Name: perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00
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이 작품은 중앙 플로리다 대학 창업 기금과 국립 심장, 폐, 그리고 수상 K25HL132098에서 건강의 국립 연구소의 혈액 연구소에 의해 지원되었다.

1. 폴리아크릴아미드 (PA) 젤 만들기
<ol><li>
페트리 접시의 준비
	<ol>
<li>200 mL의 초순수와 80 μL 아세트산 및 50 μL의 3-(트리메톡시실릴) 프로필 메타크릴레이트를 혼합하여 바인드 실란 용액을 준비합니다. 바인드 시레인은 하이드로겔 부착을 위해 유리 바닥 페트리 접시 표면을 기능화하는 데 사용되는 용액이다.</li>
		<li>바인드 시란 용액을 교반판에 적어도 1시간 동안 저어줍니다.</l...

<ol>
	<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li><li>Style, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear,+intercellular+stress,+and+endothelial+cell+alignment.">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+forces:+a+useful+parameter+in+cancer+research.">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li><li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues.">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li><li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation.">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces.">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li><li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption.">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).</li><li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function.">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li><li>Nielsen, M. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis.">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',5'-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation.">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li><li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+cytotoxicity+of+2,5-dihydroxychalcones+and+related+compounds.">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li></ol>

우리 그룹뿐만 아니라 다른 사람뿐만 아니라,성공적으로시험관 7,15,18,27에서 다양한 병리학 및 생리 적 세포 과정에서 세포 접합의 영향을 조사하기 위해 TFM과MSM을사용하고있다 . 예를 들어, Hardin 등은 세포간 스트레스 전달가이드 내피 세포에서의 파라셀룰러 갭 형성을 시사하는 매우 통찰력 있는 ?...

