Name: perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelos fundos de start-up da Universidade de Florida Central e pelo Instituto Nacional de coração, pulmão e sangue do Instituto Nacional de saúde o prêmio K25HL132098.

1. fazer géis de poliacrilamida (PA)
<ol><li>
Preparação do prato de Petri
	<ol>
<li>Prepare a solução de silano de ligamento misturando 200 ml de água ultrapura com 80 μL de ácido acético e 50 μL de 3-(trimetoxisililo) de metacrilato de propil. O silano do ligamento é uma solução usada para funcionalizar a superfície inferior de vidro do prato de Petri para o acessório do hidrogel.</li>
		<li>Mexa a solução de silano de ligação numa placa de agitação durante pelo menos 1 h.</li>
	...

<ol>
	<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Colin-York, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+(STFM).">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+stress+reconstitution+from+traction+force+data.">Intercellular stress reconstitution from traction force data.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).</li><li>Islam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Experimental+Methods+of+Cellular+Force+Sensing.">Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing.</a> Biomedical Journal of Science &amp; Technical Research. 17 (3), (2019).</li><li>Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear,+intercellular+stress,+and+endothelial+cell+alignment.">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+forces:+a+useful+parameter+in+cancer+research.">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li><li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues.">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li><li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation.">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces.">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li><li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption.">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).</li><li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function.">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li><li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions.">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li><li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family.">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li><li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall.">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li><li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+phosphorylation+in+brain,+cardiac,+endothelial+and+epithelial+tissues.">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li><li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice.">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li><li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis.">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',5'-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation.">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li><li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+cytotoxicity+of+2,5-dihydroxychalcones+and+related+compounds.">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li></ol>

Nosso grupo, assim como outros, tem sido com sucesso usando TFM e msm para sondar a influência de junções Cell-Cell em vários processos celulares patológicos e fisiológicos in vitro7,15,18,27 . Por exemplo, Hardin et al. apresentaram um estudo muito perspicaz que sugere a transmissão do estresse intercelular orienta a formação de Gap paracelular nas células endoteliais<sup class="xref...

