Name: perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por los fondos de la Start-up de la Universidad de Florida Central y el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre del Instituto Nacional de Salud bajo el premio K25HL132098.

1. Fabricación de geles de poliacrilamida (PA)
<ol><li>
Preparación de plato de Petri
	<ol>
<li>Preparar la solución de silano de unión mezclando 200 ml de agua ultrapura con ácido acético de 80 ml y 50 s de metacrilato de propilo de 3(trimetoxisilo). Bind silane es una solución utilizada para funcionalizar la superficie de la placa Petri inferior de vidrio para la fijación de hidrogel.</li>
		<li>Agitar la solución de silano de unión en una placa de agitación durante al menos 1 h.</li>
		<l...

<ol>
	<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Colin-York, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+(STFM).">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+stress+reconstitution+from+traction+force+data.">Intercellular stress reconstitution from traction force data.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).</li><li>Islam, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear,+intercellular+stress,+and+endothelial+cell+alignment.">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+forces:+a+useful+parameter+in+cancer+research.">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li><li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues.">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li><li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation.">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces.">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li><li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption.">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).</li><li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function.">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li><li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions.">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li><li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family.">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li><li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall.">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li><li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+phosphorylation+in+brain,+cardiac,+endothelial+and+epithelial+tissues.">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li><li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice.">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li><li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis.">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',5'-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation.">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li><li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+cytotoxicity+of+2,5-dihydroxychalcones+and+related+compounds.">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li></ol>

Nuestro grupo, así como otros, ha estado utilizando con éxito TFM y MSM para sondear la influenciade las uniones celulares en diversos procesos celulares patológicos y fisiológicos in vitro7,15,18,27 . Por ejemplo, Hardin et al. presentaron un estudio muy perspicaz que sugiere que la transmisión de tensión intercelular guía la formación de brechas paracelulares en las células endotelia...

