Name: perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

Bu çalışma, Merkezi Florida Üniversitesi start-up fonları ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüsü ödül K25HL132098 altında desteklenmiştir.

1. Poliakrilamid (PA) jelleri yapma
<ol><li>
Petri kabının hazırlanması
	<ol>
<li>200 mL ultrasaf suyu 80 μL asetik asit ve 50 μL 3-(trimethoxysilyl)propil metakrilat ile karıştırarak bağlama silane çözeltisini hazırlayın. Bind silane hidrojel eki için cam alt Petri çanak yüzeyini işlevselleştirmek için kullanılan bir çözümdür.</li>
		<li>En az 1 saat boyunca bir karıştırma plakası üzerinde bağlayıcı silane çözeltisi karıştırın.</li>
		<li>45 dakika boyunca bind s...

<ol>
	<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li><li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Colin-York, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+(STFM).">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+stress+reconstitution+from+traction+force+data.">Intercellular stress reconstitution from traction force data.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).</li><li>Islam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Experimental+Methods+of+Cellular+Force+Sensing.">Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing.</a> Biomedical Journal of Science &amp; Technical Research. 17 (3), (2019).</li><li>Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear,+intercellular+stress,+and+endothelial+cell+alignment.">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+forces:+a+useful+parameter+in+cancer+research.">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li><li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues.">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li><li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation.">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces.">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li><li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption.">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).</li><li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function.">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li><li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions.">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li><li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family.">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li><li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall.">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li><li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+phosphorylation+in+brain,+cardiac,+endothelial+and+epithelial+tissues.">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li><li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice.">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li><li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis.">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',5'-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation.">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li><li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+cytotoxicity+of+2,5-dihydroxychalcones+and+related+compounds.">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li></ol>

Grubumuz, yanı sıra diğerleri, başarıyla çeşitli patolojik ve fizyolojik hücresel süreçlerde hücre-hücre kavşaklarının etkisini araştırmak için TFM ve MSM kullanarak olmuştur in vitro7,15,18,27 . Örneğin, Hardin ve ark. endotel hücrelerinde hücreiçi stres iletimkılavuzları15. Burada bildirdiğimiz Cx43 ile ilgili değişiklikleri Hardin ve ark.'...

