Name: stem cell-derived viral ag-specific t lymphocytes suppress hbv replication in mice
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice at JoVE.com

Gli autori ringraziano il Dr. Adam J Gehring del Toronto General Hospital Research Institute per aver fornito cDNA per HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) - specifici geni TCR umano-murine con restrizioni A2, e il Dr. Pei-Jer Chen della National Taiwan University per aver fornito pAAV/HBV 1.2. Questo lavoro è supportato dal National Institute of Health Grant R01AI121180, R01CA221867 e R21AI109239 a J. S.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono approvati dal Texas A&M University Animal Care Committee (IACUC; #2018-0006) e sono condotti in conformità con le linee guida dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali di laboratorio. I topi vengono utilizzati durante 6-9 settimane di età.
1. Generazione di cellule virali specifiche dell'ag8- T da iPSC (iPSC-CD8- cellule T)
<ol><li>Creazione dei costrutti retrovirali N.B.: I geni TCR e ...

<ol>
	<li>Scaglione, S. J., Lok, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+hepatitis+B+treatment+in+clinical+practice.">Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice.</a> Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).</li><li>Osiowy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+infancy+and+beyond...+ensuring+a+lifetime+of+hepatitis+B+virus+(HBV)+vaccine-induced+immunity.">From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).</li><li>Gish, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+HBsAg+antigen+during+treatment+with+entecavir+or+lamivudine+in+nucleoside-naive+HBeAg-positive+patients+with+chronic+hepatitis+B.">Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B.</a> Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).</li><li>Kurktschiev, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+CD8++T+cells+in+hepatitis+B+and+C+are+characterized+by+a+lack+of+antigen-specific+T-bet+induction.">Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).</li><li>Fisicaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+intrahepatic+T-cell+responses+can+be+restored+by+blocking+programmed+death-1+pathway+in+chronic+hepatitis+B.">Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B.</a> Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).</li><li>Schurich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+signal+cytokine+IL-12+rescues+the+anti-viral+function+of+exhausted+HBV-specific+CD8+T+cells.">The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208 (2013).</li><li>Gehring, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+virus-specific+T+cells+that+target+HBV+infected+hepatocytes+and+hepatocellular+carcinoma+cell+lines.">Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+Tumor+Necrosis+Factor-alpha+Produced+by+T+Cells+Reduce+the+HBV+Persistence+Form,+cccDNA,+Without+Cytolysis.">Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis.</a> Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).</li><li>Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunocompetent+mouse+model+for+the+tolerance+of+human+chronic+hepatitis+B+virus+infection.">An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).</li><li>Wong, P., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+responses+to+infectious+pathogens.">CD8 T cell responses to infectious pathogens.</a> Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).</li><li>Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+hepatitis+B+virus+clearance+in+chimpanzees.">Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8++T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity.">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+effector+CD8++T+cells+derived+from+naive+rather+than+memory+subsets+possess+superior+traits+for+adoptive+immunotherapy.">Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 117 (3), 808-814 (2011).</li><li>Kerkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+murine+CD8++and+CD4++T+cells+for+preclinical+adoptive+immunotherapy+studies.">Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies.</a> Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).</li><li>Kuball, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitating+matched+pairing+and+expression+of+TCR+chains+introduced+into+human+T+cells.">Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells.</a> Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).</li><li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity.">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).</li><li>Cameron, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Titin-derived+HLA-A1-presented+peptide+as+a+cross-reactive+target+for+engineered+MAGE+A3-directed+T+cells.">Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells.</a> Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).</li><li>Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-+and+CTLA-4-based+inhibitory+chimeric+antigen+receptors+(iCARs)+divert+off-target+immunotherapy+responses.">PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses.</a> Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).</li><li>Maus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+expressing+chimeric+antigen+receptors+can+cause+anaphylaxis+in+humans.">T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans.</a> Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).</li><li>Haque, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+of+regulatory+T+cells+from+pluripotent+stem+cells+and+prevention+of+autoimmunity.">Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity.</a> Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8(+)+T+cells.">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation.">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li><li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance.">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).</li><li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct4-induced+pluripotency+in+adult+neural+stem+cells.">Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells.</a> Cell. 136 (3), 411-419 (2009).</li><li>Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+towards+T+lymphocytes.">Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3986 (2012).</li><li>Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+naive+single-type+tumor+antigen-specific+CD8++T+lymphocytes+from+murine+pluripotent+stem+cells.">Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells.</a> OncoImmunology. 6, (2017).</li><li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+Immunotherapy+in+Mice+Using+Genetically+Engineered+Pluripotent+Stem+Cells.">Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).</li><li>Tan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Expression+Profiles+of+HBV+DNA+Integrated+Into+Genomes+of+Hepatocellular+Carcinoma+Cells+to+Select+T+Cells+for+Immunotherapy.">Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Wu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6C(+)+Monocytes+and+Kupffer+Cells+Orchestrate+Liver+Immune+Responses+Against+Hepatitis+B+Virus+in+Mice.">Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice.</a> Hepatology. , (2019).</li><li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+tissue-associated+regulatory+T+cells+suppress+the+activity+of+pathogenic+cells+in+autoimmune+diabetes.">Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).</li><li>Chisari, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+pathological+effects+of+synthesis+of+hepatitis+B+virus+large+envelope+polypeptide+in+transgenic+mice.">Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).</li><li>Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+tolerance+leads+to+autoantibody+production+but+not+autoimmune+liver+disease+in+hepatitis+B+virus+envelope+transgenic+mice.">Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice.</a> Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).</li></ol>

