Name: perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00
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この研究は、セントラルフロリダ大学のスタートアップファンドと国立心臓、肺、および国立衛生研究所の賞K25HL132098の下で血液研究所によってサポートされました。

1. ポリアクリルアミド(PA)ゲルの製造
<ol><li>
ペトリ皿の調製
	<ol>
<li>200 mLの超純水を80μL酢酸と50μLの3-(トリメトキシシル)プロピルメタクリレートと混合して結合シラン溶液を調製する。バインドシランは、ヒドロゲル取り付け用のガラス底ペトリ皿表面を機能させるために使用される溶液である。</li>
		<li>少なくとも1時間攪拌プレート上のバインドシラン溶液をかき混ぜます?...

<ol>
	<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Colin-York, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+(STFM).">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+stress+reconstitution+from+traction+force+data.">Intercellular stress reconstitution from traction force data.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).</li><li>Islam, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear,+intercellular+stress,+and+endothelial+cell+alignment.">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+forces:+a+useful+parameter+in+cancer+research.">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li><li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues.">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li><li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation.">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces.">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li><li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption.">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).</li><li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function.">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li><li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions.">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li><li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family.">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li><li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall.">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li><li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+phosphorylation+in+brain,+cardiac,+endothelial+and+epithelial+tissues.">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li><li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice.">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li><li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis.">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',5'-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation.">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li><li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+cytotoxicity+of+2,5-dihydroxychalcones+and+related+compounds.">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li></ol>

我々のグループは、他のグループと同様に、TFMおよびMSMを使用して、インビトロ7、15、18、27における様々な病理学的および生理学的細胞プロセスにおける細胞接合部の影響を調べている。.例えば、Hardinらは、細胞間ストレス伝達が内皮細胞における準細胞間ギャップ形成を示唆する非常に洞察?...

