Name: perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

Эта работа была поддержана Университета Центральной Флориды стартовых фондов и Национального сердца, легких, и крови института Национального института здравоохранения в соответствии с наградой K25HL132098.

1. Изготовление гелей полиакриламид (PA)
<ol><li>
Приготовление блюда Петри
	<ol>
<li>Приготовьте связываемый силановой раствор, смешивая 200 мл ультрачистой воды с 80 йл уксусной кислотой и 50 зл 3-(триметоксисил)пропил метакрилат. Bind silane - это решение, используемое для функционализации ст...

<ol>
	<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Colin-York, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+(STFM).">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+stress+reconstitution+from+traction+force+data.">Intercellular stress reconstitution from traction force data.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).</li><li>Islam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Experimental+Methods+of+Cellular+Force+Sensing.">Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing.</a> Biomedical Journal of Science &amp; Technical Research. 17 (3), (2019).</li><li>Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear,+intercellular+stress,+and+endothelial+cell+alignment.">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+forces:+a+useful+parameter+in+cancer+research.">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li><li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues.">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li><li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation.">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces.">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li><li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption.">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).</li><li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function.">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li><li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions.">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li><li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family.">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li><li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall.">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li><li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+phosphorylation+in+brain,+cardiac,+endothelial+and+epithelial+tissues.">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li><li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice.">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li><li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis.">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',5'-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation.">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li><li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+cytotoxicity+of+2,5-dihydroxychalcones+and+related+compounds.">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li></ol>

Наша группа, как и другие, успешно использует TFM и MSM для зондирования влияния клеточных соединений в различных патологических и физиологических клеточных процессах in vitro7,15,18,27 . Например, Hardin et al. представили очень про...

