Name: stem cell-derived viral ag-specific t lymphocytes suppress hbv replication in mice
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice at JoVE.com

يشكر المؤلفون الدكتور آدم ج غيرينغ من معهد أبحاث مستشفى تورونتو العام على توفير الـ cDNA لـ HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)- الجينات الهجينة التي تم تقييدها من قبل الإنسان والمورين، والدكتور بي جير تشين من جامعة تايوان الوطنية لتوفيره pAAV/HBV 1.2 بناء. ويدعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة منحR01AI121180، R01CA221867 و R21AI109239 إلى J. S.

تتم الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل لجنة رعاية الحيوانات في جامعة تكساس A&M (IACUC; #2018-0006) ويتم إجراؤها وفقا للمبادئ التوجيهية لرابطة تقييم واعتماد العناية بالحيوانات المختبرية. يتم استخدام الفئران خلال 6-9 أسابيع من العمر.
1. توليد خلاياCD8 وT الفيروسية الخاصة بAg م...

<ol>
	<li>Scaglione, S. J., Lok, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+hepatitis+B+treatment+in+clinical+practice.">Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice.</a> Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).</li><li>Osiowy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+infancy+and+beyond...+ensuring+a+lifetime+of+hepatitis+B+virus+(HBV)+vaccine-induced+immunity.">From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).</li><li>Gish, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+HBsAg+antigen+during+treatment+with+entecavir+or+lamivudine+in+nucleoside-naive+HBeAg-positive+patients+with+chronic+hepatitis+B.">Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B.</a> Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).</li><li>Kurktschiev, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+CD8++T+cells+in+hepatitis+B+and+C+are+characterized+by+a+lack+of+antigen-specific+T-bet+induction.">Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).</li><li>Fisicaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+intrahepatic+T-cell+responses+can+be+restored+by+blocking+programmed+death-1+pathway+in+chronic+hepatitis+B.">Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B.</a> Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).</li><li>Schurich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+signal+cytokine+IL-12+rescues+the+anti-viral+function+of+exhausted+HBV-specific+CD8+T+cells.">The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208 (2013).</li><li>Gehring, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+virus-specific+T+cells+that+target+HBV+infected+hepatocytes+and+hepatocellular+carcinoma+cell+lines.">Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+Tumor+Necrosis+Factor-alpha+Produced+by+T+Cells+Reduce+the+HBV+Persistence+Form,+cccDNA,+Without+Cytolysis.">Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis.</a> Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).</li><li>Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunocompetent+mouse+model+for+the+tolerance+of+human+chronic+hepatitis+B+virus+infection.">An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).</li><li>Wong, P., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+responses+to+infectious+pathogens.">CD8 T cell responses to infectious pathogens.</a> Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).</li><li>Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+hepatitis+B+virus+clearance+in+chimpanzees.">Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8++T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity.">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+effector+CD8++T+cells+derived+from+naive+rather+than+memory+subsets+possess+superior+traits+for+adoptive+immunotherapy.">Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 117 (3), 808-814 (2011).</li><li>Kerkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+murine+CD8++and+CD4++T+cells+for+preclinical+adoptive+immunotherapy+studies.">Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies.</a> Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).</li><li>Kuball, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitating+matched+pairing+and+expression+of+TCR+chains+introduced+into+human+T+cells.">Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells.</a> Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).</li><li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity.">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).</li><li>Cameron, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Titin-derived+HLA-A1-presented+peptide+as+a+cross-reactive+target+for+engineered+MAGE+A3-directed+T+cells.">Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells.</a> Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).</li><li>Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-+and+CTLA-4-based+inhibitory+chimeric+antigen+receptors+(iCARs)+divert+off-target+immunotherapy+responses.">PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses.</a> Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).</li><li>Maus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+expressing+chimeric+antigen+receptors+can+cause+anaphylaxis+in+humans.">T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans.</a> Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).</li><li>Haque, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+of+regulatory+T+cells+from+pluripotent+stem+cells+and+prevention+of+autoimmunity.">Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity.</a> Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8(+)+T+cells.">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation.">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li><li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance.">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).</li><li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct4-induced+pluripotency+in+adult+neural+stem+cells.">Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells.</a> Cell. 136 (3), 411-419 (2009).</li><li>Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+towards+T+lymphocytes.">Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3986 (2012).</li><li>Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+naive+single-type+tumor+antigen-specific+CD8++T+lymphocytes+from+murine+pluripotent+stem+cells.">Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells.</a> OncoImmunology. 6, (2017).</li><li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+Immunotherapy+in+Mice+Using+Genetically+Engineered+Pluripotent+Stem+Cells.">Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).</li><li>Tan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Expression+Profiles+of+HBV+DNA+Integrated+Into+Genomes+of+Hepatocellular+Carcinoma+Cells+to+Select+T+Cells+for+Immunotherapy.">Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Wu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6C(+)+Monocytes+and+Kupffer+Cells+Orchestrate+Liver+Immune+Responses+Against+Hepatitis+B+Virus+in+Mice.">Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice.</a> Hepatology. , (2019).</li><li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+tissue-associated+regulatory+T+cells+suppress+the+activity+of+pathogenic+cells+in+autoimmune+diabetes.">Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).</li><li>Chisari, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+pathological+effects+of+synthesis+of+hepatitis+B+virus+large+envelope+polypeptide+in+transgenic+mice.">Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).</li><li>Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+tolerance+leads+to+autoantibody+production+but+not+autoimmune+liver+disease+in+hepatitis+B+virus+envelope+transgenic+mice.">Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice.</a> Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).</li></ol>