물리적 인 힘의 효과및 세포 및 조직 생리학 및 병리학에 대한 기계적 특성의 연구를 참조하는 분야는 기계생물학1로알려져 있다. 메카노생물학에서 활용된 몇 가지 유용한 기술은 단층 스트레스 현미경 검사법 및 견인력 현미경입니다. 견인력 현미경법은 세포 기판 인터페이스에서 생성된 견인력을 계산할 수 있게 해주며, 단층 응력 현미경은 단일층 내의 인접 세포 간에 생성된 세포간 응력의 계산을 허용합니다2 ,3,4,5,6. 이전 방법에서 산출된 결과는 세포 유래 기계적 응력이 세포 프로세스의 호스트의 운명을 결정하는 중요한 역할을 한다는 것을건의했습니다 3,4,5. 예를 들어, 외부 기계적 힘에 노출되면 집단으로 이동하는 셀 그룹이 형태를 변경하고 모양을 편광하여 적용된 힘의 방향을 따라 정렬하고 이동하여 부분적으로견인7을 생성할 수 있습니다. 8. 견인은 세포 수축성을 평가하는 데 사용할 수 있는 메트릭을 제공하며 견인력 현미경 검사법(TFM)을 사용하여 계산됩니다. 견인력 현미경 검사법(TFM)은 세포 유도 기질 변형의 결정으로 시작하여 수학적으로 엄격한 역학 기반 계산 접근법을 사용하여 견인장을 계산합니다. 견인력을 계산하는 능력이 꽤 오랜 시간 동안 주변에 있기 때문에, 연구원은 TFM을 활용하여 암9,상처 치유10 및 엔지니어링 심장 평가를 포함한 다양한 프로세스에 대한 견인력이 미치는 영향을 밝혔습니다. 조직11.
TFM 및 MSM의 구현은 다음과 같은 순서로 실행되어야하는 세 가지 필수 단계로 나눌 수 있습니다 : 첫째, 세포에 의해 생성 된 하이드로 겔 변형이 결정됩니다; 둘째, 견인은 하이드로 겔 변형에서 회수됩니다. 셋째, 유한 요소 접근법은 전체 단층 내에서 정상 및 전단 세포 간 응력을 계산하는 데 사용됩니다. 겔 변위를 계산하기 위해, 세포와 형광 비드 이미지를 맞춤형 입자 이미지 속도계(PIV) 루틴을 사용하여 참조 비드 이미지(셀 제외)와 비교하였다. PIV 분석을 위한 상호 상관 윈도우 크기와 겹치는 것은 각각 32 x 32 픽셀 및 0.5로 선택되었다. 이때, 픽셀 시프트는 평면 변위를 얻기 위해 픽셀 대 미크론 변환 인자(우리의 현미경의 경우, 이 변환 인자는 0.65)와 곱하여 미크론으로 변환되었다. 평면 외 변위를 무시하는 것과 관련된 오류는 무시할 수있는 12,13입니다. 겔 변위를 계산한 후, 활용될 수 있는 두 가지 유형의 견인 측정, 제한된 견인력 및 구속되지 않은 견인력8,14가있다. 구속되지 않은 트랙션은 전체 시야(셀이 있는 영역 및 셀이 없는 영역 포함)에 대한 트랙션 필드를 제공하며, 제한된 트랙션은 셀14를포함하는 영역에 대해서만 트랙션 필드를 제공합니다. 그런 다음, 세포간 응력은 견인력 현미경 검사법의 연장인 단층 응력 현미경 검사법(MSM)을 사용하여 계산됩니다. MSM의 구현은 셀 기판 인터페이스에서 세포의 단층이 가하는 국부적 견인력이 뉴턴의 법칙 7에서 요구하는 대로 셀-셀 인터페이스에서 세포 간에 전달되는 기계적 힘에 의해 균형을 이루어야 한다는 가정을 기반으로 합니다7. ,12,13. 여기서 중요한 가정은 단층내의 견인 분포가 알려져 있고 힘 균형이 셀 재료 특성에 의존하지 않기 때문에 셀 단층이 얇은 탄성 시트로 처리 될 수 있다는 것입니다. 또 다른 주요 가정은 견인력이 광학 시야 내의 국소 세포 간 응력(단층 내)에 의해 균형을 이루고 이러한 힘 균형의 영향은 원위 영역(단층 외부)에서 최소화된다는것입니다 13. 따라서 단층 경계에서 세포간 응력, 변위 또는 둘 다의 조합으로 정의된 경계 조건은 MSM13을수행하는 데 매우 중요합니다. 위의 정보를 고려하여 MSM을 사용하여 유한 요소 분석(FEM)을 수행하여 최대 주 응력(σmax)및 최소 주 응력(σmin)을복구하여 단층. 이러한 주 응력은 이후에 전체 단층 내에서 2D 평균 정상 세포간 응력 [(σmax + σmin)/2] 및 2D 최대 전단 간 응력 [(σmax - σmin)/2]를 계산하는 데 사용됩니다. 12,13. 이 절차는 Tambe 등12,13에 의해 더 자세히 설명되어 있습니다.
단층 응력 현미경 검사법 (MSM)은 단층6,7,8,12,13내에서 생성된 세포 간 응력의 계산을 허용합니다. 이러한 세포간 스트레스는 조직 성장 및 수리, 상처 치유 및 암 전이12,15,16,17에중요한 것으로 제안되었다. 또한, 세포간 스트레스는 내피 세포 이동 및 내피 장벽 기능17,18에서도중요할 것으로 제안되었다. 단단한 접합부 및 접착접선 접합부와 같은 세포 세포 접합부는 둘 다 내피 세포 간 응력 생성 및 전송에 있는 중요한 역할을 하기 위하여 건의되는 동안, 간격 접합의 역할은 애매하게 남아 있습니다. 갭 접합부는 인접 한 세포를 물리적으로 연결하고 인접 세포19,20,21사이를 통과하는 전류 및 분자 (&1 KDa)에 대한 경로를 제공합니다. 내피 세포는 Cx37, Cx40 및 Cx43 갭 접합부19,22,Cx43을 발현하지만, Cx43은 틀림없이 질병 진행성23의측면에서 가장 중요하다. Cx43의 중요성의 증거는 마우스에서 Cx43의 유전 적 결실이 저혈압24의 결과이며 혈관 신생25에부작용이 있다는 사실에서 발견 될 수 있습니다. 또한, Cx43은 세포 이동 및 증식및 죽상동맥경화증의 진행에 중요한 것으로 문서화되어있다 18,22,23,24,25 .
이 프로토콜에서, 우리는 TFM 및 MSM을 사용하여 내피, 내피 단층 내의 견인 및 세포 간 스트레스 생성이 내피 갭 접합 Cx43의 붕괴에 의해 영향을 받을 지 여부를 조사했습니다. 우리는 Cx43 발현26을억제하기 위해 문서화된 분자인 2,5-디하이드록시찰콘(chalcone)으로 Cx43을 중단시켰습니다. Chalcone은 Cx43 발현26을중단시키기 위해 이전에 리 외에 의해 보고된 바와 같이 siRNA 대신 Cx43을 중단시키는 데 사용되었다. 또한, 우리는 또한 잠재적으로 다양한 혈관의 예방 및 치료에 사용될 수있는 항 염증 및 항 혈소판 화합물로보고되었기 때문에 내피에 대한 chalcone의 영향에 특히 관심이 있었다 병리학26. Chalcone 처리는 실험 개시 후에 1 시간, chalcone 처리한 단층은 총 6 시간 동안 심상하고, 심상 처리는 견인을 결정하기 위하여 주문을 쓰여진 MATLAB 부호로 수행되고 그 후에 세포 간 스트레스. 우리의 결과는 Cx43이 내피 생체 역학에 있는 중요한 역할을 한다는 것을 건의하는 견인및 세포간 응력에 있는 전반적인 감소를 보여주었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td>Essential to flatten polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bis-acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610143</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8242;,5&#8242;-Dihydroxychalcone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>IDF00046</td>
			<td>To disrupt Cx43 structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2530-85-0</td>
			<td>Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Essential to make bind saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog # A-11001</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610700</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>To make blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005-100ML</td>
			<td>Use as a extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td>Buffer Saline needed for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>To dissolve chalcone and make stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8812</td>
			<td>0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Essential to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LVES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1460801</td>
			<td>Essential HUEVC media 200 supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M200500</td>
			<td>Essential media for HUVEC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog #13-8300</td>
			<td>Primary antibody for Cx43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm dia)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-20-1.5H</td>
			<td>35 mm petri dish with a 20 mm center well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td>102568-43-4</td>
			<td>Essential to functionalize polyacrylamide gel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW corning</td>
			<td>2646340</td>
			<td>Silicon elastomer with curing agent to make PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610801</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>To permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Used to detach cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption

내피 세포는 세포 간 응력과 견인력을 생성하기 위해 설립되었지만, 내피 간 스트레스와 견인 생성에서 역할 갭 접합이 작용한다는 것은 현재 알려져 없습니다. 따라서, 우리는 여기에 갭 접합 코넥신 (Cx43)의 영향을 조사하는 역학 기반 프로토콜을 제시 (Cx43) 알려진 Cx43 억제제 2,5 디하이드록시 찰콘 (chalcone)에 동천 내피 단층을 노출시킴으로써 내피 생체 역학에 있다 이 억제제가 견인력과 세포간 응력에 미치는 영향을 측정합니다. 우리는 대조군과 비교할 때 높은 chalcone 복용량 (2 μg/mL)에서 견인력과 세포 간 응력 모두의 감소를 보여주는 대표적인 결과를 제시합니다. 이 프로토콜은 적절한 억제제가 사용된다는 가정하에 Cx43뿐만 아니라 다른 갭 접합에도 적용될 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜이 심혈관 및 메카생물학 연구 분야에서 유용할 것이라고 믿습니다.

대조군 이미지, 0.2 μg/mL, 및 2 μg/mL 단층 처리된 단층은 찰콘 처리 30분 전에 촬영하였다(그림1A-C)및 2시간 후 의 찰콘 처리(도1D-F). 세포-유도 비드 변위(μm)는 HUVEC 단층 대조층 대조층 대조군과 비교했을 때 저용량 chalcone 및 고용량chalcone 조건 모두에서 감소하는 것으?...

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Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

여기에서, 우리는 간격 접합 connexin 43를 중단하고 견인및 세포간 응력의 관측을 통해 내피 생체 역학에 있는 후속 충격을 측정하기 위하여 역학 기지를 둔 프로토콜을 제시합니다.