El campo que se refiere al estudio de los efectos de las fuerzas físicas y de las propiedades mecánicas en la fisiología celular y tisular y la patología se conoce como mecanobiología1. Algunas técnicas útiles que se han utilizado en la mecanobiología son la microscopía de tensión monocapa y la microscopía de fuerza de tracción. La microscopía de fuerza de tracción permite el cálculo de las tracciones generadas en la interfaz célula-sustrato, mientras que la microscopía de tensión monocapa permite el cálculo de tensiones intercelulares generadas entre células adyacentes dentro de una monocapa2 ,3,4,5,6. Los resultados obtenidos de métodos anteriores han sugerido que las tensiones mecánicas derivadas de células desempeñan un papel crucial en la determinación del destino de una serie de procesos celulares3,4,5. Por ejemplo, al exponerse a una fuerza mecánica externa, un grupo de células que migran como colectivo puede alterar su morfología y polarizar su forma para alinear y migrar a lo largo de la dirección de la fuerza aplicada, en parte, generando tracción7, 8. Las tracciones proporcionan una métrica que se puede utilizar para evaluar la contractilidad celular y se calculan mediante microscopía de fuerza de tracción (TFM). La microscopía de fuerza de tracción (TFM) comienza con la determinación de deformaciones de sustrato inducidas por células seguidas por el cálculo del campo de tracción utilizando un enfoque computacional matemáticamente riguroso y basado en la mecánica. Dado que la capacidad de calcular las tracciones ha existido durante bastante tiempo, los investigadores han utilizado TFM para revelar el impacto que las tracciones tienen en una serie de procesos, incluyendo el cáncer9,la cicatrización de heridas10 y la evaluación de tejido11.
La implementación de TFM y MSM juntos se puede dividir en tres pasos esenciales que deben ejecutarse en el siguiente orden: primero, se determinan las deformaciones de hidrogel producidas por las células; en segundo lugar, las tracciones se recuperan de las deformaciones de hidrogel; y en tercer lugar, se utiliza un enfoque de elementos finitos para calcular tensiones intercelulares normales y cortantes dentro de toda la monocapa. Para calcular los desplazamientos de gel, las imágenes de perlas de fluorescencia con células se compararon con la imagen del cordón de referencia (sin celdas) mediante una rutina de velocimetría de imagen de partículas (PIV) escrita a medida. El tamaño de la ventana de correlación cruzada y la superposición para el análisis PIV se eligieron para ser de 32 x 32 píxeles y 0,5, respectivamente. En este momento, los cambios de píxeles se convirtieron en micras multiplicando con un factor de conversión de píxel a micra (para nuestro microscopio, este factor de conversión es 0,65) para obtener desplazamientos en el plano. Los errores asociados con ignorar desplazamientos fuera del plano son insignificantes12,13. Después del cálculo de los desplazamientos de gel, hay dos tipos de mediciones de tracción que se pueden utilizar, tracciones restringidas y tracciones sin restricciones8,14. Las tracciones sin restricciones proporcionan el campo de tracción para todo el campo de visión (incluidas las regiones con y sin celdas), mientras que las tracciones restringidas proporcionan el campo de tracción solo para las regiones que incluyen las celdas14. A continuación, las tensiones intercelulares se calculan mediante microscopía de tensión monocapa (MSM), que es una extensión de la microscopía de fuerza de tracción. La implementación de MSM se basa en la suposición de que las tracciones locales ejercidas por una monocapa de células en la interfaz célula-sustrato deben equilibrarse mediante fuerzas mecánicas transmitidas entre células en la interfaz de células celulares según lo exigido por las leyes 7 de Newton ,12,13. Una suposición clave aquí es que la monocapa de celda se puede tratar como una hoja elástica delgada porque se conoce la distribución de tracción en la monocapa y el equilibrio de fuerza no depende de las propiedades del material celular. Otra suposición clave es que las fuerzas de tracción están equilibradas por tensiones intercelulares locales dentro del campo de visión óptico (dentro de la monocapa) y la influencia de este equilibrio de fuerza es mínima en la región distal (fuera de la monocapa)13. Por lo tanto, las condiciones límite definidas por tensiones intercelulares, desplazamientos o una combinación de ambos en el límite monocapa son cruciales para realizar MSM13. Teniendo en cuenta la información anterior, utilizamos MSM para realizar un análisis de elementos finitos (FEM) para recuperar la tensión principal máxima(máx.)y la tensión principal mínima(min)girando el plano de tensión en cada punto dentro del Monocapa. Estas tensiones principales se utilizan posteriormente para calcular la tensión intercelular normal promedio 2D [((max + ?min) /2] y la tensión intercelular de cizallamiento máxima 2D [(máx. -min) /2] dentro de toda la monocapa 12,13. Este procedimiento es descrito con más detalle por Tambe et al.12,13
La microscopía de tensión monocapa (MSM) permite el cálculo de tensiones intercelulares de células celulares generadas dentro de una monocapa6,7,8,12,13. Estas tensiones intercelulares se han sugerido para ser importantes para el crecimiento y reparación de tejidos, cicatrización de heridas, y metástasis de cáncer12,15,16,17. Además, se ha sugerido que las tensiones intercelulares también son importantes en la migración de células endoteliales y la función de barrera endotelial17,18. Mientras que las uniones de células celulares tales como uniones estrechas y uniones adheridas han sido sugeridas para desempeñar un papel crítico en la generación y transmisión de estrés intercelular endotelial, el papel de las uniones de separación sigue siendo esquivo. Las uniones de brecha conectan físicamente las células adyacentes y proporcionan una vía para que la corriente eléctrica y las moléculas (<1 KDa) pasen entre las células vecinas19,20,21. Aunque las células endoteliales expresan las uniones de brecha Cx37, Cx40 y Cx4319,22, Cx43 es posiblemente la más importante en términos de progresión de la enfermedad23. La evidencia de la importancia de Cx43 se puede encontrar en el hecho de que la eliminación genética de Cx43 en ratones resulta en hipotensión24 y tiene efectos adversos sobre la angiogénesis25. Además, se ha documentado que Cx43 es importante para la migración y proliferación celular y para la progresión de la aterosclerosis18,22,23,24,25 .
En este protocolo, utilizamos TFM y MSM para investigar si la tracción y la generación de tensión intercelular dentro del confluente, monocapa endotelial se vería afectada por la interrupción de la unión de brecha endotelial Cx43. Interrumpimos Cx43 con 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), una molécula documentada para inhibir cx43 expresión26. Chalcone se utilizó para interrumpir Cx43 en lugar de siRNA como chalcone ha sido reportado previamente por Lee y otros para interrumpir la expresión26de Cx43. Además, estábamos particularmente interesados en la influencia de chalcone en el endotelio, ya que también se ha informado de que es un compuesto antiinflamatorio y antiplaquetario que potencialmente se puede utilizar para la prevención y el tratamiento de varios vasculares patologías26. Los tratamientos de Chalcone se realizaron una hora después del inicio del experimento, se tomaron imágenes monocapas tratadas con chalcone durante un total de seis horas, y el procesamiento de imágenes se realizó con un código MATLAB escrito a medida para determinar las tracciones y, posteriormente, intercelulares Tensiones. Nuestros resultados mostraron una disminución general en las tracciones y tensiones intercelulares, lo que sugiere que Cx43 desempeña un papel clave en la biomecánica endotelial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td>Essential to flatten polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bis-acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610143</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8242;,5&#8242;-Dihydroxychalcone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>IDF00046</td>
			<td>To disrupt Cx43 structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2530-85-0</td>
			<td>Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Essential to make bind saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog # A-11001</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610700</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>To make blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005-100ML</td>
			<td>Use as a extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td>Buffer Saline needed for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>To dissolve chalcone and make stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8812</td>
			<td>0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Essential to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LVES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1460801</td>
			<td>Essential HUEVC media 200 supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M200500</td>
			<td>Essential media for HUVEC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog #13-8300</td>
			<td>Primary antibody for Cx43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm dia)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-20-1.5H</td>
			<td>35 mm petri dish with a 20 mm center well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td>102568-43-4</td>
			<td>Essential to functionalize polyacrylamide gel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW corning</td>
			<td>2646340</td>
			<td>Silicon elastomer with curing agent to make PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610801</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>To permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Used to detach cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption

Las células endoteliales se han establecido para generar tensiones y tracción intercelulares, pero actualmente se desconoce el papel que desempeñan las uniones de brecha en la generación de tensión y tracción intercelular endotelial. Por lo tanto, presentamos aquí un protocolo basado en la mecánica para sondear la influencia de la unión de brecha connexina 43 (Cx43) tiene en la biomecánica endotelial mediante la exposición de monocapas endoteliales confluentes a un conocido inhibidor Cx43 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) y medir el impacto que este inhibidor tiene en las tracciones y tensiones intercelulares. Presentamos resultados representativos, que muestran una disminución en las tracciones y tensiones intercelulares bajo una dosis alta de chalcone (2 g/ml) en comparación con el control. Este protocolo se puede aplicar no sólo a Cx43, sino también a otros cruces de separación, suponiendo que se utilice el inhibidor adecuado. Creemos que este protocolo será útil en los campos de la investigación cardiovascular y mecanobiología.

Las imágenes de contraste de fase de control, 0,2 g/ml y 2 monocapas tratadas con chalcono de g/ml se tomaron 30 minutos antes del tratamiento con chalcone(Figura 1A-C)y 2 horas después del tratamiento con chalcone(Figura 1D-F). Se observó que los desplazamientos de perlas inducidos por células (m) disminuyeron tanto en condiciones de chalcona de dosis baja como de alta dosis de chalcona<stro...

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Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Aquí, presentamos un protocolo basado en la mecánica para interrumpir la conexión de separación de la conexión 43 y medir el impacto posterior que esto tiene en la biomecánica endotelial a través de la observación de tracciones y tensiones intercelulares.

Biomecánica endotelial perturbando a través de Connexin 43 Interrupción Estructural