Fiziksel kuvvetlerin ve mekanik özelliklerin hücresel ve doku fizyolojisi ve patolojisi üzerindeki etkilerinin incelenmesine atıfta bulunan alan mekobiyoloji1olarak bilinir. Mekanobiyolojide kullanılan birkaç yararlı teknik monolayer stres mikroskobu ve traksiyon kuvveti mikroskobutur. Çekiş kuvveti mikroskopisi hücre-substrat arabiriminde üretilen çekişlerin hesaplanmasına olanak sağlarken, monokatmanlı stres mikroskobu, tek katmanlı hücreler arasında oluşan hücreler arası gerilimlerin tek katmanlı olarak hesaplanmasına olanak sağlar2 ,3,4,5,6. Önceki yöntemlerden elde edilen sonuçlar hücre kaynaklı mekanik gerilmeler hücresel süreçlerin bir dizi kaderi belirlemede önemli bir rol oynadığını ileri sürmüşlerdir3,4,5. Örneğin, harici bir mekanik kuvvete maruz kaldıktan sonra, kolektif olarak göç eden bir grup hücre morfolojilerini değiştirebilir ve şekillerini polarize ederek, kısmen çekiş ler üreterek, uygulanan kuvvet inisi boyunca hizalayabilir ve göç edebilir. 8 . Çekişler hücre kontraksiyonu değerlendirmek için kullanılabilecek ve çekiş kuvveti mikroskobu (TFM) kullanılarak hesaplanan bir metrik sağlar. Traksiyon kuvveti mikroskobu (TFM), matematiksel olarak titiz, mekanik tabanlı hesaplamalı bir yaklaşımla çekiş alanının hesaplanmasının ardından hücre kaynaklı substrat deformasyonlarının belirlenmesiyle başlar. Çekiş hesaplama yeteneği oldukça uzun bir süre için yaklaşık olduğundan, araştırmacılar tfm etkileri çekişler bir dizi süreçler üzerinde ortaya çıkarmak için kullandık9, yara iyileşmesi10 ve mühendislik kardiyak değerlendirilmesi doku11.
TFM ve MSM'nin birlikte uygulanması aşağıdaki sırayla yürütülmesi gereken üç temel adıma ayrılabilir: birincisi, hücreler tarafından üretilen hidrojel deformasyonları belirlenir; ikincisi, çekişler hidrojel deformasyonlarından kurtarılır; ve üçüncüsü, sonlu elemanlar yaklaşımı tüm monolayer içinde normal ve makas hücreler arası gerilmeleri hesaplamak için kullanılır. Jel yer değiştirmelerini hesaplamak için, hücrelerle floresan boncuk görüntüleri, özel olarak yazılmış parçacık görüntüsü velocimetry (PIV) rutini kullanılarak referans boncuk görüntüsü (hücresiz) ile karşılaştırıldı. PIV analizi için çapraz korelasyon pencere boyutu ve çakışması sırasıyla 32 x 32 piksel ve 0,5 olarak seçilmiştir. Şu anda, piksel kaymaları bir piksel-mikron dönüştürme faktörü ile çarpılarak mikronlara dönüştürüldü (mikroskobumuz için, bu dönüşüm faktörü 0,65'tir) düzlem içi yer değiştirmeleri elde etmek için. Düzlem dışı yer değiştirmeleri yoksayma ile ilişkili hatalar ihmal edilebilir12,13. Jel deplasmanları hesaplandıktan sonra, kullanılabilir çekiş ölçümleri iki türü vardır, kısıtlı çekiş ler ve sınırlandırılmamış çekişler8,14. Sınırlandırılmamış çekişler tüm görüş alanı için çekiş alanı sağlarken (hücreleri olan ve olmayan bölgeler dahil), kısıtlı çekişler ise yalnızca hücreleri içeren bölgeler için çekiş alanını sağlar14. Daha sonra, hücreler arası gerilmeler çekiş kuvveti mikroskobu bir uzantısı olan monolayer stres mikroskobu (MSM) kullanılarak hesaplanır. MSM'nin uygulanması, hücre-substrat arabiriminde tek hücre katmanı tarafından uygulanan yerel çekişlerin Newton yasalarının gerektirdiği hücre-hücre arabirimindeki hücreler arasında iletilen mekanik kuvvetler tarafından dengelenmesi gerektiği varsayımına dayanır7 ,12,13. Burada önemli bir varsayım hücre monolayer ince bir elastik levha olarak tedavi edilebilir, çünkü monolayer çekiş dağılımı bilinen ve kuvvet dengesi hücre malzeme özelliklerine bağlı değildir. Başka bir önemli varsayım çekiş kuvvetleri görüş optik alan içinde yerel hücreler arası stresler tarafından dengeli olduğunu (monolayer içinde) ve bu kuvvet dengesinin etkisi distal bölgede en az (monolayer dışında)13. Bu nedenle, hücreler arası gerilmeler, yer değiştirmeler veya her ikisinin tek katmanlı sınırdaki bir kombinasyonu tarafından tanımlanan sınır koşulları MSM13'ügerçekleştirmek için çok önemlidir. Yukarıdaki bilgileri dikkate alarak, msm'yi sonlu elemanlar analizi (FEM) yaparak maksimum ana gerilimi (σmax)ve minimum ana gerilimi (σmin)içinde her noktada döndürerek geri alabiliriz. tek katmanlı. Bu temel gerilmeler daha sonra 2B ortalama normal hücreler arası gerilimi [(σmax + σmin) ve 2D maksimum kesme hücre içi gerilimi [(σmax - σmin) /2] tüm monolayer içinde hesaplamak için kullanılır 12,13. Bu prosedür Tambe ve ark.12,13 tarafından daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır
Monolayer stres mikroskobu (MSM) bir monolayeriçindeoluşturulan hücre-hücre içi gerilmelerin hesaplanması için izin verir 6,7,8,12,13. Bu hücreler arası stresler doku büyüme ve onarım, yara iyileşmesi ve kanser metastazı için önemli olduğu ileri sürülmüşlerdir12,15,16,17. Buna ek olarak, intersellüler stresler de endotel hücre göçü ve endotel bariyer fonksiyonu önemli olduğu ileri sürülmüştür17,18. Sıkı kavşaklar ve yapışık kavşaklar gibi hücre-hücre kavşaklarının hem endotel hücreiçi stres oluşumunda ve iletiminde kritik bir rol oynadığı öne sürülürken, boşluk bağlantılarının rolü hala belirsizdir. Gap kavşakları fiziksel olarak komşu hücreleri bağlamak ve elektrik akımı ve moleküller (<1 KDa) komşu hücreler arasında geçmek için bir yol sağlamak19,20,21. Endotel hücreleri Cx37 ifade rağmen, Cx40, ve Cx43 boşluk kavşaklar19,22, Cx43 muhtemelen hastalığın ilerlemesi açısından en önemli23. Cx43'ün önemine dair kanıtlar, farelerde Cx43'ün genetik olarak silinmesi hipotansiyon24 ile sonuçlanır ve anjiyogenez üzerinde yan etkileri vardır25. Buna ek olarak, Cx43 hücre göçü ve çoğalması için önemli olduğu belgelenmiştir ve aterosklerozilerlemesi 18,22,23,24,25 .
Bu protokolde, endotelsel boşluk kavşak Cx43 bozulmasından etkilenecek confluent, endotel yaltekerlik içinde çekiş ve hücreler arası stres oluşumunu araştırmak için TFM ve MSM'yi kullandık. Biz 2,5-dihidroksikalson (chalcone), cx43 ifade26inhibe belgelenmiş bir molekül ile Cx43 bozdu. Chalcone cx43 ifade26bozmak için Lee ve ark. tarafından daha önce bildirilmiştir olarak siRNA yerine Cx43 bozmak için kullanılmıştır . Buna ek olarak, biz özellikle endotel üzerinde chalcone etkisi de potansiyel olarak çeşitli vasküler önlenmesi ve tedavisi için kullanılabilecek bir anti-inflamatuar ve anti-trombosit bileşik olduğu bildirilmiştir ilgilendi patolojiler26. Chalcone tedavileri deney başlangıcından bir saat sonra yapıldı, chalcone ile tedavi edilen monolayers toplam altı saat boyunca görüntülendi ve görüntü işleme çekiş belirlemek için özel olarak yazılmış mATLAB kodu ile yapıldı ve daha sonra hücreler arası strese neden olabilir. Sonuçlarımız çekişlerde ve hücreler arası streslerde genel bir düşüş olduğunu göstererek, Cx43'ün endotel biyomekaniğinde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td>Essential to flatten polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bis-acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610143</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8242;,5&#8242;-Dihydroxychalcone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>IDF00046</td>
			<td>To disrupt Cx43 structure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2530-85-0</td>
			<td>Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Component of polyacrylamide gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Essential to make bind saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog # A-11001</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610700</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>To make blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL</td>
			<td>Advance Biomatrix</td>
			<td>5005-100ML</td>
			<td>Use as a extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td>Buffer Saline needed for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher-Sceintific</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>To dissolve chalcone and make stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8812</td>
			<td>0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Essential to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LVES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1460801</td>
			<td>Essential HUEVC media 200 supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M200500</td>
			<td>Essential media for HUVEC cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Catalog #13-8300</td>
			<td>Primary antibody for Cx43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm dia)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-20-1.5H</td>
			<td>35 mm petri dish with a 20 mm center well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td>
			<td>Proteochem</td>
			<td>102568-43-4</td>
			<td>Essential to functionalize polyacrylamide gel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW corning</td>
			<td>2646340</td>
			<td>Silicon elastomer with curing agent to make PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610801</td>
			<td>Polyacrylamide gel polymerizing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>To permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Used to detach cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perturbing endothelial biomechanics via connexin 43 structural disruption