يقدم هذا البروتوكول أسلوب لإنشاء CTLs iPSC-CTLs خاص بـ Ag الفيروسية لاستخدامها كـ ACT لمنع النسخ المتماثل HBV في طراز murine. في عدوى فيروس التهاب الكبد الفيروسي المزمن، يشكل الجينوم الفيروسي كروموسوم صغير مستقر، الحمض النووي الدائري المغلق بشكل مشترك (cccDNA) الذي يمكن أن يستمر طوال عمر الخلايا الكبدية. ...

بعد العدوى الحادة، يتحكم الجهاز المناعي التكيفي (أي الحصانة الفكاهية والخلوية) في الجزء الأكبر من التهاب الكبد الوبائي الحاد المرتبط بـ HBV. ومع ذلك، لا يستطيع عدد من الناس في المناطق الموبوءة بفيروس التهاب الكبد الحلقي V القضاء على الفيروسات ثم تحويلها كأفراد مزمنين. أكثر من 25٪ من المرضى المزمنين (>250 مليون شخص) في جميع أنحاء العالم تطوير مرض الكبد التدريجي، مما أدى إلى تليف الكبد و / أو سرطان الخلايا الكبدية (HCC)1. ونتيجة لذلك، لا يزال القضاء على الخلايا المصابة بإصرار يمثل مشكلة صحية عامة، على الرغم من وجود لقاح متاح2 ويجري تطوير العديد من الأدوية المضادة للفيروسات. يشمل العلاج القياسي لعدوى فيروس التهاب الكبد متعدد السنوات IFN-α، والنيوكليوزيد، ونظائرها النيوكليوتيدات. هذه العوامل لديها نشاط مضاد للفيروسات مباشرة وقدرات التحوير المناعي. ومع ذلك، يظهر التحويل المصلي لمستضد HBe (Ag)+ الناقلين مع الأجسام المضادة للحمض الهيدروكلوريك (Ab) وفقدان حمض الديوكسيريبونوكليك المصلي بشكل فردي في حوالي 20٪ من المرضى المعالجين، والسيطرة المناعية الكاملة للفيروس التحقق من الحرمان من HBsAg لا يزيد عن 5٪3. وعلاوة على ذلك، فإن الاستجابة للعلاج في كثير من الأحيان ليست دائمة. التطعيم الوقائي مع HBs Ag المؤتلف فعال للغاية في الوقاية من العدوى، ولكن التطعيم العلاجي HBs Ag غير فعال. ومن الواضح أن الاستجابات المناعية التي تتوسط فيها الخلايا T تلعب دوراً حاسماً في السيطرة على عدوى فيروس التهاب الكبد V وضعف الكبد. ومع ذلك، في مرضى التهاب الكبد المزمن، وغالبا ما يتم حذف خلايا T HBV التفاعلية، مختلة وظيفيا، أو تحويل استنفدت4،5،6. وبالتالي، في الأفراد المصابين بعدوى فيروس التهاب الكبد متعدد الكلور المستمر، لم تنجح أي محاولات لإعادة المناعة الخاصة بفيروس التهاب الكبد الفيروسي (أي الحصانة القائمة على الخلايا T) عن طريق العلاج المضاد للفيروسات، أو السيتوكينات المناعية، أو التحصين العلاجي.
نقل الخلايا بالتبني (ACT) من خلايا T Ag Ag هو علاج فعال موجهة للقضاء في نهاية المطاف على الخلايا الكبدية المتبقية wih HBV7،8. وقد تبين أن إصابة الفئران المصابة بفيروس التهاب الكبد الوبائي تسبب التهاب الكبد الوبائي العابر والمعتدل، وانخفاض كبير في نسخ حمض الريبونوكليك (RNA) في خلايا الكبد. في هذه الدراسات، لم تمنع CTLs نسخ جينات التهاب الكبد V ولكنها عززت تدهور نصوص فيروس التهاب الكبد1 9. الـ HBV CtLs مهم لمنع العدوى الفيروسية والتوسط لإزالة فيروس التهاب الكبد10و11. بالنسبة للعلاجات المستندة إلى ACT، اقترح التوسع في المختبر لخلايا T الخاصة بـ HBV مع تفاعل عال لإعادة التوطين في الجسم الحي لتكون طريقة مثالية12،13،14؛ ومع ذلك، فإن النهج الحالية مقيدة فيما يتعلق بقدراتها على توليد وفصل وزراعة الكميات والصفات المناسبة من الخلايا T الخاصة بفيروس التهاب الكبد الغذائي من المرضى للعلاجات المحتملة.
على الرغم من أن التجارب السريرية تقدم السلامة، وإمكانية التطبيق العملي، والنشاط العلاجي المحتمل للعلاجات القائمة على الخلايا عن طريق الخلايا T المهندسة التي هي محددة لخلايا الكبد المصابة بفيروس التهاب الكبد، وهناك مخاوف بشأن الآثار غير المواتية التي تحدث من استجابات المناعة الذاتية بسبب التفاعل المتبادل من مستقبلات الخلايا T الاقتران (TCR)15،16، خارج الهدف Ag الاعتراف من قبل TCR غير محددة17 وعلى الهدف خارج السمية من قبل مستقبلات Ag chimeric (CAR) 18 سنة , 19 مع الأنسجة الصحية. حاليا، الخلايا T المعدلة وراثيا، والتي لديها فقط استمرار على المدى القصير في الجسم الحي، وعادة ما تكون متوسطة أو في وقت لاحق الخلايا T. حتى الآن، الخلايا الجذعية متعددة القوى (PSCs) هي المصدر الوحيد المتاح