Поле, которое относится к изучению влияния физических сил и механических свойств на клеточной и тканевой физиологии и патологии известен как механобиология1. Несколько полезных методов, которые были использованы в механобиологии являются монослой нойелии стресс микроскопии и тяговой силы микроскопии. Микроскопия силы тяги позволяет вычислять tractions произведенных на интерфейсе клетк-субстрата, пока микроскопия усилия монослой позволяет вычислить межклеточных напряжений произведенных между смежными клетками внутри monolayer2 ,3,4,5,6. Результаты, полученные из предыдущих методов, показали, что механические напряжения, полученные из клеток, играют решающую роль в определении судьбы множества клеточных процессов3,4,5. Например, при воздействии внешней механической силы, группа клеток, мигрирующих как коллектив, может изменить свою морфологию и поляризовать свою форму, чтобы выровнять и мигрировать по направлению прикладной силы, частично генерируя тяги7, 8. Tractions обеспечивают метрику, которая может быть использована для оценки сотрудничности клеток и рассчитывается с помощью микроскопии силы тяги (TFM). Микроскопия силы тяги (TFM) начинает с определением клеточных индуцированных деформаций субстрата последовано за вычислением поля тяги используя математически строгий, механик-основанный вычислительный подход. Так как способность вычислить тяги была вокруг в течение довольно продолжительного времени, исследователи использовали TFM, чтобы выявить влияние tractions на множество процессов, в том числе рак9, заживление ран10 и оценка инженерии сердечной ткань11.
Внедрение ТФМ и МСМ вместе можно разделить на три основных шага, которые должны быть выполнены в следующем порядке: во-первых, определяются гидрогелевые деформации, производимые клетками; во-вторых, тяги восстанавливаются после деформаций гидрогеля; и в-третьих, для вычисления нормальных и сдвига межклеточных напряжений в рамках всего монослойа используется подход конечного элемента. Для вычисления смещений геля изображения флуоресценции с клетками сравнивались с эталонным изображением биса (без клеток) с помощью специально написанной целуются велоциметрии изображения частиц (PIV). Размер кросс-корреляционного окна и перекрытие для анализа PIV были выбраны в 32 х 32 пикселя и 0,5, соответственно. В это время пиксельные сдвиги были преобразованы в микроны путем умножения с коэффициентом преобразования пикселя к микрон (для нашего микроскопа этот коэффициент преобразования составляет 0,65) для получения перемещений в плоскости. Ошибки, связанные с игнорированием внеплановых перемещений, незначительны12,13. После вычисления смещений геля, Есть два типа измерения тяги, которые могут быть использованы, ограниченные тяги и неограниченные тяги8,14. Неограниченные тяги обеспечивают поле тяги для всего поля зрения (включая области с ячейками и без), в то время как ограниченные тяги обеспечивают поле тяги только для областей, которые включают ячейки14. Затем межклеточные напряжения рассчитываются с помощью монослойной стрессовой микроскопии (МСМ), которая является продолжением микроскопии силы тяги. Внедрение МСМ основано на предположении, что локальные тяги, прилагаемые монослой ячеек на интерфейсе клеток-субстрата, должны быть сбалансированы механическими силами, передаваемыми между клетками на интерфейсе ячейки, как того требуют законы Ньютона7 ,12,13. Ключевым предположением здесь является то, что монослой клетки можно рассматривать как тонкий эластичный лист, потому что распределение тяги в монослой еронет и баланс силы не зависит от свойств клеточного материала. Еще одно ключевое предположение состоит в том, что силы тяги уравновешиваются локальными межклеточными нагрузками в оптическом поле зрения (в пределах монослой) и влияние этого силового баланса минимально в дистальной области (вне монослой)13. Таким образом, пограничные условия, определяемые межклеточными нагрузками, смещениями или комбинацией обоих на монослойной границе, имеют решающее значение для выполнения МСМ13. Принимая во внимание приведенную выше информацию, мы используем МСМ для выполнения конечного анализа элементов (FEM) для восстановления максимального основного стресса(максимума)и минимального основного стресса(min)путем вращения плоскости напряжения в каждой точке в монослой. Эти основные стрессы впоследствии используются для расчета 2D среднего нормального межклеточного стресса(макс ймин) /2» и 2D максимального сдвига межклеточного стресса(макс -мин) /2 » в пределах всего монослойного 12,13. Эта процедура описана более подробно Tambe et al.12,13
Монослойная микроскопия стресса (МСМ) позволяет рассчитать межклеточные напряжения клеток, образовавшиеся в пределах монослойной6,7,8,12,13. Эти межклеточные стрессы были предложены, чтобы иметь важное значение для роста тканей и ремонта, заживление ран, и метастазировать рак12,15,16,17. Кроме того, межклеточные стрессы были предложены также иметь важное значение в эндотелиальной миграции клеток и эндотелиальной функциибарьера 17,18. В то время как соединения клеток, такие как узкие соединения и адепты, как было предложено, чтобы играть важную роль в эндотелиальной межклеточной генерации стресса и передачи, роль разрыв соединений остается неуловимым. Разрыв ные соединения физически соединяют соседние клетки и обеспечивают путь для электрического тока и молекул (Злт;1 KDa), чтобы пройти между соседними клетками19,20,21. Хотя эндотелиальные клетки выражают Cx37, Cx40, и Cx43 разрыв узлов19,22, Cx43, возможно, наиболее важным с точки зрения прогрессирования заболевания23. Доказательства важности Cx43 можно найти в том, что генетическое удаление Cx43 у мышей приводит к гипотонии24 и оказывает неблагоприятное воздействие на ангиогенез25. Кроме того, Cx43 был задокументирован, чтобы быть важным для миграции клеток и распространения и в прогрессировании атеросклероза18,22,23,24,25 .
В этом протоколе мы использовали TFM и MSM для исследования того, будет ли тяга и межклеточное напряжение в рамках слияния, эндотелиальный монослой будет влиять на нарушение эндотелиального разрыва соединения Cx43. Мы нарушили Cx43 с 2,5-dihydroxychalcone (халкон), молекула документально ингибировать Cx43 выражение26. Chalcone был использован для того чтобы нарушить Cx43 вместо siRNA по мере того как chalcone было сообщено ранее Ли et al. для того чтобы нарушить выражение Cx4326. Кроме того, мы были особенно заинтересованы в влиянии халкона на эндотелий, как было также сообщается, противовоспалительное и противо-тромбоцитов соединения, которые потенциально могут быть использованы для профилактики и лечения различных сосудистых патологии26. Обработка chalcone была выполнена час после начала эксперимента, chalcone-обработанные monolayers были изображены на итог 6 часов, и обработка изображения была выполнена с custom-written кодом MATLAB для того чтобы обусловить tractions и затем межклеточные Напряжения. Наши результаты показали общее снижение тяги и межклеточных стрессов, предполагая, что Cx43 играет ключевую роль в эндотелиальной биомеханике.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td>Essential to flatten polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bis-acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610143</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8242;,5&#8242;-Dihydroxychalcone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>IDF00046</td>
			<td>To disrupt Cx43 structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2530-85-0</td>
			<td>Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Essential to make bind saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog # A-11001</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610700</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>To make blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005-100ML</td>
			<td>Use as a extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td>Buffer Saline needed for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>To dissolve chalcone and make stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8812</td>
			<td>0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Essential to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LVES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1460801</td>
			<td>Essential HUEVC media 200 supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M200500</td>
			<td>Essential media for HUVEC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog #13-8300</td>
			<td>Primary antibody for Cx43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm dia)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-20-1.5H</td>
			<td>35 mm petri dish with a 20 mm center well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td>102568-43-4</td>
			<td>Essential to functionalize polyacrylamide gel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW corning</td>
			<td>2646340</td>
			<td>Silicon elastomer with curing agent to make PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610801</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>To permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Used to detach cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption

Эндотелиальные клетки были созданы для генерации межклеточных напряжений и тяг, но роль разрыв увязов играть в эндотелиального межклеточного стресса и тяги поколения в настоящее время неизвестно. Таким образом, мы представляем здесь механики на основе протокола для зондирования влияния разрыв соединения connexin 43 (Cx43) имеет на эндотелиальной биомеханики, подвергая слияния эндотелиальных монослоев известного ингибитора Cx43 2,5-dihydroxychalcone (халкон) и измерение влияния этого ингибитора на тяги и межклеточные стрессы. Мы представляем репрезентативные результаты, которые показывают снижение как тяги, так и межклеточных напряжений при высокой дозировке халкона (2 мкг/мл) по сравнению с контролем. Этот протокол может быть применен не только к Cx43, но и к другим развязкам, при условии использования соответствующего ингибитора. Мы считаем, что этот протокол будет полезен в области сердечно-сосудистых и механобиологических исследований.

Фазовые контрастные изображения контроля, 0,2 мкг/мл и 2 мкг/мл халкона, обработанные монослойными, были сделаны за 30 минут до обработки чалконей(рисунок 1A-C)и через 2 часа после лечения чалконом(рисунок 1D-F). Клеточные инд?...

Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Здесь мы представляем протокол на основе механики, чтобы нарушить разрыв соединения connexin 43 и измерить последующее воздействие это оказывает на эндотелиальной биомеханики через наблюдение тяги и межклеточных напряжений.

