Name: perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

Detta arbete stöddes av University of Central Florida start-up fonder och National Heart, lung, och Blood Institute i National Institute of Health under Award K25HL132098.

1. göra polyakrylamid (PA) geler
<ol><li>
Beredning av petriskål
	<ol>
<li>Bered bind silan-lösning genom att blanda 200 ml ultrarent vatten med 80 μl ättiksyra och 50 μl av 3-(Trimetoxysilyl) propylmetakrylat. Bind silan är en lösning som används för att funktionalisera glaset botten petriskål skålen för hydrogel kvarstad.</li>
		<li>Rör om bind silan-lösningen på en rör platta i minst 1 h.</li>
		<li>Behandla centrum väl av petriskål med BIND silan lösning för 45 min.</li>
		<li>...

<ol>
	<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Colin-York, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+(STFM).">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+stress+reconstitution+from+traction+force+data.">Intercellular stress reconstitution from traction force data.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).</li><li>Islam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Experimental+Methods+of+Cellular+Force+Sensing.">Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing.</a> Biomedical Journal of Science &amp; Technical Research. 17 (3), (2019).</li><li>Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear,+intercellular+stress,+and+endothelial+cell+alignment.">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+forces:+a+useful+parameter+in+cancer+research.">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li><li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues.">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li><li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation.">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces.">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li><li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption.">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).</li><li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function.">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li><li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions.">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li><li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family.">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li><li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall.">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li><li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+phosphorylation+in+brain,+cardiac,+endothelial+and+epithelial+tissues.">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li><li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice.">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li><li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis.">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',5'-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation.">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li><li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+cytotoxicity+of+2,5-dihydroxychalcones+and+related+compounds.">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li></ol>

Vår grupp, liksom andra, har framgångsrikt använt TFM och MSM för att söka påverkan av cell-cell korsningar i olika patologiska och fysiologiska cellulära processer in vitro-7,15,18,27 . Till exempel presenterade Hardin et al. en mycket insiktsfull studie som antyder intercellulära stress överföring guider paracellulär gap formation i endotelceller15. Även om...