لتوليد أعداد عالية من الخلايا T من نوع واحد Ag السذاجة20،21،22،23. يتم تحويل PSCs المستحثة (iPSCs) ببساطة من الخلايا الجسدية للمريض من خلال استخدام تحويل الجينات من عدة عوامل النسخ. ونتيجة لذلك، فإن الـ iPSCs لها خصائص مماثلة لخصائص الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)24. بسبب المرونة والإمكانية للقدرة اللانهائية على التجديد الذاتي، بالإضافة إلى استبدال الأنسجة، يمكن تطبيق العلاجات المستندة إلى iPSC على نطاق واسع في الطب التجديدي. وعلاوة على ذلك، فإن الأفواج التي تقوم عليها هذه المراكز قد تحسن إلى حد كبير العلاجات الحالية القائمة على الخلايا.
والهدف العام لهذه الطريقة هو توليد كمية كبيرة من CTLs الخاصة بفيروس التهاب الكبد متعدد الكلور من iPSCs (أي iPSC-CTLs) للعلاج المناعي القائم على ACT. المزايا على التقنيات البديلة هي أن HBV محددة iPSC-CTLs لديها TCR من نوع واحد والنمط الظاهري السذاجة، مما يؤدي إلى مزيد من الذاكرة T خلية التنمية بعد ACT. ومن الواضح أن ACT من فيروس التهاب الكبد CV محددة iPSC-CTLs يزيد من هجرة خلايا CD8+ T وظيفية في الكبد ويقلل من النسخ المتماثل HBV في كل من الكبد والدم من الفئران تدار. هذه الطريقة تكشف عن إمكانية استخدام الفيروسية Ag محددة iPSC-CTLs للعلاج المناعي HBV ويمكن تكييفها لتوليد خلايا أخرى الفيروسية Ag محددة iPSC-T للعلاج المناعي الفيروسي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HHD mice</td>
			<td>Institut Pasteur, Paris, France</td>
			<td></td>
			<td>H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td>
			<td>RIKEN Cell Bank</td>
			<td>APS0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNL76/7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV/HBV1.2 plasmid</td>
			<td>Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan)</td>
			<td></td>
			<td>HBV DNA construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes</td>
			<td>Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada)</td>
			<td></td>
			<td>FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (V&#945;34 and V&#946;28)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264-specific TCR genes</td>
			<td>Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA)</td>
			<td></td>
			<td>SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 (17A2) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44 (IM7) antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>103012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 (GK1.5) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8 (53-6.7) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#947; (XMG1.2) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>506306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10490-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HBs antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MA5-13059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ABCD1234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria Fusion cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJammer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer</td>
			<td>Proimmune</td>
			<td>F027-4A - 27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Anti-Mouse Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFlt-3L</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease S7</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10107921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp MinElute Virus Spin Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>57704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stem cell-derived viral ag-specific t lymphocytes suppress hbv replication in mice