O campo que se refere ao estudo dos efeitos das forças físicas e das propriedades mecânicas na fisiologia e patologia celular e tecidual é conhecido como mecanobiologia1. Algumas técnicas úteis que têm sido utilizadas na mecanobiologia são A microscopia de estresse monocamada e A microscopia de força de tração. A microscopia da força da tração permite a computação dos trações gerados na relação da pilha-carcaça, quando a microscopia de esforço do monocamada permitir a computação de tensões intercelular geradas entre pilhas adjacentes dentro de um monocamada2 ,3,4,5,6. Os resultados obtidos a partir de métodos anteriores sugeriram que as tensões mecânicas derivadas de células desempenham um papel crucial na determinação do destino de uma série de processos celulares3,4,5. Por exemplo, após a exposição a uma força mecânica externa, um grupo de células migrando como um coletivo pode alterar sua morfologia e polarizar sua forma de alinhar e migrar ao longo da direção da força aplicada, em parte, gerando tracções7, a 8. As tracções fornecem uma métrica que pode ser usada para avaliar a contratilidade celular e são calculadas usando a microscopia de força de tração (TFM). A microscopia de força de tração (TFM) começa com a determinação de deformações de substrato induzidas por células seguidas pelo cálculo do campo de tração usando uma abordagem computacional matematicamente rigorosa e baseada em mecânica. Uma vez que a capacidade de calcular trações tem sido em torno de algum tempo, os pesquisadores têm utilizado TFM para revelar as tracções de impacto têm em uma série de processos, incluindo o câncer9, cicatrização de feridas10 e avaliação de engenharia cardíaca tecido11.
A implementação de TFM e MSM juntos pode ser dividida em três etapas essenciais que devem ser executadas na seguinte ordem: primeiro, as deformações de hidrogel produzidas pelas células são determinadas; segundo, os trações são recuperados das deformações do hidrogel; e em terceiro lugar, uma aproximação do elemento finito é usada para computar tensões intercelular normais e da tesoura dentro da monocamada inteira. Para computar deslocamentos do gel, as imagens do grânulo da fluorescência com pilhas foram comparadas com a imagem do grânulo da referência (sem pilhas) usando uma rotina costume-escrita da Velocimetria da imagem da partícula (PIV). O tamanho da janela de correlação cruzada e a sobreposição para a análise de PIV foram escolhidos para 32 x 32 pixels e 0,5, respectivamente. Neste momento, os deslocamentos de pixel foram convertidos em mícrons multiplicando-se com um fator de conversão de pixel a mícron (para nosso microscópio, esse fator de conversão é 0,65) para obter deslocamentos no plano. Erros associados a ignorar deslocamentos fora do plano são negligenciáveis12,13. Após a computação de deslocamentos do gel, há dois tipos de medidas da tração que podem ser utilizadas, trações restringidos e trações unrestringidos8,14. As tracções não restritas fornecem o campo de tração para todo o campo de visão (incluindo regiões com e sem células), enquanto as tracções restritas fornecem o campo de tração somente para regiões que incluem células14. Em seguida, as tensões intercelulares são calculadas usando a microscopia de estresse monocamada (MSM), que é uma extensão da microscopia de força de tração. A implementação de MSM baseia-se na suposição de que as tracções locais exercidas por uma monocamada de células na interface de substrato celular devem ser equilibradas por forças mecânicas transmitidas entre células na interface célula-célula, conforme exigido pelas leis de Newton7 ,12,13. Uma suposição chave aqui é que o monocamada da pilha pode ser tratado como uma folha elástica fina porque a distribuição da tração no monocamada é sabida e o contrapeso da força não depende das propriedades do material da pilha. Outra suposição fundamental é que as forças de tração são equilibradas por tensões intercelulares locais dentro do campo óptico de visão (dentro da monocamada) e a influência desse equilíbrio de força é mínima na região distal (fora da monocamada)13. Portanto, as condições de contorno definidas por tensões intercelulares, deslocamentos ou uma combinação de ambos no limite de monocamada são cruciais para executar MSM13. Tendo em conta as informações acima, utilizamos MSM para realizar uma análise de elementos finitos (FEM) para recuperar a tensão principal máxima (σmáx) e tensão principal mínima (σmin) girando o plano de tensão em cada ponto dentro do monocamada. Estas tensões principais são usadas subseqüentemente para computar a 2D tensão intercelular normal média [(σMax + σmin)/2] e o esforço intercelular do cisalhamento máximo 2D [(σMax -σmin)/2] dentro da monocamada inteira 12,13. Este procedimento é descrito com mais detalhes por tambe et al.12,13
A microscopia de estresse monocamada (MSM) permite o cálculo das tensões intercelulares celulares geradas dentro de uma monocamada6,7,8,12,13. Essas tensões intercelulares têm sido sugeridas para serem importantes para o crescimento e reparo tecidual, cicatrização de feridas e metástase oncológica12,15,16,17. Além disso, as tensões intercelulares têm sido sugeridas para também serem importantes namigração de célulasendoteliais e na função da barreira endotelial17,18. Quando as junções da pilha-pilha tais como junções apertadas e junções dos aderens tiverem sido sugeridas para jogar um papel crítico na geração e na transmissão intercelular endoteliais do esforço, o papel de junções da abertura permanece indescritível. As junções da abertura conectam fisicamente pilhas adjacentes e fornecem um caminho para a corrente elétrica e as moléculas (< 1 kDa) para passar entre as pilhas vizinhas19,20,21. Embora as células endoteliais expressem Cx37, Cx40 e Cx43 junções Gap19,22, Cx43 é indiscutivelmente o mais importante em termos de progressão da doença23. Evidências de Cx43's importância podem ser encontradas no fato de que o apagamento genético de Cx43 em camundongos resulta em hipotensão24 e tem efeitos adversos na angiogênese25. Além disso, Cx43 tem sido documentado para ser importante para a migração e proliferação celular e na progressão da aterosclerose18,22,23,24,25 .
Neste protocolo, utilizou-se TFM e HSH para investigar se a tração e a geração de estresse intercelular dentro do confluente, monocamada endotelial seriam impactadas pelo rompimento da junção de Gap endotelial Cx43. Nós interrompemos Cx43 com 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), uma molécula documentada para inibir Cx43 expressão26. Chalcona foi usado para interromper Cx43 em vez de siRNA como o Chalcona foi relatado previamente por Lee et al. para interromper Cx43 expressão26. Além disso, estávamos particularmente interessados na influência do chalcone no endotélio, pois também foi relatado como um composto anti-inflamatório e antiplaquetário que pode potencialmente ser usado para a prevenção e tratamento de vários patologias26. Os tratamentos com chalcone foram realizados uma hora após o início do experimento, monocamadas tratados com chalcone foram fotografados por um total de seis horas, e o processamento de imagens foi realizado com um código MATLAB personalizado para determinar tracções e, subsequentemente, intercelular Salienta. Nossos resultados mostraram uma diminuição total em trações e em tensões intercelular, sugerindo que Cx43 Jogue um papel chave na biomecânica endothelial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td>Essential to flatten polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bis-acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610143</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8242;,5&#8242;-Dihydroxychalcone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>IDF00046</td>
			<td>To disrupt Cx43 structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2530-85-0</td>
			<td>Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Essential to make bind saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog # A-11001</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610700</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>To make blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005-100ML</td>
			<td>Use as a extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td>Buffer Saline needed for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>To dissolve chalcone and make stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8812</td>
			<td>0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Essential to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LVES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1460801</td>
			<td>Essential HUEVC media 200 supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M200500</td>
			<td>Essential media for HUVEC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog #13-8300</td>
			<td>Primary antibody for Cx43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm dia)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-20-1.5H</td>
			<td>35 mm petri dish with a 20 mm center well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td>102568-43-4</td>
			<td>Essential to functionalize polyacrylamide gel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW corning</td>
			<td>2646340</td>
			<td>Silicon elastomer with curing agent to make PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610801</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>To permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Used to detach cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption

As células endoteliais foram estabelecidas para gerar tensões e tracções intercelulares, mas as junções de Gap de papel desempenham no estresse intercelular endotelial e a geração de tração é atualmente desconhecida. Conseqüentemente, nós apresentamos aqui um protocolo mecânica-baseado para sondar a influência do conexina 43 da junção da abertura (Cx43) tem na biomecânica endothelial expondo monocamadas endothelial confluente a um inibidor conhecido do Cx43 2, a 5-dihydroxychalcone (chalcone) e medir o impacto que este inibidor tem sobre tracções e tensões intercelulares. Nós apresentamos resultados representativos, que mostram uma diminuição em ambos os trações e tensões intercelular uma dosagem elevada do Chalcona (2 μg/ml) quando comparado ao controle. Este protocolo pode ser aplicado a não apenas Cx43, mas também outras junções de Gap, assumindo que o inibidor apropriado é usado. Acreditamos que este protocolo será útil nos campos da pesquisa cardiovascular e mecanobiologia.

As imagens de contraste de fase de controle, 0,2 μg/ml e 2 μg/ml de monocamadas tratados com Chalcona foram realizadas 30 minutos antes do tratamento com Chalcona (Figura 1A-C) e 2 horas após o tratamento com Chalcona (Figura 1D-F). Os deslocamentos de esferas induzidas por células (μm) foram observados para diminuir tanto no Chalcona de dose baixa quanto nas condições de Chalcona de alta ...

Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Aqui, apresentamos um protocolo baseado em mecânica para interromper a junção de Gap conexina 43 e medir o impacto subsequente que isso tem sobre a biomecânica endotelial através da observação de tracções e tensões intercelulares.