Endotel hücreleri hücreler arası gerilmeler ve çekişler oluşturmak için kurulmuştur, ancak endotel selüloz ve çekiş üretiminde rol boşluğu kavşakları oynamak şu anda bilinmemektedir. Bu nedenle, burada gap junction connexin 43 (Cx43) endotel biyomekanik üzerinde bilinen bir Cx43 inhibitörü 2,5-dihidroksichalcone (chalcone) ve confluent endotel monolayers maruz kalarak etkisini araştırmak için mekanik tabanlı bir protokol sasürdeyiz bu inhibitörün çekişler ve hücreler arası gerilmeler üzerindeki etkisini ölçmek. Kontrole kıyasla yüksek bir chalcone dozu (2 μg/mL) altında hem çekişlerde hem de hücreler arası streslerde azalma gösteren temsili sonuçlar salıyoruz. Bu protokol sadece Cx43'e değil, uygun inhibitörün kullanıldığı varsayarak diğer boşluk kavşaklarına da uygulanabilir. Bu protokolün kardiyovasküler ve mekanobiyoloji araştırma alanlarında yararlı olacağına inanıyoruz.

Kontrol faz kontrast görüntüleri, 0.2 μg/mL, ve 2 μg/mL tedavi monokatları chalcone tedavisinden 30 dakika önce alındı(Şekil 1A-C) ve 2 saat sonra kalkon tedavisi (Şekil 1D-F). Hücre kaynaklı boncuk yer değiştirmelerinin (μm) huvec monolayers kontrol karşılaştırıldığında hem düşük doz kalkon ve yüksek doz kalkon koşullarında azalma gözlenmiştir...

Watch this Scientific Journal Video about Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption at JoVE.com

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Burada, connexin 43 arasındaki boşluk kavşağını bozacak ve bunun endotel biyomekaniği üzerindeki etkisini çekişler ve hücreler arası gerilimlerin gözlemi yoluyla ölçmek için mekanik tabanlı bir protokol salıyoruz.