عدوى فيروس التهاب الكبد B هي قضية صحية عالمية. مع إصابة أكثر من 350 مليون شخص في جميع أنحاء العالم، لا تزال عدوى فيروس التهاب الكبد V السبب الرئيسي لسرطان الكبد. وهذا مصدر قلق كبير، لا سيما في البلدان النامية. فشل الجهاز المناعي في تركيب استجابة فعالة ضد فيروس التهاب الكبد V يؤدي إلى العدوى المزمنة. وعلى الرغم من وجود لقاح فيروس التهاب الكبد B ويجري إنشاء أدوية جديدة مضادة للفيروسات، فإن القضاء على خلايا خزان الفيروس لا يزال موضوعاً صحياً رئيسياً. يرد موضح هنا طريقة لتوليد مستضد فيروسي (Ag) محدد CD8+ الخلايا الليمفاوية T السامة للخلايا (CTLs) المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSCs) (أي iPSC-CTLs)، والتي لديها القدرة على قمع النسخ المتماثل HBV. يتم إجراء النسخ المتماثل للفيروس HBV بكفاءة في الفئران من خلال الحقن الهيدرودينامي لبلازميد تعبير HBV، pAAV/HBV1.2، في الكبد. ثم، يتم نقل سطح HBV Ag-Specific الماوس iPSC-CTLs بالتبني، مما يمنع إلى حد كبير النسخ المتماثل HBV في الكبد والدم، فضلا عن يمنع HBV التعبير Ag سطح في خلايا الكبد. يوضح هذا الأسلوب النسخ المتماثل HBV في الفئران بعد الحقن الهيدرودينامي وأن الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية الفيروسية Ag-Specific CTLs يمكن منع النسخ المتماثل HBV. يوفر هذا البروتوكول طريقة مفيدة للعلاج المناعي HBV.

كما هو موضح هنا، يتم إنشاء خلايا HBV الفيروسية Ag-CD8-CD8+ T بواسطة نظام زراعة في المختبر. بعد ACT من هذه الفيروسية Ag-Specific iPSC-CD8+ T الخلايا منع إلى حد كبير النسخ المتماثل HBV في نموذج murine (ملف تكميلي 1). يتم نقل iPSC الماوس مع MIDR البنى الرجعية ترميز الجين الهجين HBV HCR الإنسان الماوس (HBs...

Watch this Scientific Journal Video about Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice at JoVE.com

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

يعرض هنا بروتوكول للقمع الفعال لفيروس التهاب الكبد B (HBV) النسخ المتماثل في الفئران باستخدام نقل الخلايا بالتبني (ACT) من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية مستضد الفيروسي (Ag) محددة T الخلايا الليمفاوية. يمكن تكييف هذا الإجراء للعلاج المناعي المحتمل القائم على ACT للعدوى بفيروس التهاب الكبد V.