Perturbando a biomecânica endotelial via connexin 43 disrupção estrutural

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Este protocolo é significativo, pois permite a elucidação do papel que as forças celulares desempenham em muitos processos fisiológicos e patológicos, como a cicatrização de feridas e metástases cancerígenas, por exemplo. A principal vantagem desta técnica baseada em mecânica é sua capacidade de interromper simultaneamente as junções celular-célula e medir seu impacto sobre as forças mecânicas geradas por células, principalmente traçãos e estressores intercelulares. Nosso protocolo é aplicável a uma ampla gama de processos fisioterapêutos, como metástases cancerígenas, atheroscleroses e hipertensão, por exemplo.Nossos métodos podem ser integrados para realizar análises bioquímicas e biomecânicas com modelos de órgãos em chip, construções de tecidos bio-projetados, sistemas de entrega de medicamentos in vitro e sistemas de cocultura tecidual. Nosso protocolo é bastante simples de executar. No entanto, aconselhamos aqueles que fazem este protocolo pela primeira vez a ter paciência e não correr pelas etapas deste protocolo.Nosso protocolo tem etapas únicas que podem não ser claras para os usuários iniciantes. Por isso, encorajamos os usuários a seguir nossos procedimentos passo a passo escritos e usar demonstrações visuais como orientação. Para começar, prepare a solução de silano cego misturando 200 mililitros de água ultra pura com 80 microliters de ácido acético e 50 microliters de metacrilato de silano.Mexa a solução bind-silane em uma placa de mexida por pelo menos uma hora. Trate o poço central de uma placa de Petri com a solução Bind-silane por 45 minutos. Remova a solução Bind-silane e enxágue a placa de Petri com água ultra pura duas a três vezes.Seque a superfície da placa de Petri e armazene à temperatura ambiente para uso futuro. Para preparar a solução de hidrogel, misture 12,49 mililitros de água ultra pura a 2.062 mililitros de 40% de acrilamida e 375 microlitadores de 2%bisacrilamida em um tubo centrífuga de 15 mililitros. Adicione 80 microliters de contas fluorescentes à solução de hidrogel.Agite suavemente o tubo para misturar as contas com a solução de gel. Mantenha a tampa solta no tubo de centrífuga e coloque-a em uma câmara de vácuo. Desaum o gel solução por pelo menos 45 minutos na câmara de vácuo.Para polimerizar o hidrogel, primeiro adicione 75 microlitadores de persulfato de 10% de amônio e, em seguida, adicione oito microliters de TEMED à solução de hidrogel. Coloque 24 microliters da solução de hidrogel no centro da placa de Petri. Pressione o hidrogel com uma tampa de 18 milímetros para achatar o hidrogel e fazer uma altura de aproximadamente 100 micrômetros.Aguarde pelo menos 30 a 40 minutos para polimerização de gel. Submergir o hidrogel polimerizado em água ultra pura para evitar a desidratação do gel. Cubra a placa de Petri com papel alumínio para evitar o fotobleaching de contas fluorescentes e armazene a quatro graus Celsius.Primeiro, misture a base de silicone PDMS com o agente de cura de silicone em uma proporção de 20 para um em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Inverta o tubo de cabeça para baixo e agite vigorosamente várias vezes para garantir a adequada mistura da solução PDMS. Remova as bolhas na solução PDMS centrifugando por um minuto a 190 vezes G.Despeje de cinco a seis mililitros da solução PDMS no centro de uma placa de Petri de 100 milímetros e agitar a placa até que a solução PDMS cubra toda a superfície da placa de Petri.Cure a solução PDMS durante a noite a 50 a 60 graus Celsius. Em seguida, remova um estêncil PDMS de diâmetro circular de 16 milímetros com um perfurador de furos. Use um perfurado de biópsia de 1,25 milímetros de diâmetro para criar pequenos orifícios no estêncil PDMS.Esterilize os estêncil PDMS submergindo-os em 70% de etanol por dois a três minutos, aspirando o excesso de etanol e, em seguida, colocando sob uma luz UV por cinco minutos. Aspire qualquer excesso de líquido e remova o deslizamento da tampa do hidrogel. Coloque o estêncil PDMS na superfície do hidrogel e use pinças para aplicar pressão leve ao estêncil PDMS para garantir uma vedação à base de água entre o estêncil PDMS e a superfície do hidrogel.Cubra a superfície do hidrogel com Sulfo-SAMPA dissolvido em solução tampão HEPES molar de 0,1 molar a uma concentração de 1 a 1.000 e coloque o hidrogel sob uma lâmpada UV com potência de 36 watts por oito minutos. Aspire o excesso de solução Sulfo-SAMPA e HEPES e enxágue o hidrogel duas vezes com HEPES molar 0,1 seguido de duas enxágues adicionais com água ultra pura. Aspire o excesso de água ultra pura e use uma pipeta de 200 microliter para revestir o hidrogel com 0,1 