Questo protocollo presenta un metodo per generare gli iPSC-CTL virali specifici di Ag da utilizzare come ACT per sopprimere la replica HBV in un modello murino. Nell'infezione cronica da HBV, il genoma virale forma un mini cromosoma stabile, il DNA circolare covalentmente chiuso (cccDNA) che può persistere per tutta la durata della vita dell'epatocito. Mirare alla clearance del mini cromosoma virale può provocare una cura dell'infezione cronica da HBV. L'attuale terapia antivirale si rivolge alla trascrizione inversa d...

A seguito di infezione acuta, il sistema immunitario adattivo (cioè l'immunità umorale e cellulare) controlla la maggior parte dell'epatite acuta correlata all'HBV. Tuttavia, un certo numero di persone nelle regioni HBV-endemiche non può eliminare i virus e successivamente convertirsi come individui cronici. Più del 25% dei pazienti cronici (>250 milioni di persone) in tutto il mondo sviluppa malattie epatiche progressive, con conseguente cirrosi epatica e/o carcinoma epatocellulare (HCC)1. Di conseguenza, l'eradicazione delle cellule infettate insistenza rimane un problema generale di salubrità, anche se esiste un vaccino2 disponibile e numerosi farmaci antivirali sono in fase di sviluppo. Il trattamento standard per l'infezione da HBV include analoghi IFN-z, nucleoside e nucleotide. Questi agenti hanno attività antivirale diretta e capacità modulativi immunitarie. Tuttavia, la sieroconversione dell'antigene HBe (Ag)- portatori con anticorpo anti-HBe (Ab) e perdita di acido deossiribonucleico HBV del siero compaiono individualmente in circa il 20% dei pazienti trattati e il controllo immunologico completo del virus verificata dalla privazione dell'HBsAg non superiore al 5%3. Inoltre, la risposta al trattamento spesso non è durevole. La vaccinazione profilattica con HBs Ag ricombinante è altamente efficace nella prevenzione dell'infezione, ma la vaccinazione terapeutica hBs Ag non è efficace. Chiaramente, le risposte immunitarie mediate dalle cellule T svolgono un ruolo fondamentale nel controllo dell'infezione da HBV e della compromissione del fegato; tuttavia, nei pazienti cronici con epatite, le cellule T reattive HBV sono spesso eliminate, disfunzionali o convertite esaurite4,5,6. Di conseguenza, in individui con infezione da HBV persistente, nessun tentativo di ripristinare l'immunità specifica dell'HBV (cioè l'immunità basata sulle cellule T) per mezzo di rimedio anti-virale, citochine immunomodulatori o immunizzazione curativa hanno raggiunto successo.
Il trasferimento di cellule adottive (ACT) di cellule T specifiche DI HBV Ag è un trattamento efficace diretto a sradicare infine i rimanenti epatociti wih HBV7,8. L'ACT dei CL specifici dell'HBV nei topi infetti da HBV ha dimostrato di causare un calo transitorio e lieve e un calo drammatico nelle trascrizioni di acido ribonucleico HBV (RNA) negli epatociti. In questi studi, i CTL non hanno inibito la trascrizione dei geni HBV, ma hanno migliorato la degradazione delle trascrizioni HBV9. Gli HBV specifici sono importanti per prevenire l'infezione virale e mediare l'autorizzazione dell'HBV10,11. Per i rimedi basati su ACT, l'espansione in vitro di cellule T specifiche HBV con un'elevata reattività per il reinsediamento in vivo è stata suggerita come metodo ideale12,13,14; tuttavia, gli attuali approcci sono limitati per quanto riguarda la loro capacità di generare, separare e far crescere quantità e qualità appropriate di cellule T specifiche dell'HBV dai pazienti per le potenziali terapie.
Anche se gli studi clinici presentano sicurezza, praticabilità e attività terapeutica prospettica di trattamenti basati sulle cellule per mezzo di cellule T ingegnerizzate specifiche per gli epatociti infettati da virus HBV, ci sono preoccupazioni circa gli effetti sfavorevoli che si verificano da risposte autoimmuni a causa della reattività incrociata da recettori cellulari T (TCR)15,16, riconoscimento Ag off-target da non specifico TCR17 e on-target off-toxicity da un recettore Ag chierico (CAR) 18 mi lato , 19 con tessuti sani. Attualmente, le cellule T geneticamente modificate, che hanno solo persistenza a breve termine in vivo, sono di solito cellule T intermedie o successive. Ad oggi, le cellule staminali pluripotenti (PSC) sono l'unica fonte disponibile per generare un numero elevato di ingenue cellule T singole di tipo G20,21,22,23. I PSC indotti (iPSC) vengono semplicemente convertiti dalle cellule somatiche di un paziente attraverso l'uso della trasduzione genica di diversi fattori di trascrizione. Di conseguenza, gli iPSC hanno caratteristiche simili a quelle delle cellule staminali embrionali (ESC)24. A causa della flessibilità e della possibilità per l'infinita capacità di auto-rinnovarsi, oltre alla sostituzione dei tessuti, i trattamenti basati su iPSC possono essere ampiamente applicati nella medicina rigenerativa. Inoltre, i reggimenti alla base degli iPSC possono migliorare notevolmente le attuali terapie basate sulle cellule.