الخلايا الجذعية المشتقة الفيروسية Ag محددة T الخلايا الليمفاوية قمع النسخ المتماثل HBV في الفئران

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في نقل الخلايا بالتبني من الخلايا T المُستضدات الفيروسية المشتقة من iPSC من أجل الكبت الفعال لتكرار HBV في الفئران. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخلايا التائية الفيروسية المشتقة من المستضدات الفيروسية iPSC لديها مستقبلات خلية T من نوع واحد ونمط ظاهري ساذج. للتمايز من HBV محددة iPSC CD8 إيجابية الخلايا T, لوحة s183 T مستقبلات الخلايا الجينات التي تورث iPSCs على monolayer OP9-DL1/DL4 في الحد الأدنى من المتوسط ألفا تكملها 20٪ مصل البقر الجنيني وmerine Flt3 ligand لثقافة المشتركة في حاضنة ثقافة الخلية.مراقبة الثقافة المشتركة بانتظام لتقييم مورفولوجيا الخلية. في اليوم 28، قم بإزالة الخلايا الطافية والعائمة، وافصل الخلايا المنضمة بنسبة 0.25٪التربسين. عندما تكون الخلايا قد رفعت من أسفل حاوية الثقافة، ووقف رد فعل انزيمية مع ثمانية ملليلتر من المتوسط iPSC، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.Resuspend بيليه في 10 ملليلتر من المتوسطة الطازجة. تمييع الخلايا إلى خلية T إيجابية CD8 مشتقة من iPSC إلى أربعة نسبة طحالية الببتيد النبضية إلى أربعة من الببتيد النبضية لمدة 40 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية. خلال الساعات السبع الماضية، إضافة أربعة ميكرولترات من brefeldin المخفف ألف إلى الثقافة، لمنع عمليات النقل أثناء تنشيط الخلية.وصمة عار الخلايا لتحليل تدفق السيتوكينات الخلوية داخل الخلايا من الفائدة وفقا للبروتوكولات القياسية. لhdynamic HBV plasmid التسليم من خلال الوريد الذيل، وتمييع 10 ميكروغرام من بلاسمد HBV في ما يعادل 8٪ من كتلة الجسم من برنامج تلفزيوني. قم بتحميل البلازميد في حقنة واحدة من ثلاثة ملليلتر مجهزة بإبرة قياس 26 بوصة لكل فأرة.سخني فئران HHD تحت مصباح حراري لمدة خمس دقائق لتمدد عروق الذيل، وسحب فأر بعناية إلى مقيّد بلاستيكي. تحديد موقع الوريد الذيل الجانبي المتوسعة في الثلث الأوسط من الذيل، وإدراج إبرة موازية للورد لتقديم كامل حجم البلازميد من خلال الوريد الذيل على مدى فترة من ثلاث إلى خمس ثوان. بالنسبة لـ iPSC المشتقة من CD8-positive T cell المشتقة من CD8، قم بجمع خلايا T CD8 إيجابية iPSC في اليوم 22 من الثقافة كما هو موضح، وبذّر الخلايا على طبق ثقافة خلية جديد طوله 10 سنتيمترات.بعد 30 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية ، قم بتصفية الخلايا العائمة من خلال مصفاة نايلون 70 ميكرومتر ، واحسب الخلايا القابلة للحياة. تمييع الخلايا إلى 1.5 مرة 10 إلى الخلايا السبع لكل ملليلتر من تركيز برنامج تلفزيوني. حقن 200 ميكرولتر من الخلايا في الفردية أربعة إلى ستة أسابيع فئران HHD القديمة، في الوريد الذيل كما هو موضح للتو.في اليوم 14 بعد نقل الخلايا، تنفيذ تسليم بلاسميد HBV هيدرودينامية كما هو موضح. وعند نقاط النهاية التجريبية المناسبة بعد العدوى، حصد الكبد من كل مصاب، وقطع الكبد إلى عينات أنسجة 0.5 في 0.5 في 0.3 سنتيمتر. ضع العينات في 10٪ من الكالين المحايد لمدة أربع إلى 24 ساعة ، تليها إزالة النسل في حمض الفورميك 2.5-molar لمدة ست إلى 24 ساعة.بعد ذلك ، شطف العينات في إكسيلين لمدة ثلاث دقائق ، تليها اثنين من الشطف لمدة دقيقتين في الإيثانول 100 ٪ ، 95 ٪ الإيثانول ، والماء الأيونية. بعد غسل المياه الأخير ، قم بتخميم الأنسجة في EDTA من الملليمتر الواحد عند 90 درجة مئوية ، تليها حضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. عندما يبرد النسيج، شطف العينات في برنامج تلفزيوني لمدة أربع دقائق، واستخدام الزيلين والإيثانول ل deparaffinize وإعادة هيدرات العينات.