miligramas por mililitro de Colágeno-1.Cubra o prato para proteger as contas fluorescentes de fotobleaching e armazene o hidrogel a quatro graus Celsius durante a noite. Agora, adicione três mililitros de 1X Trypsin no frasco e coloque-o na incubadora a 37 graus Celsius por três a cinco minutos para separar as células do frasco de cultura tecidual. Após a experimentação, adicione três mililitros de mídia de cultura celular no frasco, redemoinho para misturar e transfira a mistura em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.Centrifugar a solução celular por três minutos a 1.710 vezes G.Aspire o supernasce e suspenda as células na mídia para uma concentração de 50 vezes 10 às quatro células por mililitro. Retire o prato de hidrogel da geladeira. Remova o Colágeno-1 do hidrogel e enxágue uma vez com PBS.Adicione 75 vezes 10 às terceiras células ao topo do estêncil PDMS e permita que as células se conectem à superfície do hidrogel por pelo menos uma hora na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Remova o estêncil PDMS e submerse o estêncil PDMS em Trypsin 10X por 10 a 15 segundos para remover todas as células anexadas. Adicione pelo menos dois mililitros de mídia à placa de Petri e esterilize o estêncil pulverizando com 70% de etanol e, em seguida, colocando sob a luz UV por cinco minutos.Coloque a placa de Petri na incubadora por pelo menos 36 horas, ou até que uma monocamada confluente seja observada. Imagens de contraste de fase de 30 minutos antes do tratamento de chalcone e duas horas após o tratamento de chalcone foram comparadas. Os deslocamentos de contas induzidos por células foram observados para diminuir tanto em condições de chalcone de baixa dose quanto em altas doses quando comparados às monocamadas huvec de controle.Antes do tratamento de chalcone, as traçãos RMS eram em torno de 51 Pascals para todas as condições. Após o tratamento de chalcone, houve um pequeno aumento nas traçãos RMS para 59 Pascals em monocamadas tratadas com baixa dose e uma redução de quase duas vezes nas trações RMS para 18 Pascals em monocamadas tratadas com alta dose em comparação com o controle. O tratamento chalcone aumentou a magnitude média normal do estresse intercelular com baixa dose, mas diminuiu significativamente a magnitude média normal de estresse intercelular com alta dose quando comparado ao controle.O tratamento de chalcone também diminuiu as tensões intercelulares máximas tanto na baixa quanto na alta concentração de chalcone quando comparado ao controle. O impacto do tratamento chalcone é estatisticamente significativo com base tanto nos testes T quanto no teste ANOVA de fator único. Ao colocar estêncil PDMS em cima do gel, certifique-se de que o gel está seco o suficiente para garantir uma vedação apertada entre o estêncil PDMS e o gel.Este protocolo também pode ser aplicado para sondar a contribuição biomecânica de uma variedade de junções células células, proteínas citoesqueletal, moléculas de adesão da matriz celular ou moléculas extracelulares com imagens vivas. Com este protocolo in vitro, os pesquisadores agora podem investigar com sucesso uma série de propriedades biomecânicas, bem como propriedades bioquímicas durante a reparação de tecidos, cicatrização de feridas ou metástases de câncer sem modelo animal. Aconselhamos nossos espectadores a serem muito cuidadosos ao manusear chalcone e DMSO, pois a inalação dessas drogas é relatada como prejudicial.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Reconstituição de Nucleosomes com Histones irmã diferencialmente Isotope-rotulados

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Bioquímica

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS para Caracterização em profundidade e Quantificação de Glutamina e Asparagina em desamidação da espingarda Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Caracterização estrutural de polissacarídeos de parede celular Medeiros em plantas usando a ritmo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Modificar vetores de expressão de Baculovirus para produzir secretado proteínas vegetais em células de inseto

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Estudos estruturais de macromoléculas em solução usando o pequeno ângulo de espalhamento de raios-x

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Análise dos dados da SEC-SAXS via desconvolução e dispersão da EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Cristalização e Determinação Estrutural de uma Enzima:Complexo de Substrato por Cristalografia Serial em um Chip Microfluido Versátil

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Preparação rápida da grade para microscopia crio-elétron resolvida pelo tempo

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...