코넥신 43 구조적 파괴를 통한 내피 생체역학 의 교란

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

이 프로토콜은 예를 들어 상처 치유 및 암 전이와 같은 많은 생리적 및 병리학 적 과정에서 세포 힘이 하는 역할의 용해를 허용하기 때문에 중요합니다. 이 역학 기반 기술의 주요 장점은 세포-세포 접합을 동시에 방해하고 세포 생성 기계력, 주로 견인 및 세포 간 스트레스에 미치는 영향을 측정하는 능력입니다. 우리의 프로토콜은 암 전이, 동맥 경화증 및 고혈압과 같은 광범위한 병리학 적 과정에 적용됩니다.당사의 방법은 장기 온칩 모델, 바이오 엔지니어링 조직 구조, 체외 약물 전달 시스템 및 조직 공동 배양 시스템과 함께 생화학 및 생화학 및 생화학 적 분석을 모두 수행하도록 통합될 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 매우 간단합니다. 그러나 이 프로토콜을 수행하는 사람들은 처음으로 인내심을 가지고 이 프로토콜의 단계를 서두르지 말 것을 권고합니다.우리의 프로토콜에는 처음 사용자에게 명확하지 않을 수 있는 고유한 단계가 있습니다. 따라서 사용자가 작성된 단계별 절차를 따르고 시각적 데모를 지침으로 사용하는 것이 좋습니다. 우선, 아세트산 80마이크로리터와 50 마이크로리터의 아세트산과 50마이크로리터의 초순수수 200밀리리터를 혼합하여 블라인드 실레인 용액을 준비하십시오.슬바인드-시레인 용액을 교반판에 넣고 1시간 이상 저어줍니다. 페트리 요리의 중앙 우물을 바인드 실레인 용액으로 45분간 처리합니다. 바인드 시레인 용액을 제거하고 페트리 접시를 초순수물로 2~3회 헹구세요.페트리 접시 표면을 건조하고 나중에 사용하기 위해 실온에서 보관하십시오. 하이드로겔 용액을 준비하려면 12밀리리터의 초순수수 12.49밀리리터를 2.062밀리리터에 40%의 아크릴아미드와 375마이크로리터의 2%의 비사크라이미드를 15밀리리터 원심분리기 튜브에 섞는다. 하이드로겔 용액에 80마이크로리터의 형광 구슬을 추가합니다.튜브를 부드럽게 흔들어 구슬과 젤 용액을 섞습니다. 원심분리기 튜브에 캡을 느슨하게 유지하고 진공 챔버에 놓습니다. 진공 챔버에서 적어도 45 분 동안 젤 용액을 탈가스.하이드로겔을 중합하려면 먼저 10%의 아황산염 75마이크로리터를 추가한 다음 하이드로겔 용액에 8마이크로리터를 추가합니다. 페트리 접시의 중앙에 하이드로겔 용액24마이크로리터를 배치합니다. 하이드로겔을 18mm 커버 슬립으로 하이드로겔에 눌러 하이드로겔을 평평하게 하고 약 100 마이크로미터의 높이를 만듭니다.젤 중합을 위해 적어도 30 ~ 40 분 기다립니다. 젤 탈수를 방지하기 위해 초순수 수에 중합 된 하이드로겔을 담급하십시오. 페트리 접시를 알루미늄 호일로 덮어 형광 구슬의 표백을 방지하고 섭씨 4도에 보관하십시오.먼저, 50밀리리터 원심분리기 튜브에서 20 대 1의 비율로 PDMS 실리콘 베이스를 실리콘 경화제와 혼합한다. 튜브를 거꾸로 뒤집어 놓고 여러 번 격렬하게 흔들어 PDMS 용액을 적절히 혼합하십시오. 100mm 페트리 접시의 중심에 PDMS 용액의 5~6밀리리터를 190배 G.Pour에서 1분 동안 원심분리하여 PDMS 용액의 거품을 제거하고 PDMS 솔루션이 전체 페트리 접시 표면을 덮을 때까지 접시를 교반합니다.PDMS 용액을 섭씨 50~60도에서 하룻밤 사이에 치료합니다. 다음으로, 구멍 펀처와 원형 16밀리미터 직경 PDMS 스텐실을 제거합니다. 1.25 밀리미터 직경의 생검 펀치를 사용하여 PDMS 스텐실에 작은 구멍을 만듭니다.PDMS 스텐실을 70%에 탄올로 2~3분 동안 잠급하여 멸균하고, 과도한 에탄올을 흡수한 다음 5분 동안 UV 조명 아래에 놓습니다. 여분의 액체를 흡인시키고 하이드로겔에서 덮개 슬립을 제거합니다. PDMS 스텐실을 하이드로겔 표면에 놓고 핀셋을 사용하여 PDMS 스텐실과 하이드로겔 표면 사이의 수분 밀폐 씰을 보장하기 위해 PDMS 스텐실에 가벼운 압력을 가합니다.하이드로겔 표면을 0.1 의 어금니 HEPES 버퍼 용액으로 1-000의 농도로 용해시키고 8분 동안 36와트의 힘으로 하이드로겔을 UV 램프 아래에 놓습니다. 과도한 설포-삼파파 및 HEPES 용액을 흡습하고 0.1 개의 어금니 HEPES로 하이드로겔을 두 번 헹구고 초순수수로 2개의 헹구를 추가로 넣습니다. 과도한 초순수수를 흡인하고 200마이크로리터 파이펫을 사용하여 콜라겐-1밀리리터당 0.1밀리그램의 하이드로겔을 코팅합니다.식기를 덮어 형광구를 광표백으로부터 보호하고 하이드로겔을 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하십시오. 