Name: perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av University of Central Florida oppstart midler og National Heart, Lung, og Blood Institute of National Institute of Health under prisen K25HL132098.

1. Making polyakrylamid (PA) gels
<ol><li>
Utarbeidelse av Petri parabol
	<ol>
<li>Forbered bind silan oppløsning ved å blande 200 mL ultrarent vann med 80 μL eddiksyre og 50 μL av 3-(trimethoxysilyl) propyl akrylat. Bind silan er en løsning som brukes til å funksjonalisere glass bunnen Petri parabolen overflaten for hydrogel vedlegg.</li>
		<li>Rør bind silan løsningen på en rør plate i minst 1 time.</li>
		<li>Unn sentrum brønn av Petri parabolen med bind silan løsning for 45 min.</li>
		...

<ol>
	<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Colin-York, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+(STFM).">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+stress+reconstitution+from+traction+force+data.">Intercellular stress reconstitution from traction force data.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).</li><li>Islam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Experimental+Methods+of+Cellular+Force+Sensing.">Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing.</a> Biomedical Journal of Science &amp; Technical Research. 17 (3), (2019).</li><li>Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear,+intercellular+stress,+and+endothelial+cell+alignment.">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+forces:+a+useful+parameter+in+cancer+research.">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li><li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues.">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li><li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation.">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces.">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li><li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption.">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).</li><li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function.">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li><li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions.">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li><li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family.">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li><li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall.">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li><li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+phosphorylation+in+brain,+cardiac,+endothelial+and+epithelial+tissues.">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li><li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice.">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li><li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis.">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',5'-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation.">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li><li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+cytotoxicity+of+2,5-dihydroxychalcones+and+related+compounds.">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li></ol>

Vår gruppe, så vel som andre, har vært vellykket ved hjelp av TFM og MSM å granske påvirkning av celle-celle veikryss i ulike patologiske og fysiologiske cellulære prosesser in vitro7,15,18,27 . For eksempel Hardin et al. presentert en svært innsiktsfull studie som antyder intercellulære stress overføring guider paracellular gap dannelse i endothelial celler15. ...