Connexin 43 Yapısal Bozulma ile Perturbing Endotel Biyomekanik

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Bu protokol, örneğin yara iyileşmesi ve kanser metastazları gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçte hücresel güçlerin oynadığı rolün açıklanmasına olanak sağladığı ndan önemlidir. Bu mekanik tabanlı tekniğin en büyük avantajı aynı anda hücre-hücre kavşakları bozmak ve hücre tarafından oluşturulan mekanik kuvvetler üzerindeki etkisini ölçmek için yeteneğidir, özellikle çekiş ve hücreler arası stres. Protokolümüz, örneğin kanser metastazları, ateroskrozlar ve hipertansiyon gibi çok çeşitli patofizyolojik süreçler için geçerlidir.Yöntemlerimiz, hem biyokimyasal hem de biyomekanik analizleri organ-çip modelleri, biyo-mühendislik doku yapıları, in vitro ilaç dağıtım sistemleri ve doku ortak kültür sistemleri ile entegre edilebilir. Protokolümüzü gerçekleştirmek oldukça basittir. Ancak bu protokolü ilk defa yapanlara sabır göstermelerini ve bu protokolün adımlarını aceleye getirmemelerini öneriyoruz.Protokolümüz, ilk kez kullananlar için açık olmayan benzersiz adımlara sahiptir. Bu nedenle, kullanıcıları yazılı adım adım prosedürlerimizi takip etmeye ve görsel gösterileri rehberlik olarak kullanmaya teşvik ediyoruz. Başlamak için, 200 mililitre ultra saf suyu 80 mikrolitre asetik asit ve 50 mikrolitre silane metakrilat ile karıştırarak Blind-silane çözeltisini hazırlayın.Bind-silane çözeltisini en az bir saat karıştırın. Bind-silane solüsyonu ile petri kabının merkezini 45 dakika iyi şımartın. Bind-silane çözeltisini çıkarın ve Petri kabını ultra saf suyla 2-3 kez durulayın.Petri çanak yüzeyini kurulayın ve ileride kullanmak üzere oda sıcaklığında saklayın. Hidrojel çözeltisini hazırlamak için, 12,49 mililitre ultra saf suyu 2,062 mililitre %40 akrilamid ve 375 mikrolitre %2 bisacrylamid 15 mililitrelik bir santrifüj tüpte karıştırın. Hidrojel çözeltisine 80 mikrolitre floresan boncuk ekleyin.Yavaşça jel çözeltisi ile boncuk karıştırmak için tüp sallayın. Kapağı santrifüj tüpünde gevşek tutun ve bir vakum odasına yerleştirin. Jel çözeltisini vakum odasında en az 45 dakika gazlayın.Hidrojeli polimerize etmek için önce %10 amonyum persülfat75 mikrolitre ekleyin ve hidrojel çözeltisine sekiz mikrolitre TEMED ekleyin. Petri kabının ortasına 24 mikrolitre hidrojel çözeltisi yerleştirin. Hidrojeli düzleştirmek ve yaklaşık 100 mikrometre yükseklikte yapmak için 18 milimetrelik kapak lı hidrojelüzerine basın.Jel polimerizasyonu için en az 30-40 dakika bekleyin. Jel dehidratasyon önlemek için ultra saf suya polimerize hidrojel batırın. Floresan boncukların fotobeyazmasını önlemek için Petri kabını alüminyum folyo ile kaplayın ve dört santigrat derecede saklayın.İlk olarak, 50 mililitrelik bir santrifüj tüp 20'ye bir oranında silikon kür maddesi ile PDMS silikon tabanı karıştırın. PDMS çözeltisinin doğru şekilde karıştırılmasını sağlamak için tüpü ters çevirin ve birden fazla kez sallayın. 190 kez G.Pour 100 milimetrelik Petri kabının ortasında PDMS çözeltisi beş ila altı mililitre dökün bir dakika için santrifüj ederek PDMS çözümündeki kabarcıkları çıkarın ve PDMS çözeltisi tüm Petri çanak yüzeyini kaplayana kadar kabı boşaltın.PDMS çözeltisini bir gecede 50 ila 60 santigrat derecede tedavi edin. Ardından, 16 milimetre çapındaki pdms şablonunu delik li zımba ile çıkarın. PDMS şablonunda küçük delikler oluşturmak için 1,25 milimetre çapında biyopsi yumruğu kullanın.PDMS şablonlarını 2-3 dakika boyunca %70 etanol le batırarak, aşırı etanolün aspire edilerek ve uv ışığının altına beş dakika yerleştirerek sterilize edin. Herhangi bir fazla sıvı aspire ve hidrojel kapak kayma kaldırın. PDMS şablonunu hidrojel yüzeyine yerleştirin ve PDMS şablonu ile hidrojel yüzeyi arasında su geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için PDMS şablonuna Hafif basınç uygulamak için cımbız kullanın.Hidrojelyüzeyini Sulfo-SAMPA ile kaplayın 0,1 molar HEPES tampon çözeltisi içinde 1'e 1,000 konsantrasyonda çözünmüş ve hidrojeli 8 dakika boyunca 36 watt gücünde bir UV lambasının altına yerleştirin. Aşırı Sulfo-SAMPA ve HEPES çözeltisini aspire edin ve hidrojeli 0,1 molar HEPES ile iki kez durulayın ve ardından ultra saf suile iki durulama daha. Aşırı ultra saf su aspire ve