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Este protocolo es significativo, ya que permite el esclarecido del papel que desempeñan las fuerzas celulares en muchos procesos fisiológicos y patológicos, como la cicatrización de heridas y las metástasis del cáncer, por ejemplo. La principal ventaja de esta técnica basada en la mecánica es su capacidad para interrumpir simultáneamente las uniones de células celulares y medir su impacto en las fuerzas mecánicas generadas por células, principalmente tracción y factores de estrés intercelulares. Nuestro protocolo es aplicable a una amplia gama de procesos fisiopatológicos, como metástasis de cáncer, aterosclerosas e hipertensión, por ejemplo.Nuestros métodos se pueden integrar para realizar análisis bioquímicos y biomecánicos con modelos de órgano en chip, construcciones de tejidos bio-ingeniería, sistemas de administración de fármacos in vitro y sistemas de cultivo de tejidos. Nuestro protocolo es bastante sencillo de realizar. Sin embargo, aconsejamos a aquellos que hacen este protocolo por primera vez que tengan paciencia y no se apresuren a través de los pasos de este protocolo.Nuestro protocolo tiene pasos únicos que pueden no ser claros para los usuarios por primera vez. Por lo tanto, animamos a los usuarios a seguir nuestros procedimientos paso a paso escritos y usar demostraciones visuales como guía. Para empezar, prepare la solución de cido-siano ciego mezclando 200 mililitros de agua ultra pura con 80 microlitros de ácido acético y 50 microlitros de metacrilato de silano.Revuelva la solución de Bind-silane en una placa de agitación durante al menos una hora. Trate bien el centro de un plato de Petri con la solución Bind-silane durante 45 minutos. Retire la solución de Bind-silane y enjuague el plato Petri con agua ultra pura de dos a tres veces.Seque la superficie de la placa Petri y guárdela a temperatura ambiente para su uso futuro. Para preparar la solución de hidrogel, mezcle 12,49 mililitros de agua ultra pura a 2,062 mililitros de 40% de acrilamida y 375 microlitros de 2% bisacrilamida en un tubo centrífugo de 15 mililitros. Añadir 80 microlitros de perlas fluorescentes a la solución de hidrogel.Agitar suavemente el tubo para mezclar las perlas con la solución de gel. Mantenga la tapa suelta en el tubo de la centrífuga y colóquela en una cámara de vacío. Desa gasear la solución de gel durante al menos 45 minutos en la cámara de vacío.Para polimerizar el hidrogel, primero agregue 75 microlitros de 10% persulfo de amonio y luego agregue ocho microlitros de TEMED a la solución de hidrogel. Coloque 24 microlitros de la solución de hidrogel en el centro de la placa Petri. Presione sobre el hidrogel con un resbalón de cubierta de 18 milímetros para aplanar el hidrogel y hacer una altura de aproximadamente 100 micrómetros.Espere al menos de 30 a 40 minutos para la polimerización de gel. Sumerja el hidrogel polimerizado en agua ultra pura para evitar la deshidratación del gel. Cubra el plato Petri con papel de aluminio para evitar el fotoblanda de cuentas fluorescentes y guárdelo a cuatro grados centígrados.En primer lugar, mezcle la base de silicona PDMS con el agente de curado de silicona en una proporción de 20 a uno en un tubo centrífugo de 50 mililitros. Invierta el tubo boca abajo y agite vigorosamente varias veces para garantizar una mezcla adecuada de la solución PDMS. Retire las burbujas de la solución PDMS centrifugando durante un minuto a 190 veces G.Pour cinco a seis mililitros de la solución PDMS en el centro de un plato Petri de 100 milímetros y agitar el plato hasta que la solución PDMS cubra toda la superficie de la placa Petri.Cure la solución PDMS durante la noche a 50 a 60 grados centígrados. A continuación, elimine una plantilla blanca PDMS de 16 milímetros de diámetro con un perforador. Utilice un punzón de biopsia de 1,25 milímetros de diámetro para crear pequeños agujeros en la plantilla PDMS.Esterilice las plantillas de PDMS sumergiéndolas en un 70% de etanol durante dos o tres minutos, aspirando el exceso de etanol y luego colocándolas bajo una luz UV durante cinco minutos. Aspirar cualquier exceso de líquido y retirar el resbalón de la cubierta del hidrogel. Coloque la plantilla PDMS en la superficie del hidrogel y utilice pinzas para aplicar presión ligera a la plantilla PDMS para garantizar un sello hermético entre la plantilla PDMS y la superficie del hidrogel.Cubra la superficie del hidrogel con Sulfo-SAMPA disuelto en una solución tampón HEPES molar 0.1 a una concentración de uno a 1.000 y coloque el hidrogel bajo una lámpara UV con una potencia de 36 vatios durante ocho minutos. Aspirar el exceso de solución de Sulfo-SAMPA y HEPES y enjuagar el hidrogel dos veces con 0,1 HEPES molar seguido de dos enjuagues adicionales con agua ultra pura. Aspirar el exceso de agua ultra pura y utilizar una pipeta de 200 microlitros para recubrir el hidrogel con 0,1 miligramos por mililitro de colágeno-1.Cubra el plato para proteger las cuentas fluorescentes de la fotoblancada y almacene el hidrogel a cuatro grados centígrados durante la noche. Ahora, agregue tres mililitros de 1X de tripsina en el matraz y colóquelo en la incubadora a 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos para separar las células del matraz de cultivo de tejido. Después de la tripinación, agregue tres mililitros de medios de cultivo celular en el matraz, gire para mezclar y transfiera la mezcla a un tubo centrífugo de 15 mililitros.Centrifugar la solución celular durante tres minutos a 1, 710 veces G.Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en medios a una concentración de 50 veces 10 a las cuatro células por mililitro. Saca el plato de hidrogel del refrigerador. Retire el colágeno-1 del hidrogel y enjuague una vez con PBS.Agregue 75 veces 10 a las terceras celdas a la parte superior de la plantilla PDMS y permita que las células se adhieran a la superficie del hidrogel durante al menos una hora en la incubadora a 37 grados Centígrados y 5% dióxido de carbono. Quite la galería de símbolos de PDMS y sumerja la galería de símbolos de PDMS en 10X Trypsin durante 10 a 15 segundos para eliminar las celdas conectadas. Agregue al menos dos mililitros de medios a la placa Petri y esterilizar la plantilla rociando con 70% de etanol, y luego colocándolo debajo de la luz UV durante cinco minutos.Coloque el plato Petri en la incubadora durante al menos 36 horas, o hasta que se observe una monocapa confluente. Se compararon imágenes de contraste de fase de 30 minutos antes del tratamiento con chalcona y dos horas después del tratamiento con chalcona. Se observó que los desplazamientos de perlas inducidos por células disminuyen tanto en condiciones de chalcona en dosis bajas como en condiciones de chalcono en dosis altas en comparación con el control de las monocapas de HUVEC.Antes del tratamiento con chalcona, las tracciones RMS eran alrededor de 51 Pascals para todas las condiciones. Después del tratamiento con chalcona, hubo un pequeño aumento en las tracciones RMS a 59 Pascals en monocapas tratadas con chalcona en dosis bajas y una disminución casi doble en las tracciones RMS a 18 Pascals en monocapas tratadas con chalcono en dosis altas en comparación con el control. El tratamiento con Chalcone aumentó la magnitud media del estrés intercelular normal con dosis bajas, pero disminuyó significativamente la magnitud media de tensión intercelular normal con dosis altas en comparación con el control.El tratamiento con chalcona también disminuyó las tensiones intercelulares escuetas máximas a baja y alta concentración de chalcona en comparación con el control. El impacto del tratamiento con chalcona es estadísticamente significativo basado en pruebas T y pruebas ANOVA de factor único. Al colocar la plantilla PDMS encima del gel, asegúrese de que el gel esté lo suficientemente seco como para garantizar un sello hermético entre la plantilla PDMS y el gel.Este protocolo también se puede aplicar para sondear la contribución biomecánica de una variedad de uniones de células celulares, proteínas citoesqueléticas, moléculas de adhesión de matriz celular o moléculas extracelulares con imágenes vivas. Con este protocolo in vitro, los investigadores ahora pueden investigar con éxito una serie de propiedades biomecánicas, así como bioquímicas durante la reparación de tejidos, la cicatrización de heridas o las metástasis de cáncer sin modelo animal. Aconsejamos a nuestros espectadores a ser muy cuidadosos durante el manejo de chalcone y DMSO como inhalación de estos medicamentos se divulga para ser perjudicial.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

La reconstitución de los nucleosomas con histonas hermanas marcadas con isótopos diferencialmente

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Investigación

Bioquímica

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS para la caracterización en profundidad y cuantificación de glutamina y asparagina desamidación en escopeta Proteómica

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Caracterización bioquímica y estructural de la SP0092 de proteína de unión a sustrato de transporte de hidratos de carbono

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Caracterización estructural de polisacáridos de pared celular mananos en plantas con ritmo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Estudios estructurales de las macromoléculas en solución mediante dispersión de rayos-x de ángulo pequeño

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Análisis de los datos de la SEC-SAXS a través de la desconvolución y dispersión de EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Cristalización y determinación estructural de una enzima: complejo de sustratos por cristalografía serie en un chip microfluídico versátil

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Preparación rápida de la rejilla para la crio-microscopía electrónica resuelta en el tiempo

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...