Feltet som refererer til studiet av virkningene av fysiske krefter og av mekaniske egenskaper på cellulære og vev fysiologi og patologi er kjent som mechanobiology1. Noen nyttige teknikker som har blitt benyttet i mechanobiology er monolag stress mikroskopi og trekkraft kraft mikroskopi. Traction Force mikroskopi tillater beregning av tractions generert på cellen-substrat grensesnitt, mens monolag stress mikroskopi tillater beregning av intercellulære påkjenninger generert mellom tilstøtende celler i en monolag2 ,3,4,5,6. Resultater gitt fra tidligere metoder har antydet at celle-avledet mekaniske påkjenninger spille en avgjørende rolle i å bestemme skjebnen til en rekke cellulære prosesser3,4,5. For eksempel, ved eksponering for en ekstern mekanisk kraft, en gruppe celler migrerer som en kollektiv kan endre sin morfologi og polariserer deres form til å justere og migrere langs retningen av anvendt kraft ved, delvis genererer tractions7, 8i den. Tractions gi en beregning som kan brukes til å evaluere celle contractility og beregnes ved hjelp av traction Force mikroskopi (TFM). Traction Force mikroskopi (TFM) begynner med fastsettelse av celle-indusert substrat deformasjoner etterfulgt av beregning av trekkraft feltet ved hjelp av en matematisk streng, mekanikk-baserte beregningsorientert tilnærming. Siden evnen til å beregne tractions har eksistert i ganske lang tid, har forskerne benyttet TFM å avdekke virkningen tractions har på en rekke prosesser, inkludert kreft9, såret healing10 og vurdering av konstruert CARDIAC vev11.
Implementering av TFM og MSM sammen kan deles inn i tre viktige trinn som må utføres i følgende rekkefølge: først hydrogel deformasjoner produsert av cellene bestemmes; andre, tractions utvinnes fra hydrogel deformasjoner; og for det tredje brukes en endelig element tilnærming til å beregne normal og skjær intercellulære spenninger i hele monolag. For å beregne gel forskyvninger, fluorescens perle bilder med celler ble sammenlignet med referanse perle bildet (uten celler) ved hjelp av en tilpasset skrevet partikkel bilde velocimetry (PIV) rutine. Størrelsen på kryss korrelasjons vinduet og overlappingen for PIV-analyse ble valgt til henholdsvis 32 x 32 piksler og 0,5. På denne tid, pixel Skift var omvendt i mikron av multiplisere med en pixel-å-mikron omdanne faktoren (for våre mikroskop, denne omdanne faktoren er 0,65) å få inne-plan forskyvninger. Feil forbundet med ignorerer ut-av-plan forskyvninger er ubetydelig12,13. Etter beregning av gel forskyvninger, er det to typer trekkraft målinger som kan utnyttes, begrenset tractions og ubegrenset tractions8,14. Ubegrenset tractions gir trekkraft feltet for hele synsfeltet (inkludert regioner med og uten celler), mens begrensede tractions gir trekkraft feltet bare for regioner som inneholder celler14. Deretter intercellulære spenninger beregnes ved hjelp av monolag stress mikroskopi (MSM), som er en forlengelse av traction Force mikroskopi. Implementering av MSM er basert på antagelsen om at lokale tractions utøves av en monolag av celler på cellen substrat-grensesnittet må balanseres av mekaniske krefter som overføres mellom cellene på celle-celle-grensesnittet som kreves av Newtons lover7 ,12,13. En viktig forutsetning her er at celle monolag kan behandles som et tynt elastisk ark fordi trekkraft fordelingen i monolag er kjent og kraftbalansen ikke er avhengig av celle materialets egenskaper. En annen viktig forutsetning er at trekkraft kreftene er balansert av lokale intercellulære påkjenninger innenfor det optiske synsfeltet (innenfor monolag) og innflytelsen av denne kraftbalansen er minimal i den ytre regionen (utenfor monolag)13. Grense forholdene som er definert av intercellulære påkjenninger, forskyvninger eller en kombinasjon av begge ved monolag grense, er derfor avgjørende for å utføre MSM13. Tatt i betraktning ovennevnte opplysninger, bruker vi MSM å utføre en endelig element analyse (FEM) for å gjenopprette den maksimale viktigste stress (σMax) og minimum viktigste stress (σmin) ved å rotere stress planet på hvert punkt i monolag. Disse viktigste påkjenninger blir senere brukt til å beregne 2D gjennomsnittlig normal intercellulære stress [(σMax + σmin)/2] og 2D maksimal skjær intercellulære stress [(σMax -σmin)/2] innenfor hele monolag 12,13. Denne fremgangsmåten er beskrevet i mer detalj av Tambe et al.12,13
Monolag stress mikroskopi (MSM) tillater beregning av celle-celle intercellulære påkjenninger generert i en monolag6,7,8,12,13. Disse intercellulære påkjenninger har blitt foreslått å være viktig for vev vekst og reparasjon, sår helbredelse, og kreft metastasering12,15,16,17. I tillegg har intercellulære påkjenninger blitt foreslått å også være viktig i endothelial celle migrasjon og endothelial barrierefunksjon17,18. Mens celle-celle veikryss som tette veikryss og adherens knutepunkter har begge blitt foreslått å spille en avgjørende rolle i endothelial intercellulære stress generasjon og overføring, er rollen som gap knutepunkter fortsatt unnvikende. Gap knutepunkter fysisk koble tilstøtende celler og gi en vei for elektrisk strøm og molekyler (< 1 KDa) å passere mellom nabocellene19,20,21. Selv om endothelial Cells Express Cx37, Cx40, og Cx43 gap veikryss19,22, Cx43 er uten tvil det viktigste i forhold til sykdomsprogresjon23. Bevis på Cx43's betydning kan bli funnet i det faktum at genetisk sletting av Cx43 i mus resulterer i hypotensjon24 og har uheldige virkninger på angiogenese25. I tillegg har Cx43 blitt dokumentert å være viktig for celle migrasjon og spredning og i progresjon av aterosklerose18,22,23,24,25 .
I denne protokollen, vi brukte TFM og MSM å undersøke om trekkraft og intercellulære stress generasjon innenfor confluent, endothelial monolag ville bli påvirket av forstyrrelsen av endothelial gap Junction Cx43. Vi forstyrret Cx43 med 2,5-dihydroxychalcone (kalkon), et molekyl dokumentert å hemme Cx43 uttrykk26. Kalkon ble brukt til å forstyrre Cx43 i stedet for siRNA som kalkon har blitt rapportert tidligere av Lee et al. å forstyrre Cx43 uttrykket26. I tillegg var vi spesielt interessert i kalkon innflytelse på endotelet som det har også blitt rapportert å være en anti-inflammatorisk og anti-plate sammensatte som kan potensielt brukes til forebygging og behandling av ulike vaskulære patologi26. Kalkon behandlinger ble utført en time etter forsøket utbruddet, kalkon-behandlet monolagere ble avbildet i totalt seks timer, og bildebehandling ble utført med en tilpasset skrevet MATLAB kode for å bestemme tractions og senere intercellulære Understreker. Våre resultater viste en generell nedgang i tractions og intercellulære påkjenninger, antyder Cx43 spiller en nøkkelrolle i endothelial biomekanikk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td>Essential to flatten polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bis-acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610143</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8242;,5&#8242;-Dihydroxychalcone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>IDF00046</td>
			<td>To disrupt Cx43 structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2530-85-0</td>
			<td>Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Essential to make bind saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog # A-11001</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610700</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>To make blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005-100ML</td>
			<td>Use as a extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td>Buffer Saline needed for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>To dissolve chalcone and make stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8812</td>
			<td>0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Essential to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LVES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1460801</td>
			<td>Essential HUEVC media 200 supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M200500</td>
			<td>Essential media for HUVEC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog #13-8300</td>
			<td>Primary antibody for Cx43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm dia)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-20-1.5H</td>
			<td>35 mm petri dish with a 20 mm center well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td>102568-43-4</td>
			<td>Essential to functionalize polyacrylamide gel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW corning</td>
			<td>2646340</td>
			<td>Silicon elastomer with curing agent to make PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610801</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>To permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Used to detach cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption

Endothelial celler har blitt etablert for å generere intercellulære påkjenninger og tractions, men rolle gapet kryss spille i endothelial intercellulære stress og trekkraft generasjon er foreløpig ukjent. Derfor presenterer vi her en mekanikk-basert protokoll for å granske påvirkning av gap Junction connexin 43 (Cx43) har på endothelial biomekanikk ved å utsette confluent endothelial monolagere til en kjent Cx43 inhibitor 2,5-dihydroxychalcone (kalkon) og måle effekten denne hemmer har på tractions og intercellulære påkjenninger. Vi presenterer representative resultater, som viser en nedgang i både tractions og intercellulære påkjenninger under en høy kalkon dose (2 μg/mL) sammenlignet med kontroll. Denne protokollen kan brukes til ikke bare Cx43, men også andre gap veikryss i tillegg, forutsatt at riktig inhibitor brukes. Vi tror denne protokollen vil være nyttig innen hjerte-og mechanobiology forskning.

Bilde av kontroll av fase kontrast, 0,2 μg/mL og 2 μg/mL kalkon behandlede monolagere ble tatt 30 minutter før behandling med kalkon (figur 1A-C) og 2 timer etter kalkon behandling (fig. 1D-F). Celle induserte perle forskyvninger (μm) ble observert å avta i både lav dose kalkon og høye dose kalkon forhold (figur 2E, F) sammenlignet med kontrol...

Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Her presenterer vi en mekanikk-basert protokoll for å forstyrre gapet knutepunkt connexin 43 og måle den påfølgende effekten dette har på endothelial biomekanikk via observasjon av tractions og intercellulære påkjenninger.