Det fält som hänvisar till studiet av effekterna av fysikaliska krafter och av mekaniska egenskaper på cellulär och vävnadfysiologi och patologi kallas Mekanobiologi1. Några användbara tekniker som har utnyttjats i Mekanobiologi är enskiktslager stressmikroskopi och dragkraft mikroskopi. Traction Force mikroskopi möjliggör beräkning av Tractions genereras vid cell-substrat gränssnitt, medan enskiktslager stress mikroskopi möjliggör beräkning av intercellulära påfrestningar som genereras mellan angränsande celler i ett enskiktslager2 ,3,4,5,6. Resultat som framkommit från tidigare metoder har föreslagit att cell-härledda mekaniska spänningar spelar en avgörande roll för att fastställa ödet för en mängd cellulära processer3,4,5. Till exempel, vid exponering för en extern mekanisk kraft, en grupp av celler som migrerar som ett kollektiv kan förändra deras morfologi och polarisera deras form för att anpassa och migrera längs riktningen av tillämpad kraft genom att delvis generera Tractions7, 8. Tractions ger ett mått som kan användas för att utvärdera cell kontraktilitet och beräknas med hjälp av dragkraft mikroskopi (TFM). Traction Force mikroskopi (TFM) börjar med bestämning av cell-inducerad substrat deformationer följt av beräkningen av dragkraft fältet med hjälp av en matematiskt rigorös, mekanik-baserade beräkningsmetoder. Eftersom förmågan att beräkna Tractions har funnits under ganska lång tid, forskare har utnyttjat TFM att avslöja effekterna Tractions har på en mängd processer, inklusive cancer9, sårläkning10 och bedömning av konstruerade hjärt vävnad11.
Genomförandet av TFM och MSM tillsammans kan delas in i tre viktiga steg som måste utföras i följande ordning: för det första bestäms de hydrogel-deformationer som produceras av cellerna. andra, Tractions återvinns från hydrogel deformationer; och för det tredje, en finita element metod används för att beräkna normala och skjuvning intercellulära påfrestningar inom hela monolayer. För att beräkna gel förskjutningar, fluorescens pärla bilder med celler jämfördes med referens pärla bilden (utan celler) med hjälp av en skräddarsydd partikel bild Velocimetry (PIV) rutin. Kors korrelations fönstrets storlek och överlappning för PIV-analys valdes till 32 x 32 pixlar respektive 0,5. Vid denna tid, pixel förskjutningar omvandlades till mikrometer genom att multiplicera med en pixel-till-micron omvandlingsfaktor (för vårt Mikroskop, denna omvandlingsfaktor är 0,65) för att få in-plane förskjutningar. Fel i samband med ignorera out-of-Plane förskjutningar är försumbar12,13. Efter uträkning av gel förskjutningar, finns det två typer av dragkrafts mätningar som kan utnyttjas, begränsade Tractions och oinskränkt Tractions8,14. Oinskränkt Tractions ger dragkraft fältet för hela synfält (inklusive regioner med och utan celler), medan begränsade Tractions ger dragkraft fältet endast för regioner som innehåller celler14. Sedan, intercellulära påfrestningar beräknas med hjälp av enskiktslager stress mikroskopi (MSM), som är en förlängning av dragkraft mikroskopi. Genomförandet av MSM bygger på antagandet att lokala Tractions utövas av en enskiktslager av celler vid cell-substrat gränssnitt måste balanseras av mekaniska krafter överförs mellan celler vid cell-cell-gränssnittet som krävs av Newtons lagar7 ,12,13. Ett avgörande antagande här är att cellen enskiktslager kan behandlas som ett tunt elastiskt ark eftersom dragkraft distributionen i enskiktslager är känd och kraften balansen inte beror på cell materialegenskaper. En annan viktig förutsättning är att drag krafterna balanseras av lokala intercellulära påfrestningar inom det optiska synfält (inom monolayer) och påverkan av denna kraftbalansen är minimal i distala regionen (utanför monolayer)13. Därför är de gräns förhållanden som definieras av intercellulära spänningar, förskjutningar eller en kombination av båda vid enskiktslager gränsen avgörande för att utföra MSM13. Med hänsyn till ovanstående information, vi använder MSM för att utföra en finita element analys (FEM) för att återvinna den maximala huvudsakliga stressen (σMax) och minsta huvudsakliga stress (σmin) genom att rotera stress planet vid varje punkt i enskiktslager. Dessa huvudsakliga spänningar används därefter för att beräkna den 2D genomsnittliga normala intercellulära spänningen [(σMax + σmin)/2] och 2D maximal skjuvning intercellulära spänning [(σMax -σmin)/2] inom den hela enskiktslager 12,13. Denna procedur beskrivs mer detaljerat av tambe et al.12,13
Enskiktslager stress mikroskopi (MSM) möjliggör beräkning av cell-cell intercellulära påfrestningar som genereras inom ett enskiktslager6,7,8,12,13. Dessa intercellulära spänningar har föreslagits vara viktigt för vävnad tillväxt och reparation, sårläkning, och cancermetastaser12,15,16,17. Dessutom, intercellulära spänningar har föreslagits att också vara viktiga i endotelceller cell migration och endotelceller barriärfunktion17,18. Medan cell-cell korsningar såsom snäva korsningar och anhängare korsningar har båda föreslagits för att spela en kritisk roll i endotelceller intercellulära stress generation och transmission, den roll som gap korsningar förblir svårfångade. Gap korsningar fysiskt ansluta angränsande celler och ge en väg för elektrisk ström och molekyler (< 1 kDa) att passera mellan angränsande celler19,20,21. Även endotelceller uttrycka Cx37, Cx40, och Cx43 gap korsningar19,22, Cx43 är utan tvekan den viktigaste när det gäller sjukdomsprogression23. Bevis på Cx43's betydelse kan hittas i det faktum att genetisk radering av Cx43 hos möss resulterar i hypotoni24 och har negativa effekter på angiogenes25. Dessutom har Cx43 dokumenterats för att vara viktigt för cell migration och proliferation och i utvecklingen av åderförkalkning18,22,23,24,25 .
I detta protokoll använde vi TFM och MSM för att undersöka om dragkraft och intercellulära spännings generering inom det konflytande, endoteliala enskiktslager skulle påverkas av störningen av endotelceller gap Junction Cx43. Vi störde Cx43 med 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), en molekyl som dokumenterats för att hämma Cx43 uttryck26. Chalkon användes för att störa Cx43 istället för siRNA eftersom Chalkon tidigare har rapporterats av Lee et al. för att störa Cx43 Expression26. Dessutom var vi särskilt intresserade av chalcone inflytande på endotelet eftersom det har också rapporterats vara en anti-inflammatorisk och trombocythämmande förening som potentiellt kan användas för att förebygga och behandla olika vaskulära patologier26. Chalcone behandlingar utfördes en timme efter försöket debut, chalcone-behandlade enskiktslager var avbildade i totalt sex timmar, och bildbehandling utfördes med en skräddarsydd MATLAB-kod för att bestämma Tractions och därefter intercellulära Betonar. Våra resultat visade en generell minskning av Tractions och intercellulära spänningar, vilket tyder Cx43 spelar en nyckelroll i endotelceller biomekanik.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td>Essential to flatten polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bis-acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610143</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8242;,5&#8242;-Dihydroxychalcone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>IDF00046</td>
			<td>To disrupt Cx43 structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2530-85-0</td>
			<td>Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Essential to make bind saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog # A-11001</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610700</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>To make blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005-100ML</td>
			<td>Use as a extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td>Buffer Saline needed for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>To dissolve chalcone and make stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8812</td>
			<td>0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Essential to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LVES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1460801</td>
			<td>Essential HUEVC media 200 supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M200500</td>
			<td>Essential media for HUVEC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog #13-8300</td>
			<td>Primary antibody for Cx43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm dia)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-20-1.5H</td>
			<td>35 mm petri dish with a 20 mm center well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td>102568-43-4</td>
			<td>Essential to functionalize polyacrylamide gel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW corning</td>
			<td>2646340</td>
			<td>Silicon elastomer with curing agent to make PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610801</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>To permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Used to detach cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption

Endotelceller har etablerats för att generera intercellulära spänningar och Tractions, men roll gapet korsningar spela i endotelceller intercellulära stress och Traction generation är för närvarande okänd. Därför presenterar vi här ett mekaniskbaserat protokoll för att söka påverkan av gap Junction Connexin 43 (Cx43) har på endotelceller biomekanik genom att exponera konfluenta endotelceller enskiktslager till en känd Cx43 hämmare 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) och mäta effekten denna hämmare har på Tractions och intercellulära spänningar. Vi presenterar representativa resultat, som visar en minskning av både Tractions och intercellulära spänningar under en hög Chalkon dosering (2 μg/ml) jämfört med kontroll. Detta protokoll kan tillämpas på inte bara Cx43, men även andra gap korsningar också, förutsatt att lämplig hämmare används. Vi tror att detta protokoll kommer att vara användbart inom områdena kardiovaskulär och mechanobiologi forskning.

Faskontrast bilder av kontroll, 0,2 μg/ml, och 2 μg/ml Chalkon behandlade enskiktslager togs 30 minuter före Chalkon behandling (figur 1A-C) och 2 timmar efter Chalkon behandling (figur 1D-F). Cell-inducerad pärla förskjutningar (μm) observerades för att minska i både lågdos Chalkon och hög dos Chalkon villkor (figur 2E, F) jämfört med ko...

Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Här presenterar vi ett mekanisbaserat protokoll för att störa gap Junction Connexin 43 och mäta den efterföljande påverkan detta har på endotelial biomekanik genom observation av Tractions och intercellulära spänningar.