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di generare una grande quantità di CTL specifici HBV da iPSC (cioè iPSC-CTL) per l'immunoterapia basata su ACT. I vantaggi rispetto alle tecniche alternative sono che gli iPSC-CTL specifici dell'HBV hanno un tCR di tipo singolo e un fenotipo ingenuo, che si traduce in più sviluppo di cellule T di memoria dopo l'ACT. È dimostrato che l'ACT degli iPSC-CTL specifici dell'HBV aumenta la migrazione delle cellule cLAmone CD8 - cLAmmi funzionali nel fegato e riduce la replicazione dell'HBV sia nel fegato che nel sangue dei topi somministrati. Questo metodo rivela un potenziale uso di iPSC-CTL virali specifici dell'Ag per l'immunoterapia HBV e può essere adattato per generare altre cellule iPSC-T virali specifiche dell'Ag per l'immunoterapia virale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HHD mice</td>
			<td>Institut Pasteur, Paris, France</td>
			<td></td>
			<td>H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td>
			<td>RIKEN Cell Bank</td>
			<td>APS0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNL76/7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV/HBV1.2 plasmid</td>
			<td>Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan)</td>
			<td></td>
			<td>HBV DNA construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes</td>
			<td>Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada)</td>
			<td></td>
			<td>FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (V&#945;34 and V&#946;28)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264-specific TCR genes</td>
			<td>Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA)</td>
			<td></td>
			<td>SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 (17A2) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44 (IM7) antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>103012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 (GK1.5) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8 (53-6.7) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#947; (XMG1.2) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>506306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10490-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HBs antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MA5-13059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ABCD1234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria Fusion cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJammer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer</td>
			<td>Proimmune</td>
			<td>F027-4A - 27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Anti-Mouse Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFlt-3L</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease S7</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10107921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp MinElute Virus Spin Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>57704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stem cell-derived viral ag-specific t lymphocytes suppress hbv replication in mice

L'infezione da virus dell'epatite B (HBV) è un problema di salute globale. Con oltre 350 milioni di persone colpite in tutto il mondo, l'infezione da HBV rimane la principale causa di cancro al fegato. Si tratta di una delle principali preoccupazioni, soprattutto nei paesi in via di sviluppo. Il fallimento del sistema immunitario per montare una risposta efficace contro l'HBV porta a infezioni croniche. Anche se il vaccino HBV è presente e si stanno creando nuovi farmaci antivirali, l'eradicazione delle cellule del serbatoio del virus rimane un importante argomento sanitario. Qui è descritto un metodo per la generazione di antigene virale (Ag) specifico CD8- linfociti T citotossici (CTL) derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) (cioè iPSC-CTL), che hanno la capacità di sopprimere la replicazione HBV. La replicazione HBV è indotta in modo efficiente nei topi attraverso l'iniezione idrodinamica di un plasmide di espressione HBV, pAAV/HBV1.2, nel fegato. Quindi, i mouse specifici di HBV Ag iPSC-CTL vengono trasferiti adottivamente, il che sopprime notevolmente la replicazione dell'HBV nel fegato e nel sangue e previene l'espressione Di HbV surface Ag negli epatociti. Questo metodo dimostra la replicazione HBV nei topi dopo l'iniezione idrodinamica e che i CTL virali specifici di Ag- delle cellule staminali possono sopprimere la replicaHBV. Questo protocollo fornisce un metodo utile per l'immunoterapia HBV.