Perturbing endothelial biomekanikk via Connexin 43 strukturelle avbrudd

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Denne protokollen er betydelig da det tillater belysning av hvilken rolle cellulære krefter spiller i mange fysiologiske og patologiske prosesser, for eksempel sårheling og kreftmetastaser. Den største fordelen med denne mekanikkbaserte teknikken er dens evne til samtidig å forstyrre cellecellekryss og måle dens innvirkning på cellegenererte mekaniske krefter, hovedsakelig trekkraft og intercellulære stressfaktorer. Vår protokoll gjelder for et bredt spekter av patofysiologiske prosesser, for eksempel kreftmetastaser, ateroskleroskler og hypertensjon.Våre metoder kan integreres for å utføre både biokjemisk og biomekanisk analyse med organ-on-chip modeller, bio-konstruert vev konstruksjoner, in vitro narkotika leveringssystemer, og vev co-kultur systemer. Vår protokoll er ganske grei å utføre. Vi anbefaler imidlertid de som gjør denne protokollen for første gang å ha tålmodighet og ikke rush gjennom trinnene i denne protokollen.Vår protokoll har unike trinn som kanskje ikke er klare for førstegangsbrukere. Derfor oppfordrer vi brukerne til å følge våre skriftlige trinnvise prosedyrer og bruke visuelle demonstrasjoner som veiledning. Til å begynne med, lag Blind-silane løsning ved å blande 200 milliliter ultra rent vann med 80 mikroliter eddiksyre og 50 mikroliter silanmetakkrylat.Rør Bind-silaneoppløsningen på en røreplate i minst en time. Behandle midten godt av en petriskål med Bind-silane-løsningen i 45 minutter. Fjern Bind-silaneoppløsningen og skyll petriskålen med ultra rent vann to til tre ganger.Tørk petriskåloverflaten og oppbevar ved romtemperatur for fremtidig bruk. For å forberede hydrogeloppløsningen, bland 12,49 milliliter ultra rent vann til 2,062 milliliter med 40% akrylamid og 375 mikroliter på 2% bisacrylamid i et 15-milliliter sentrifugerør. Tilsett 80 mikroliter fluorescerende perler til hydrogelløsningen.Rist forsiktig røret for å blande perlene med geloppløsningen. Hold hetten løs på sentrifugerøret og legg den i et vakuumkammer. Degass geloppløsningen i minst 45 minutter i vakuumkammeret.For å polymerisere hydrogelen, legg først til 75 mikroliter med 10% ammoniumpersulfat og legg deretter til åtte mikroliter temed til hydrogelløsningen. Plasser 24 mikroliter av hydrogeloppløsningen i midten av petriskålen. Trykk på hydrogelen med en 18 millimeter dekselslipp for å flate hydrogelen og lage en høyde på ca. 100 mikrometer.Vent minst 30 til 40 minutter for gelpolymerisering. Senk den polymeriserte hydrogelen i ultra rent vann for å forhindre geldehydrering. Dekk petriskålen med aluminiumsfolie for å forhindre fotobleaching av fluorescerende perler og lagre på fire grader Celsius.Bland først PDMS silikonbase med silikonherdingsmiddelet i forholdet 20 til en i et 50-milliliter sentrifugerør. Snu røret opp ned og rist kraftig flere ganger for å sikre riktig blanding av PDMS-løsningen. Fjern boblene i PDMS-løsningen ved å sentrifugere i ett minutt ved 190 ganger G.Hell fem til seks milliliter av PDMS-løsningen i midten av en 100 millimeter petriskål og agrører fatet til PDMS-løsningen dekker hele petriskåloverflaten.Herd PDMS-løsningen over natten ved 50 til 60 grader Celsius. Deretter fjerner du en sirkulær PDMS-sjablong med 16 millimeter diameter med en hullpuncher. Bruk en 1,25 millimeter diameter biopsi punch for å lage små hull i PDMS sjablongen.Steriliser PDMS-sjablonger ved å senke dem ned i 70% etanol i to til tre minutter, aspirere av overflødig etanol og deretter plassere under et UV-lys i fem minutter. Aspirer overflødig væske og fjern dekselet slip fra hydrogelen. Plasser PDMS-sjablongen på hydrogeloverflaten og bruk pinsett til å legge lett trykk på PDMS-sjablongen for å sikre en vanntett forsegling mellom PDMS-sjablongen og hydrogeloverflaten.Dekk hydrogelens overflate med Sulfo-SAMPA oppløst i 0,1 molar HEPES bufferløsning i en konsentrasjon på en til 1000 og plasser hydrogelen under en UV-lampe med en effekt på 36 watt i åtte minutter. Aspirer den overskytende Sulfo-SAMPA- og HEPES-oppløsningen og skyll hydrogelen to ganger med 0,1 molar HEPES etterfulgt av ytterligere to skyll med ultra rent vann. Aspirer overflødig ultra rent vann og bruk en 200-mikroliter pipette til å belegge hydrogelen med 0,1 milligram per milliliter kollagen-1.Dekk parabolen for å beskytte de fluorescerende perlene mot fotobleaching og