Perturbing endotelial biomekanik via Connexin 43 strukturella störningar

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Detta protokoll är betydande eftersom det möjliggör klarläggande av den roll cellulära krafter spelar i många fysiologiska och patologiska processer, såsom sårläkning och cancer metastaser, till exempel. Den största fördelen med denna mekanikbaserade teknik är dess förmåga att samtidigt störa cell-cell korsningar och mäta dess inverkan på cell-genererade mekaniska krafter, främst traktioner och intercellulära stressfaktorer. Vårt protokoll är tillämpligt på ett brett spektrum av patofysiologiska processer, såsom cancer metastaser, ateroskleroses, och hypertoni, till exempel.Våra metoder kan integreras för att utföra både biokemisk och biomekanisk analys med organ-on-chip-modeller, bio-engineered tissue constructs, in vitro drug delivery systems, och vävnads-samkultursystem. Vårt protokoll är ganska enkelt att utföra. Vi råder dock dem som gör detta protokoll för första gången att ha tålamod och inte rusa igenom stegen i detta protokoll.Vårt protokoll har unika steg som kanske inte är tydliga för första gången användare. Därför uppmuntrar vi användarna att följa våra skriftliga steg-för-steg-procedurer och använda visuella demonstrationer som vägledning. Till att börja, förbereda Blind-silan lösning genom att blanda 200 milliliter av ultra rent vatten med 80 mikroliter av ättiksyra och 50 mikroliter av silanmetakrylat.Rör om Bind-silanlösningen på en omrörningsplatta i minst en timme. Behandla centrum väl av en Petriskål med Bind-silan lösningen i 45 minuter. Ta bort Bind-silanlösningen och skölj petriskålen med ultrarent vatten två till tre gånger.Torka petriskålsytan och förvara i rumstemperatur för framtida bruk. För att förbereda hydrogellösningen, blanda 12,49 milliliter ultra rent vatten till 2,062 milliliter av 40%akrylamid och 375 mikroliter av 2%bisacrylamide i en 15-milliliter centrifugeringsrör. Tillsätt 80 mikroliter av fluorescerande pärlor till hydrogellösningen.Skaka försiktigt röret för att blanda pärlorna med gellösningen. Håll locket löst på centrifugröret och placera den i en vakuumkammare. Avgasa gellösningen i minst 45 minuter i vakuumkammaren.För att polymerisera hydrogelen, tillsätt först 75 mikroliter av 10%ammoniumpersulfat och sedan lägga till åtta mikroliter av TEMED till hydrogellösningen. Placera 24 mikroliter av hydrogellösningen i mitten av petri-skålen. Tryck på hydrogel med en 18 millimeters täcksli för att platta till hydrogelen och gör en höjd av cirka 100 mikrometer.Vänta minst 30 till 40 minuter för gel polymerisation. Submerge den polymeriserade hydrogel i ultra rent vatten för att förhindra gel uttorkning. Täck petriskålen med aluminiumfolie för att förhindra fotoblekning av fluorescerande pärlor och förvara vid fyra grader Celsius.Blanda först PDMS silikonbasen med silikonhärdningsmedlet vid förhållandet 20 till ett i ett centrifugeringsrör på 50 milliliter. Invertera röret upp och ner och skaka kraftigt flera gånger för att säkerställa korrekt blandning av PDMS-lösningen. Ta bort bubblorna i PDMS-lösningen genom att centrifugera i en minut vid 190 gånger G.Pour fem till sex milliliter pdms-lösningen i mitten av en 100-millimeters Petri-skål och agitera skålen tills PDMS-lösningen täcker hela Petriskålsytan.Bota PDMS lösningen över natten vid 50 till 60 grader Celsius. Därefter ta bort en cirkulär 16-millimeters diameter PDMS stencil med en hålslagare. Använd en biopsistans med 1,25 millimeters diameter för att skapa små hål i PDMS-stencilen.Sterilisera PDMS-schabloner genom att dränka dem i 70%etanol i två till tre minuter, aspirera bort överflödig etanol och sedan placera under ett UV-ljus i fem minuter. Aspirera eventuell överflödig vätska och ta bort täckslien från hydrogelen. Placera PDMS-stencilen på hydrogelytan och använd pincetter för att applicera lätt tryck på PDMS-stencilen för att säkerställa en vattentät tätning mellan PDMS-stencilen och hydrogelytan.Täck hydrogelens yta med Sulfo-SAMPA upplöst i 0,1 molar-HEPES buffertlösning vid en koncentration av en till 1, 000 och placera hydrogelen under en UV-lampa med en effekt på 36 watt i åtta minuter. Aspirera överskottet Sulfo-SAMPA och HEPES lösning och skölj hydrogel två gånger med 0,1 molar HEPES följt av ytterligare två sköljningar med ultra rent vatten. Aspirera överskott ultra rent vatten och använda en 200-microliter pipett för att belägga hydrogel med 0,1 milligram per milliliter av Kollagen-1.Täck skålen för att skydda lysrör pärlor från fotoblekning