Возмущение эндотелиальной биомеханики через Connexin 43 Структурные нарушения

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет выяснить роль клеточных сил во многих физиологических и патологических процессов, таких как заживление ран и метастазы рака, например. Основным преимуществом этой техники, основанной на механике, является ее способность одновременно нарушать клеточные соединения и измерять ее воздействие на механические силы, генерируемые клетками, в основном тяги и межклеточные стрессоры. Наш протокол применим к широкому спектру патофизиологических процессов, таких как метастазы рака, атеросклероз и гипертония, например.Наши методы могут быть интегрированы для выполнения как биохимического, так и биомеханического анализа с моделями орган-на-чипе, биоинженерных тканевых конструкций, систем доставки лекарств in vitro и систем совместной культуры тканей. Наш протокол довольно прост в работе. Тем не менее, мы советуем тем, кто делает этот протокол в первый раз, чтобы иметь терпение и не спешить через шаги этого протокола.Наш протокол имеет уникальные шаги, которые могут быть не ясны для пользователей, впервые. Поэтому мы призываем пользователей следовать нашим письменным пошаговим процедурам и использовать визуальные демонстрации в качестве руководства. Для начала приготовьте слепо-силановый раствор, смешивая 200 миллилитров ультра чистой воды с 80 микролитров уксусной кислоты и 50 микролитров силанового метакрилата.Перемешать раствор Bind-silane на тарелке перемешать, по крайней мере один час. Относитесь к центру хорошо чашки Петри с раствором Bind-silane в течение 45 минут. Удалите раствор Bind-silane и промойте чашку Петри ультра чистой водой два-три раза.Высушите поверхность чашки Петри и храните при комнатной температуре для дальнейшего использования. Для приготовления гидрогельного раствора смешайте 12,49 миллилитров ультра чистой воды до 2,062 миллилитров 40%акриламида и 375 микролитров 2%бисакриламида в 15-миллилитровой центрифуге трубки. Добавьте в раствор гидрогеля 80 микролитров флуоресцентных бусин.Аккуратно встряхните трубку, чтобы смешать бисер с раствором геля. Держите крышку свободно на центрифуге трубки и поместите его в вакуумную камеру. Де-газ гель раствор, по крайней мере 45 минут в вакуумной камере.Для полимеризации гидрогеля сначала добавьте 75 микролитров 10%аммония персульфата, а затем добавьте восемь микролитров TEMED в раствор гидрогеля. Поместите 24 микролитров гидрогеля в центр чашки Петри. Нажмите на гидрогель с 18-миллиметровым крышкой скольжения, чтобы сгладить гидрогель и сделать высоту около 100 микрометров.Подождите, по крайней мере от 30 до 40 минут для полимеризации геля. Погрузите полимеризованный гидрогель в ультра чистую воду, чтобы предотвратить обезвоживание геля. Обложка Петри блюдо с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотоотбел флуоресцентные бусы и хранить при четырех градусах по Цельсию.Во-первых, смешать pdMS силиконовой базы с силиконовым лечебным агентом в соотношении 20 к одному в 50-миллилитровой центрифуги трубки. Переверните трубку вверх дном и встряхните энергично несколько раз, чтобы обеспечить правильное смешивание решения PDMS. Удалите пузырьки в растворе PDMS путем центрифугирования в течение одной минуты при 190 раз G.Pour пять-шесть миллилитров раствора PDMS в центре 100-миллиметровой чашки Петри и агитировать блюдо, пока pdMS решение охватывает всю поверхность чашки Петри.Лечить pdMS решение на ночь при 50 до 60 градусов по Цельсию. Затем удалите круговой трафарет PDMS диаметром 16 миллиметров с помощью перфоратора отверстия. Используйте биопсию диаметром 1,25 миллиметра для создания небольших отверстий в трафарете PDMS.Стерилизовать ТРАфареты PDMS путем погружения их в 70% этанола в течение двух-трех минут, аспирации от избыточного этанола, а затем размещение под ультрафиолетовым светом в течение пяти минут. Аспирировать излишки жидкости и удалить крышку скольжения из гидрогеля. Поместите трафарет PDMS на поверхность гидрогеля и используйте пинцет, чтобы применить световое давление к трафарету PDMS, чтобы обеспечить водонепроницаемое уплотнение между трафаретом PDMS и поверхностью гидрогеля.Обложка поверхности гидрогеля с Сульфо-SAMPA растворяется в 0,1 молярного hePES буферного раствора в концентрации от одного до 1000 и место гидрогеля под УЛЬТРА лампы с мощностью 36 Вт в течение восьми минут. Аспирировать избыток раствора Sulfo-SAMPA и HEPES и промыть гидрогель дважды 0,1 моляра HEPES с последующими двумя полосканиями с ультра чистой водой. Аспирировать избыток ультра чистой воды и использовать 200-микролитровую пипетку, чтобы покрыть гидрогель с 0,1 миллиграмма на миллилитр коллагена-1.