lagre hydrogelen ved fire grader Celsius over natten. Nå legger du til tre milliliter 1X Trypsin i kolben og legg den i inkubatoren ved 37 grader Celsius i tre til fem minutter for å løsne cellene fra vevskulturkolben. Etter trypsinisering, legg til tre milliliter cellekulturmedier i kolben, virvle for å blande og overføre blandingen til et 15-milliliter sentrifugerør.Sentrifuger celleløsningen i tre minutter ved 1, 710 ganger G.Aspirer de overnaturante og re-suspendere cellene i media til en konsentrasjon på 50 ganger 10 til de fire cellene per milliliter. Ta ut hydrogelfatet fra kjøleskapet. Fjern kollagen-1 fra hydrogelen og skyll en gang med PBS.Tilsett 75 ganger 10 til de tredje cellene til toppen av PDMS-sjablongen og la cellene feste seg til hydrogeloverflaten i minst en time i inkubatoren ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Fjern PDMS-sjablongen og senk PDMS-sjablongen i 10X Trypsin i 10 til 15 sekunder for å fjerne vedlagte celler. Tilsett minst to milliliter med media i petriskålen og steriliser sjablongen ved å sprøyte med 70% etanol, og deretter plassere under UV-lyset i fem minutter.Plasser petriskålen i inkubatoren i minst 36 timer, eller til en samtidig monolag observeres. Fasekontrastbilder på 30 minutter før chalconebehandling og to timer etter chalconebehandling ble sammenlignet. Celleinduserte perleforskyvninger ble observert å redusere i både lavdose chalcone og høydose chalcone forhold sammenlignet med kontroll HUVEC monolayers.Før chalcone behandling, RMS trekkraft var rundt 51 Pascals for alle forhold. Etter chalcone behandling, det var en liten økning i RMS trekkraft til 59 Pascals i lavdose chalcone behandlet monolayers og en nesten to ganger reduksjon i RMS trekkraft til 18 Pascals i høydose chalcone behandlet monolayers sammenlignet med kontrollen. Chalcone behandling økte gjennomsnittlig normal intercellulær stressstørrelse med lavdose, men reduserte signifikant gjennomsnittlig normal intercellulær stressstørrelse med høy dose sammenlignet med kontroll.Chalcone-behandlingen reduserte også de maksimale rene intercellulære påkjenningene ved både lav og høy chalconekonsentrasjon sammenlignet med kontrollen. Virkningen av chalcone behandling er statistisk signifikant basert på både T-tester og enkeltfaktor ANOVA test. Når du plasserer PDMS-sjablongen på toppen av gelen, må du kontrollere at gelen er tørr nok til å sikre en vanntett forsegling mellom PDMS-sjablongen og gelen.Denne protokollen kan også brukes til å undersøke det biomekaniske bidraget fra en rekke cellecellekryss, cytoskeletale proteiner, cell matrix adhesjonmolekyler eller ekstracellulære molekyler med levende bildebehandling. Med denne in vitro-protokollen kan forskere nå undersøke en rekke biomekaniske, samt biokjemiske egenskaper under vevreparasjon, sårheling eller kreftmetastaser uten dyremodell. Vi anbefaler våre seere å være svært forsiktig mens håndtere chalcone og DMSO som innånding av disse stoffene er rapportert å være skadelig.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Tilberedning av nukleosomer med Forskjellig Isotop-merket Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS for inngående karakterisering og kvantifisering av glutamin og asparagin Deamidering i hagle Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokjemiske og strukturelle karakteristikk av karbohydrater Transport substrat-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Strukturelle karakteristikk av Mannan cellevegg polysakkarider i planter ved hjelp av TEMPO

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantifisering av Protein Homo-oligomerization med kommersielle instrumentering og gratis, åpen kildekode lysstyrke analyseprogramvare

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Endre Baculovirus uttrykk vektorer å produsere utskilles anlegget proteiner i insekt celler

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle studier av makromolekyler i løsning med liten vinkel X-Ray spredning

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analyse av SEC-SAXS-data via EFA-overføring og spredning

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Krystallisering og strukturell bestemmelse av et enzym:Substrat kompleks av seriell krystallografi i en allsidig mikrofluidisk chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Rask nettforberedelse for tidsavklart kryo-elektronmikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...