och lagra hydrogel på fyra grader Celsius över natten. Nu, tillsätt tre milliliter 1X Trypsin i kolven och placera den i inkubatorn på 37 grader Celsius i tre till fem minuter för att lossa cellerna från vävnadsodlingskolven. Efter trypsinization, tillsätt tre milliliter cellodlingsmedia i kolven, snurra för att blanda och överföra blandningen till ett centrifugrör på 15 milliliter.Centrifugera celllösningen i tre minuter vid 1, 710 gånger G.Aspirate supernatanten och åter upphäva cellerna i media till en koncentration av 50 gånger 10 till de fyra cellerna per milliliter. Ta ut hydrogelrätten från kylskåpet. Ta bort Kollagen-1 från hydrogelen och skölj en gång med PBS.Lägg 75 gånger 10 till de tredje cellerna till toppen av PDMS-stencilen och låt cellerna fästa på hydrogelytan i minst en timme i inkubatorn vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. Ta bort PDMS-stencilen och dränka PDMS-stencilen i 10X Trypsin i 10 till 15 sekunder för att ta bort eventuella bifogade celler. Tillsätt minst två milliliter media till Petriskålen och sterilisera schablonen genom att spraya med 70%etanol, och placera sedan under UV-ljuset i fem minuter.Placera petriskålen i inkubatorn i minst 36 timmar, eller tills ett konfluent enskiktsskikt observerats. Faskontrast bilder av 30 minuter före chalcone behandling och två timmar efter chalcone behandling jämfördes. Cell-inducerad pärla förskjutningar observerades för att minska i både låg dos chalcone och hög dos chalcone villkor när jämfört med kontroll HUVEC monolayers.Före chalcone behandling var RMS traktioner runt 51 Pascal för alla villkor. Efter chalcone behandling, det fanns en liten ökning av RMS traktioner till 59 Pascal i låg dos chalcone behandlade monolayers och en nästan tvåfaldig minskning av RMS traktioner till 18 Pascal i hög dos chalcone behandlade monolayers jämfört med kontrollen. Chalcone-behandlingen ökade den genomsnittliga normala intercellulära stress magnituden med låg dos, men minskade signifikant den genomsnittliga normala intercellulära stress magnituden med hög dos vid jämförelse med kontroll.Chalcone behandlingen minskade också den maximala ren intercellulära påfrestningar vid både låg och hög chalcone koncentration när jämfört med kontrollen. Effekten av Chalcone-behandlingen är statistiskt signifikant baserat på både T-test och single factor ANOVA test. Medan du placerar PDMS-stencil ovanpå gelén, se till att gelen är tillräckligt torr för att säkerställa en vattentät tätning mellan PDMS-stencilen och gelen.Detta protokoll kan också tillämpas för att sond det biomekaniska bidraget av en mängd olika cell-cell korsningar, cytoskelettproteiner, cell matrix adhesion molekyler, eller extracellulära molekyler med levande bildbehandling. Med detta in vitro-protokoll kan forskare nu framgångsrikt undersöka en mängd biomekaniska, samt biokemiska egenskaper under vävnadsreparation, sårläkning eller cancermetastaser utan djurmodell. Vi råder våra tittare att vara mycket försiktig medan hantering chalcone och DMSO som inandning av dessa läkemedel rapporteras vara skadliga.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Beredning av Nukleosomer med differentiellt isotopmärkt Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS för Djupgående Karakterisering och kvantifiering av glutamin och asparagin Deamidering i Shotgun proteomik

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiska och strukturell karaktärisering av den kolhydrat Transport substrat-bindande-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Strukturell karaktärisering av Mannan cellväggen polysackarider i anläggningar som använder takt

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-gratis In Vitro kvantifiering av Protein Homo-oligomerisering använder kommersiella instrumentering och fri, öppen källkod ljusstyrka analys programvara

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Modifiera baculoviridae uttryck vektorer att producera utsöndras växtproteiner i insekt celler

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturella studier av makromolekyler i lösningen med små Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analys av SEC-SAXS-data via EFA-deconvolution och Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Kristallisering och strukturell bestämning av ett enzym:Substratkomplex genom seriell kristallografi i ett mångsidigt mikrofluidiskt chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Snabb gallerförberedelse för tidsupp lös Cryo-Electron mikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...