunzioni cellulari, proteine citoscheletriche, molecole di adesione a matrice cellulare o molecole extracellulari con imaging vivo. Con questo protocollo in vitro, i ricercatori possono ora indagare con successo una serie di proprietà biomeccaniche, così come biochimiche durante la riparazione dei tessuti, la guarigione delle ferite o metastasi tumorali senza modello animale. Consigliamo ai nostri spettatori di stare molto attenti durante la gestione del calcone e del DMSO poiché l'inalazione di questi farmaci è segnalata come dannosa.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Ricostituzione dei nucleosomi con differenzialmente marcati con isotopi sorelle istoni

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Ricerca

Biochimica

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Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

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