Kollajen-1 mililitre başına 0,1 miligram ile hidrojel kaplamak için 200 mikrolitrelik pipet kullanın.Floresan boncukları fotobeyazrlamadan korumak için yemeğin üzerini kapatın ve hidrojeli bir gecede dört santigrat derecede saklayın. Şimdi, şişeye üç mililitre 1X Tripsin ekleyin ve hücreleri doku kültürü şişesinden ayırmak için 37 santigrat derecede 37 santigrat derecede kuvöze yerleştirin. Tripsinizasyondan sonra, şişeye üç mililitre hücre kültürü ortamı ekleyin, karıştırmak için girdap ve karışımı 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Hücre çözeltisini 1 dakika için santrifüj edin, 710 kez G.Aspire süpernatant ve mililitre başına dört hücre ye 50 kez 10 konsantrasyoniçin medya hücreleri yeniden askıya. Hidrojel kabını buzdolabından çıkar. Kollajen-1'i hidrojelden çıkarın ve PBS ile bir kez durula.PDMS şablonunun üstüne üçüncü hücrelere 75 kat 10 ekleyin ve hücrelerin 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le kuvözde en az bir saat hidrojel yüzeyine bağlanmasını bekleyin. PDMS şablonunu çıkarın ve bağlı hücreleri kaldırmak için 10X Trypsin'de 10x Trypsin'e 10 ila 15 saniye daldırın. Petri kabına en az iki mililitre ortam ekleyin ve şablonu %70 etanol püskürterek ve uv ışığının altına beş dakika süreyle yerleştirerek sterilize edin.Petri kabını en az 36 saat veya enfluent bir monolayer gözlemlenene kadar kuvözde yerleştirin. Chalcone tedavisinden 30 dakika önce ve kalkon tedavisinden iki saat sonra faz kontrast görüntüleri karşılaştırıldı. Hücre kaynaklı boncuk yer değiştirmelerinin huvec monolayers kontrolüile karşılaştırıldığında hem düşük doz kalkon hem de yüksek doz kalkson koşullarında azaldığı gözlenmiştir.Chalcone tedavisinden önce, RMS çekişleri tüm koşullar için 51 Pascal civarındaydı. Chalcone tedavisinden sonra, düşük doz alkklon tedavi monokatmanlarında 59 Pascal'a rms çekişlerinde küçük bir artış ve kontrole göre yüksek doz alkklon tedavi edilen monokatmanlarda 18 Pascal'a kadar RMS çekişlerinde neredeyse iki kat azalma görüldü. Chalcone tedavisi düşük doz ile ortalama normal hücreler arası stres büyüklüğü arttı, ama önemli ölçüde kontrol ile karşılaştırıldığında yüksek doz ile ortalama normal hücreler arası stres büyüklüğü azaldı.Chalcone tedavisi de kontrol ile karşılaştırıldığında düşük ve yüksek chalcone konsantrasyonu hem de maksimum katıksız hücreler arası gerilmeleri azalttı. Kalkon tedavisinin etkisi hem T-testlerine hem de tek faktörlü ANOVA testine dayalı olarak istatistiksel olarak anlamlıdır. Jelüstüne PDMS şablon uyup, jelin PDMS şablonu ile jel arasında su geçirmez bir conta oluşturacak kadar kuru olduğundan emin olun.Bu protokol aynı zamanda hücre-hücre kavşakları, sitoskeletal proteinler, hücre matris adezyon molekülleri veya canlı görüntüleme ile hücre dışı moleküllerin biyomekanik katkısını araştırmak için de uygulanabilir. Bu in vitro protokolü ile, araştırmacılar artık başarıyla biyomekanik bir dizi araştırabilirsiniz, yanı sıra doku onarımı sırasında biyokimyasal özellikleri, yara iyileşmesi, veya hayvan modeli olmadan kanser metastazları. İzleyicilerimize, bu ilaçların solunması zararlı olduğu bildirildiğinden, chalcone ve DMSO'yu ele alırken çok dikkatli olmalarını tavsiye ederiz.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Farklı Olarak izotopla işaretli Kardeş histonlarla nükleozomlann Sulandırma

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

Av tüfeği Proteomics derinlemesine Karakterizasyonu için LERLIC-MS / MS ve Glutamin ölçümü ve Asparajin deamidasyonu

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Yapısal Mannan hücre duvarı polisakkaritler hızı kullanarak tesislerinde karakterizasyonu

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Küçük açı x-ışını saçılması kullanarak çözüm yapısal oluştururlar çalışmaları

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

EFA deconvolution ve Scatter ile SEC-SAXS verilerinin analizi

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Çok Yönlü Bir Mikroakışkan Çipte Seri Kristalografi ile Bir Enzim:Substrat Kompleksinin Kristalizasyonu ve Yapısal Belirlenmesi

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Zaman Çözümlü Cryo-Elektron Mikroskopisi için Hızlı Şebeke Hazırlığı

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...