لوضع العلامات المناعية، وصمة المقاطع مع 200 ميكرولترات من الأجسام المضادة المضادة لسطح HBV محددة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطب 75 إلى 100٪. في نهاية الحضانة، وغسل العينات مع خمسة يغسل لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني جديد لكل غسل. تسمية الخلايا مع DAPI وفقا للبروتوكولات القياسية قبل تركيب الشرائح مع الأغطية للتصوير عن طريق المجهر الفلوريس.للتحليل المناعي الكيميائي، وصمة عار الأقسام مع الهماوكسيلين ويوسين وفقا للبروتوكولات القياسية، وتقييم تسلل الخلايا الالتهابية في الكبد عن طريق المجهر الخفيفة. تحليل تدفق cytometric من iPSC المستمدة CD3 إيجابية CD8-positive السكان يكشف أن HBV T مستقبلات الخلايا نقل يزيد بشكل كبير من توليد الخلايا التائية S183-محددة CD8 الفيروسية. بعد التحفيز مع الطحال المنضب T نبض مع الببتيد s183, CD4-السلبية CD8 أحادية الإيجابية iPSC المشتقة الخلايا التائية تنتج كميات كبيرة من الانفيرون غاما, كما كشفها التحليل الخلوي تدفق داخل الخلايا و ELISA.بعد عدوى HBV عن طريق الحقن الهيدروديناميكية، يبلغ تكرار الحمض النووي ذروته في اليوم السادس ويقلل تدريجياً، كما لوحظ من خلال تحليل PCR في الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك، يتم تخفيض النسخ الفيروسي بشكل كبير في جميع النقاط الزمنية في الفئران التي تتلقى خلايا T المضادة للحساسية الفيروسية HBV مقارنة بالفئران التي تتلقى خلايا التحكم. كما ينخفض بروتين سطح HBV بشكل كبير في الفئران التي تتلقى HBV فيروسية مستضد محددة قبل iPSC الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا مقارنة بالفئران المعالجة بالخلايا التحكمية، مما يدل بوضوح على أن الخلايا التائية iPSC CD8-positive-antigen الفيروسية الفيروسية لديها القدرة على تقليل تكرار HBV في نموذج مورين.يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية توليد الخلايا التائية المضادة للفيروسات من iPSC للعلاج المناعي بالتبني.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

طرق لتقييم موت الخلايا بيتا وساطة من قبل الخلايا اللمفاوية التائية السامة

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

توليد خلايا T - Multivirus محددة لمنع / علاج الالتهابات الفيروسية خيفي بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

توسيع الخلايا اللمفاوية T السامة للخلايا من دم الحبل السري أن الفيروس المضخم للخلايا الهدف، فيروس ابشتاين بار، واتش

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

توجه التمييز بين الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة نحو الخلايا اللمفية تي

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

العزلة والتمايز TH17 من السذاجة CD4 T الخلايا اللمفاوية

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

ثابت التصاق الفحص لدراسة إنتغرين تنشيط الخلايا اللمفية تي في

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

العزلة الفيروسية النسخ المتماثل حجرة التخصيب النووي الكسور الفرعية من اتش المصابة الخلايا الطبيعية الإنسان

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

بروتوكول عزل فعال للاللمفاوية البائية والتائية من بلاطي اللوزتين الإنسان

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

التصور من الخلايا اللمفاوية معربا-22-IL عن طريق الفئران مراسل

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...