Обложка блюдо для защиты флуоресцентных бусин от фотоотбела и хранить гидрогель при четырех градусах по Цельсию на ночь. Теперь добавьте три миллилитров 1X трипсина в колбу и поместите его в инкубатор при 37 градусах по Цельсию в течение трех-пяти минут, чтобы отделить клетки от колбы культуры тканей. После трипсинизации, добавить три миллилитров клеточной культуры средств массовой информации в колбу, вихрь, чтобы смешать, и передать смесь в 15-миллилитровую центрифугу трубки.Центрифуга клеточного раствора в течение трех минут в 1, 710 раз G.Aspirate супернатант и повторно приостановить клетки в средствах массовой информации до концентрации 50 раз 10 до четырех клеток на миллилитр. Вынюхив гидрогель блюдо из холодильника. Удалить коллаген-1 из гидрогеля и промыть один раз с PBS.Добавьте 75 раз 10 к третьим клеткам в верхней части трафарета PDMS и позвольте клеткам прикрепляться к поверхности гидрогеля в течение по крайней мере одного часа в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе. Удалите трафарет PDMS и погрузите трафарет PDMS в 10X трипсин в течение 10 до 15 секунд, чтобы удалить любые прикрепленные клетки. Добавить по крайней мере два миллилитров средств массовой информации в чашку Петри и стерилизовать трафарет путем распыления с 70% этанола, а затем размещение под ультрафиолетовым светом в течение пяти минут.Поместите чашку Петри в инкубатор, по крайней мере 36 часов, или до тех пор, пока слияние монослой наблюдается. Сравнивались фазовые контрастные изображения за 30 минут до лечения халконом и через два часа после лечения халконом. Клеточные перемещения бисера наблюдались для уменьшения как низких доз чалкона, так и высокодозных условий чалкона по сравнению с монослойными HUVEC.До лечения chalcone, RMS тяги были около 51 Паскаль для всех условий. После лечения chalcone, было небольшое увеличение RMS тяги до 59 Паскаль в низких дозах chalcone лечение монослой и почти в два раза снижение RMS тяги до 18 Паскаль в высоких дозах chalcone лечение монослой по сравнению с контролем. Лечение Chalcone увеличило среднюю нормальную межклеточную величину стресса с низкой дозой, но значительно уменьшило среднюю нормальную межклеточную величину стресса с высокой дозой по сравнению с контролем.Обработка chalcone также уменьшила максимальные отвесные межклеточные усилия на и низкой и высокой концентрации chalcone сравненной к управлению. Влияние лечения халкона является статистически значимым на основе как Т-тестов, так и одного фактора ANOVA теста. При размещении трафарета PDMS на верхней части геля, убедитесь, что гель достаточно сухой, чтобы обеспечить водонепроницаемый уплотнение между трафаретом PDMS и гель.Этот протокол также может быть применен для зондирования биомеханического вклада различных клеточных соединений, цитоскелетных белков, молекул адгезии клеточной матрицы или внеклеточных молекул с живой визуализацией. С помощью этого протокола in vitro, исследователи теперь могут успешно исследовать множество биомеханических, а также биохимические свойства во время ремонта тканей, заживление ран, или метастазы рака без животной модели. Мы советуем нашим зрителям быть очень осторожными при обработке chalcone и DMSO, как вдыхание этих препаратов, как сообщается, вредно.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Воссоздание нуклеосом с Дифференциально меченый изотопом побратимов гистонов

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-МС / МС для углубленной характеризации и Количественный глутамин и аспарагин Дезамидирование в Shotgun протеомике

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Биохимических и структурных характеристик углеводный транспорта субстрата белок-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Структурные характеристики Маннан полисахаридов клеточной стенки в растений с использованием ПАСЕ

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Калибровка бесплатно в Vitro количественная оценка белка гомо олигомеризации с использованием коммерческих приборов и свободным, открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа яркости

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Изменение бакуловирусы векторы выражения производить выделяется растительных белков в клетках насекомых

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Структурные исследования макромолекул в решения с помощью небольшой угол рентгеновского рассеяния

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Анализ данных SEC-SAXS с помощью деконволюции и рассеяния EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Кристаллизация и структурное определение фермента: Субстратный комплекс по серийной кристаллографии в универсальном микрофлюидной чипе

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Быстрая подготовка сетки для криоэлектроно-микроскопии с временным разрешением

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...