細胞および組織の生理学および病理学に対する物理的な力および機械的特性の影響の研究を指す分野は、メカノバイオロジー1として知られている。メカノバイオロジーで利用されているいくつかの有用な技術は、単層ストレス顕微鏡と牽引力顕微鏡です。トラクション力顕微鏡は、細胞基板界面で生成されたトラクションの計算を可能にする一方、単層応力顕微鏡は、単層2内の隣接する細胞間で発生する細胞間ストレスの計算を可能にする。 ,3,4,5,6.以前の方法から得られた結果は、細胞由来の機械的ストレスが細胞プロセス3、4、5のホストの運命を決定する上で重要な役割を果たしていることを示唆している。例えば、外部の機械的力にさらされると、集団として移動する細胞のグループは、その形態を変更し、その形状を偏光させ、加えた力の方向に沿って整列し、移動することができ、部分的には、牽引を発生させる7、 8.トラクションは、細胞収縮性を評価するために使用できるメトリックを提供し、牽引力顕微鏡(TFM)を使用して計算されます。トラクション力顕微鏡(TFM)は、細胞誘発基板変形の決定から始まり、数学的に厳格な力学ベースの計算アプローチを用いて牽引場の計算を行います。トラクションを計算する能力はかなり長い間あるので、研究者はTFMを利用して、がん9、創傷治癒10、工学的心臓の評価を含む多くのプロセスに対するトラクションの影響を明らかにしました。ティッシュ11.
TFMとMSMの実装は、次の順序で実行する必要がある3つの重要なステップに分けることができます:最初に、細胞によって生成されるヒドロゲル変形が決定されます。第二に、トラクションはヒドロゲル変形から回収されます。第三に、有限要素アプローチは、単層全体の中で正常およびせん断間のストレスを計算するために使用されます。ゲル変位を計算するために、細胞を用いた蛍光ビーズ画像を、カスタム書き込み粒子画像ベロシメトリー(PIV)ルーチンを用いて参照ビーズ画像(細胞なし)と比較した。PIV解析の交差相関ウィンドウサイズとオーバーラップは、それぞれ32 x 32ピクセルと0.5ピクセルに選択されました。このとき、ピクセルシフトを、ピクセルからミクロンへの変換係数を乗算してミクロンに変換し(顕微鏡の場合、この変換係数は0.65)、平面内変位を得た。平面外の変位を無視に関連するエラーは、ごくわずか12,13です。ゲル変位の計算後、利用できるトラクション測定には、拘束されたトラクションと非拘束トラクション8、14の2種類があります。拘束されていないトラクションは、視野全体(セルの有無にかかわらず)のトラクションフィールドを提供し、拘束された牽引はセル14を含む領域に対してのみ牽引フィールドを提供します。次に、細胞間ストレスは、牽引力顕微鏡の延長である単層応力顕微鏡(MSM)を用いて計算される。MSMの実装は、ニュートンの法則7で要求されているように、細胞界面で細胞間で伝達される機械的力によって、細胞の単層によって発揮される局所的な牽引力のバランスをとらなければならないという仮定に基づいている7 、12、13.ここでの重要な仮定は、単層における牽引分布が知られており、力のバランスが細胞材料特性に依存しないため、セル単層を薄い弾性シートとして扱うことができるということです。もう一つの重要な仮定は、牽引力が光学視野内(単層内)内の局所細胞間応力によってバランスされ、この力バランスの影響は遠位領域(単層の外側)13において最小限である。したがって、細胞間応力、変位、または単層境界における両方の組み合わせによって定義される境界条件は、MSM13を実行するために重要である。上記の情報を考慮して、MSMを使用して有限要素解析(FEM)を実行し、最大主応力(σmax)と最小主応力(σ分力)を回復し、単層。これらの主応力は、その後、2D平均法線間間応力[(σmax + σmin)/2]および2D最大せん断間応力[(σmax - σmin)/2]を単層全体で計算するために使用されます。12、13.この手順については、Tambe et al.12,13 によって詳細に説明されています。
単層ストレス顕微鏡(MSM)は、単層6、7、8、12、13内で生成される細胞細胞間ストレスの計算を可能にする。これらの細胞間ストレスは、組織の成長および修復、創傷治癒、および癌転移12、15、16、17にとって重要であることが示唆されている。また、細胞間ストレスは、内皮細胞移動および内皮バリア機能17,18においても重要であることが示唆されている。タイトジャンクションや接着接合部などの細胞間接合部は、細胞間ストレスの生成と伝達において重要な役割を果たすることが示唆されているが、ギャップ接合部の役割は依然として不明である。ギャップ接合部は、隣接する細胞を物理的に接続し、隣接する細胞19、20、21の間を通過する電流および分子(<1 KDa)の経路を提供する。内皮細胞はCx37、Cx40、およびCx43ギャップ接合部19、22、Cx43を発現するが、間違いなく疾患進行23の点で最も重要である。Cx43の重要性の証拠は、マウスにおけるCx43の遺伝的欠失が低血圧24を生じ、血管新生25に悪影響を及ぼすという事実で見出されうる。さらに、Cx43は、細胞の移動および増殖およびアテローム性動脈硬化症の進行において重要であることが文書化されている18、22、23、24、25.
このプロトコルでは、TFMとMSMを用いて、コンフルエント内のトラクションおよび細胞間ストレス発生が、内皮単層が内皮ギャップ接合部Cx43の破壊によって影響を受けるかどうかを調べた。我々は、2,5−ジヒドロキシカルゾン(カルコーン)でCx43を破壊し、Cx43発現26を阻害する分子である。カルコーンは、Cx43式26を破壊するために以前にLeeらによって報告されているように、siRNAの代わりにCx43を破壊するために使用された。また、様々な血管の予防と治療に使用できる抗炎症および抗血小板化合物であることが報告されているため、カルコンが内皮に与える影響に特に関心を持っていました。病理26.カルコーン処理は実験開始の1時間後に行い、カルコーン処理単層を合計6時間画像化し、画像処理をカスタム書き込みMATLABコードで行い、トラクションを決定し、その後細胞間を決定した。応力。我々の結果は、トラクションと細胞間ストレスの全体的な減少を示し、Cx43が内皮バイオメカニクスにおいて重要な役割を果たすことを示唆した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td>Essential to flatten polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bis-acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610143</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8242;,5&#8242;-Dihydroxychalcone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>IDF00046</td>
			<td>To disrupt Cx43 structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2530-85-0</td>
			<td>Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Essential to make bind saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog # A-11001</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610700</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>To make blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005-100ML</td>
			<td>Use as a extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td>Buffer Saline needed for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>To dissolve chalcone and make stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8812</td>
			<td>0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Essential to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LVES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1460801</td>
			<td>Essential HUEVC media 200 supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M200500</td>
			<td>Essential media for HUVEC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog #13-8300</td>
			<td>Primary antibody for Cx43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm dia)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-20-1.5H</td>
			<td>35 mm petri dish with a 20 mm center well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td>102568-43-4</td>
			<td>Essential to functionalize polyacrylamide gel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW corning</td>
			<td>2646340</td>
			<td>Silicon elastomer with curing agent to make PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610801</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>To permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Used to detach cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption

内皮細胞は細胞間ストレスやトラクションを生成するために確立されているが、内皮細胞間ストレスおよびトラクション生成におけるギャップ接合が果たす役割は現在知られていない。そこで、我々は、公知のCx43阻害剤2,5−ジヒドロキシカルボン(カルコン)にコンフルエント内皮単層を露出することにより、ギャップ接合コネクシン43(Cx43)が内皮バイオメカニクスに及ぼす影響を調べるための力学ベースのプロトコルを提示する。この阻害剤がトラクションおよび細胞間ストレスに与える影響を測定する。我々は、対照と比較した場合、高いカルコーン投与量(2 μg/mL)の下でトラクションと細胞間ストレスの両方の減少を示す代表的な結果を提示する。このプロトコルは、Cx43だけでなく、適切な阻害剤が使用されると仮定して、他のギャップジャンクションにも適用できます。このプロトコルは、心臓血管およびメカノバイオロジー研究の分野で有用であると考えています。