지금, 플라스크에 1X 트립신의 3 밀리리터를 추가하고 조직 배양 플라스크에서 세포를 분리하기 위해 3 ~ 5 분 동안 37섭씨37도에서 인큐베이터에 배치합니다. 트립시니화 후, 플라스크에 세포 배양 매체의 3 밀리리터를 추가하고, 혼합을 소용돌이시키고, 혼합물을 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮춥니다.원심분리기 세포 용액은 1, 710회 G.에서 3분 동안 슈퍼나탈을 흡인시키고 밀리리터당 4개의 세포에 50배 10의 농도로 매체의 세포를 다시 중단한다. 냉장고에서 하이드로겔 요리를 꺼내라. 하이드로겔에서 콜라겐-1을 제거하고 PBS로 한 번 헹구는 다.PDMS 스텐실의 상단에 세 번째 세포에 75 회 10을 추가하고 세포가 37 섭씨 및 5 %의 이산화탄소에서 인큐베이터에서 적어도 한 시간 동안 하이드로겔 표면에 부착 할 수 있도록합니다. PDMS 스텐실을 제거하고 부착된 셀을 제거하기 위해 10X 트립신에서 10X 트립신으로 PDMS 스텐실을 잠급합니다. 페트리 접시에 적어도 2밀리리터의 미디어를 추가하고 70%에탄올로 분무한 다음 UV 라이트 아래에 5분간 배치하여 스텐실을 소독합니다.페트리 접시를 인큐베이터에 적어도 36시간 동안 또는 컨물류 단층이 관찰될 때까지 놓습니다. 실콘 치료 30분 전과 샬콘 치료 후 2시간의 위상 대비 영상을 비교했다. 세포 유도 비드 변위는 HUVEC 단층제를 제어하는 것과 비교할 때 저용량 샬콘 및 고용량 샬콘 조건에서 모두 감소하는 것으로 관찰되었다.chalcone 치료 전에, RMS 견인 주위 했다 51 모든 조건에 대 한 파스칼. chalcone 치료 후, RMS 견인에 작은 증가 했다 59 저용량 chalcone 처리 단층에서 파스칼 과 RMS 견인에 거의 두 배 감소 18 고용량 chalcone 처리 단층에서 파스칼 대조군에 비해. Chalcone 치료는 낮은 복용량으로 평균 정상적인 정상 세포 간 스트레스 크기를 증가, 하지만 크게 제어에 비해 높은 복용량으로 평균 정상적인 정상 세포 간 스트레스 크기를 감소.또한 샬콘 치료는 대조군과 비교했을 때 저체콘 농도와 높은 체콘 농도모두에서 최대 세포 간 응력을 감소시켰습니다. chalcone 처리의 충격은 T-시험 및 단 하나 요인 ANOVA 시험 둘 다에 근거를 둔 통계적으로 유의합니다. PDMS 스텐실을 젤 위에 두는 동안, 젤이 충분히 건조하여 PDMS 스텐실과 젤 사이의 방수 씰을 보장하십시오.이 프로토콜은 또한 살아있는 화상 진찰을 가진 세포 세포 접합, 세포 셀 접합, 세포 매트릭스 접착 분자, 또는 세포 외 분자의 생체 역학 적 기여를 탐구하기 위하여 적용될 수 있습니다. 이 체외 프로토콜을 통해 연구자들은 이제 동물 모델없이 조직 수리, 상처 치유 또는 암 전이 중 생화학적 특성뿐만 아니라 생물 역학의 호스트를 성공적으로 조사 할 수 있습니다. 우리는 이러한 약물의 흡입이 유해한 것으로보고로 chalcone 및 DMSO를 처리하는 동안 매우 조심하도록 우리의 시청자를 조언한다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

연구

생화학

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

산탄 프로테오믹스 자세하게 특성화 LERLIC-MS / MS 및 글루타민 정량 아스파라긴 탈 아미드

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

속도 사용 하 여 식물에 Mannan 세포 벽 다 당 류 구조 특성

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

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생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

작은 각 엑스레이 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 고분자의 구조 연구

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

EFA 감소 및 분산을 통한 SEC-SAXS 데이터 분석

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

다목적 미세 유체 칩의 직렬 결정학에 의한 효소의 결정화 및 구조적 결정: 기질 복합체

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

시간 해결 된 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 빠른 그리드 준비

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...