対照の相コントラスト画像は、0.2 μg/mL、および2μg/mLカルコーン処理単層を、カルコーン処理の30分前(図1A-C)およびカルコーン処理後2時間後に撮影した(図1D-F)。細胞誘導ビーズ変位(μm)は、HUVEC単層を対照した場合に低用量カルコーンおよび高用量カルコーン条件の両方で減少することが観察された...

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Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

ここでは、ギャップ接合コネクシン43を破壊する力学ベースのプロトコルを提示し、トラクションと細胞間応力の観察を通じて内皮バイオメカニクスに及ぼすその後の影響を測定する。

コネクシン43構造破壊による内皮バイオメカニクスの摂動

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

このプロトコルは、例えば創傷治癒や癌転移などの多くの生理学的および病理学的プロセスにおいて細胞力が果たす役割の解明を可能にするので重要である。この力学ベースの技術の主な利点は、同時に細胞と細胞の接合を中断し、細胞生成力、主に牽引力と細胞間ストレッサーへの影響を測定する能力です。私たちのプロトコルは、例えば癌転移、アテローム性動脈硬化症、高血圧などの広範な病態生理学的プロセスに適用可能である。当社の方法は、臓器オンチップモデル、バイオエンジニアリング組織構築物、インビトロドラッグデリバリーシステム、および組織共培養システムを使用して、生化学的およびバイオメカニカル分析を実行するために統合することができます。私たちのプロトコルは、実行するかなり簡単です。しかし、私たちは、このプロトコルを初めて行う人は忍耐を持ち、このプロトコルのステップを急いでいないことをお勧めします。私たちのプロトコルには、初めてのユーザーには明らかではないユニークなステップがあります。したがって、ユーザーは、私たちの書面によるステップバイステップの手順に従い、目視デモンストレーションをガイダンスとして使用することをお勧めします。まず、200ミリリットルの超純水と80マイクロリットルの酢酸と50マイクロリットルのシランメタクリレートを混合して、ブラインドシラン溶液を調製します。ビンスシラン溶液を攪拌プレートで少なくとも1時間撹拌します。ペトリ皿の中央をよく、バインドシラン溶液で45分間処理します。バインドシラン溶液を取り除き、ペトリ皿を超純水で2~3回洗い流します。ペトリ皿表面を乾かして、将来の使用のために室温で保管してください。ヒドロゲル溶液を調製するには、12.49ミリリットルの超純水を2.062ミリリットルの40%アクリルアミド、375マイクロリットルの2%ビサクリアミドを15ミリリットルの遠心チューブに混ぜます。80マイクロリットルの蛍光ビーズをヒドロゲル溶液に加えます。チューブを軽く振って、ビーズとゲル溶液を混ぜます。キャップを遠心管に緩めておき、真空チャンバーに入れます。ゲル溶液を真空チャンバ内で少なくとも45分間脱ガスする。ヒドロゲルを重合するには、まず10%の過硫酸アンモニウムの75マイクロリットルを加え、次に8マイクロリットルのTEMEDをヒドロゲル溶液に加えます。ペトリ皿の中央にヒドロゲル溶液の24マイクロリットルを置きます。18ミリメートルのカバースリップでヒドロゲルを押してヒドロゲルを平らにし、約100マイクロメートルの高さを作ります。ゲル重合のために少なくとも30〜40分待ちます。ゲル脱水を防止するために、超純水に重合ヒドロゲルを沈下します。ペトリ皿にアルミホイルを覆い、蛍光ビーズの光の吹き出しを防ぎ、摂氏4度で保存します。まず、50ミリリットルの遠心管に20対1の比率で、PDMSシリコーンベースをシリコーン硬化剤と混合します。チューブを逆さまに反転し、PDMS溶液の適切な混合を確実にするために何度も激しく振ります。PDMS溶液中の気泡を190回G.Pourで1分間1分間遠心して取り除き、PDMS溶液を100ミリメートルペトリ皿の中央に5~6ミリリットル流し、PDMS溶液がペトリ皿表面全体を覆うまで攪拌します。PDMS溶液を摂氏50~60度で一晩硬化させます。次に、穴パンチャー付きの直径16ミリメートルの円形PDMSステンシルを取り外します。PDMS ステンシルに小さな穴を作成するには、直径 1.25 ミリメートルの生検パンチを使用します。PDMSステンシルを70%エタノールに2〜3分間浸し、余分なエタノールを吸い取り、5分間UV光の下に置いて殺菌します。余分な液体を吸引し、ヒドロゲルからカバースリップを取り除きます。PDMS ステンシルをハイドロゲル表面に配置し、ピンセットを使用して PDMS ステンシルに光圧を適用し、PDMS ステンシルとハイドロゲル表面の間に水密シールを確保します。ハイドロゲルの表面を、1~1,000の濃度で0.1モルHEPESバッファー溶液に溶解し、8分間36ワットの電力を持つUVランプの下にヒドロゲルを置きます。余分なスルフォ-SAMPAとHEPES溶液を吸引し、ヒドロゲルを0.1モルHEPESで2回リンスし、続いて超純水でさらに2リンスを加えます。余分な超純水を吸引し、200マイクロリットルのピペットを使用して、コラーゲン-1の1ミリリットル当たり0.1ミリグラムでヒドロゲルをコーティングします。蛍光ビーズを光漂白から保護するために皿を覆い、ハイドロゲルを摂氏4度で一晩保管します。次に、フラスコに1Xトリプシンを3ミリリットル加え、37°Cのインキュベーターに3〜5分間置き、組織培養フラスコから細胞を取り外します。トリプシン化後、フラスコに3ミリリットルの細胞培養培地を加え、渦巻いて混合し、混合物を15ミリリットルの遠心分離管に移します。細胞溶液を1、710倍のG.吸上術で3分間遠心し、培地中の細胞を1ミリリットル当たり4個の細胞に50倍の濃度に再懸濁する。冷蔵庫からヒドロゲル皿を取り出します。コラーゲン-1をヒドロゲルから取り出し、PBSで1回リンスします。PDMSステンシルの上部に3番目のセルに75倍の10を加え、37°Cと5%の二酸化炭素でインキュベーターで少なくとも1時間ヒドロゲル表面に細胞を取り付けることができます。PDMS ステンシルを削除し、10X トリプシンの PDMS ステンシルを 10 ~ 15 秒間水没させ、接続されているセルを削除します。ペトリ皿に少なくとも2ミリリットルの培地を加え、70%エタノールを噴霧してステンシルを殺菌し、UV光の下に5分間置きます。ペトリ皿をインキュベーターに少なくとも36時間置くか、またはコンフルエント単層が観察されるまで置く。カルコン処理の30分前及びカルコン処理の2時間後の位相コントラスト画像を比較した。細胞誘導ビーズ変位は、コントロールHUVEC単層と比較した場合、低用量カルコンおよび高用量カルコン条件の両方で減少することが観察された。カルコン処理の前に、RMSの牽引は、すべての条件のための約51パスカルでした。カルコン処理後、低用量カルコン処理単層では59パスカルへのRMSトラクションがわずかな増加し、制御と比較して高用量カルコン処理単層では18パスカルにRMSトラクションがほぼ2倍減少した。カルコン治療は、低用量で平均正常な正常な細胞間ストレスの大きさを増加させたが、対照と比較して高用量で平均正常な細胞間ストレスの大きさを有意に減少させた。カルコン治療はまた、コントロールと比較して低および高カルコン濃度の両方で最大の完全な細胞間ストレスを減少させる。カルコン処理の影響は、T検定と単因子ANOVA試験の両方に基づいて統計的に有意です。PDMS ステンシルをゲルの上に置きながら、ゲルが十分に乾燥して PDMS ステンシルとゲルの間に水密シールが付くようにしてください。このプロトコルは、細胞-細胞接合、細胞骨格タンパク質、細胞マトリックス接着分子、または細胞外分子の生体力学的寄与を生画像化でプローブするためにも適用することができる。このin vitroプロトコルを使用すると、研究者は、動物モデルのない組織修復、創傷治癒、または癌転移中の生化学的特性だけでなく、生体機械のホストを調査することに成功しました。これらの薬物の吸入は有害であると報告されているので、我々は、我々は、カルコンとDMSOを扱っている間、非常に注意するように視聴者に助言します。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

ショットガンプロテオミクスにある深さの特徴付けのためLERLIC-MS / MSおよびグルタミンの定量化およびアスパラギン脱アミド

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

マンナン ペースを用いた植物細胞壁多糖の構造解析

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

多量ホモ測定器と無料、フリー、オープン ソースの明るさ解析ソフトウェアを使用しての体外校正無料定量化

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロ ウイルス発現ベクターを変更します。

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

小角 x 線散乱による溶液中の高分子の構造研究

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

EFAデコンボリューションとスキャッタによるSEC-SAXSデータの分析

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

酵素の結晶化と構造決定:多用途マイクロ流体チップにおける連続結晶学による基質複合体

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

時間分解型クライオ電子顕微鏡のための高速グリッド調製

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...