Come mostrato qui, HBV virale Ag-specifico iPSC-CD8- le cellule T sono generate da un sistema di coltura in vitro. Dopo l'ACT di questi iPSC-CD8 virali specifici di Ag8- Le cellule T sopprimono sostanzialmente la replica HBV in un modello murino (File supplementare 1). Mouse iPSC sono tradotti con il costrutto retrovirale MIDR codificando un gene ibrido HBV TCR umano-mouse (HBs183-191-specific,s183), quindi gli iPSC trandotti dal gene sono co-coltivati con cellule OP9-DL1...

Watch this Scientific Journal Video about Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice at JoVE.com

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

Presentato qui è un protocollo per l'effettiva soppressione della replicazione del virus dell'epatite B (HBV) nei topi utilizzando il trasferimento di cellule adottive (ACT) di antigeni virali (Ag) specifici di cellule staminali. Questa procedura può essere adattata per una potenziale immunoterapia basata su ACT dell'infezione da HBV.

Le cellule staminali derivate dall'ag virale specifico t linfociti sopprimeno la replica HBV nei topi

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel trasferimento cellulare adottivo di cellule T specifiche dell'antigene virale derivate da iPSC per una soppressione efficace della replicazione HBV nei topi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule T specifiche dell'antigene virale derivate dall'iPSC hanno un recettore delle cellule T di singolo tipo e un fenotipo ingenuo. Per la differenziazione delle cellule T positive iPSC CD8-positive dell'HBV, le lamiere s183 T receptor gene-transduced iPSCs su un monostrato OP9-DL1/DL4 in mezzo alfa-minimo integrato con siero bovino fetale al 20% e ligando murino Flt3 per la loro cocoltura in un incubatore di coltura cellulare.Monitorare regolarmente la co-coltura per valutare la morfologia cellulare. Il giorno 28, rimuovere le celle supernatanti e galleggianti e scollegare le cellule aderenti con lo 0,25% di tripside. Quando le cellule si sono alzate dal fondo del contenitore di coltura, interrompere la reazione enzimatica con otto millilitri di mezzo iPSC e raccogliere le cellule per centrifugazione.Resuspend il pellet in 10 millilitri di mezzo fresco. Diluire le cellule in una cellula T CD8-positiva derivata da iPSC a quattro splenociti pulsati da peptidi s183 per un'incubazione di 40 ore nell'incubatore di coltura cellulare. Nelle ultime sette ore, aggiungere quattro microlitri di brefeldina A diluita alla coltura, per bloccare i processi di trasporto durante l'attivazione cellulare.Macchiare le cellule per l'analisi citometrica del flusso delle citochine intracellulari di interesse secondo protocolli standard. Per l'erogazione idrodinamica del plasmide HBV attraverso la vena della coda, diluire 10 microgrammi di plasmide HBV in un equivalente dell'8% della massa corporea di PBS. Caricare il plasmide in una siringa da tre millilitri dotata di un ago da 26 e 1/2 pollice per topo.Riscaldare i topi HHD sotto una lampada termica per cinque minuti per dilatare le vene della coda e tirare con cura un topo in un limitatore di plastica. Individuare una vena laterale dilatata della coda nel terzo centrale della coda e inserire l'ago parallelo alla vena per fornire l'intero volume di plasmide attraverso la vena della coda per un periodo da tre a cinque secondi. Per il trasferimento cellulare adottivo della cellula T CD8-positive derivato da iPSC, derivato dall'antigene virale, raccogliere le cellule T cd8-positive iPSC il giorno 22 della coltura come dimostrato e seminare le cellule su un nuovo piatto di coltura cellulare di 10 centimetri.Dopo 30 minuti nell'incubatore di coltura cellulare, filtrare le cellule galleggianti attraverso un colino di nylon da 70 micrometri e contare le cellule vitali. Diluire le cellule a un 1,5 per 10 alle sette cellule per millilitro di concentrazione di PBS. Iniettare 200 microlitri di cellule in singoli topi HHD di quattro o sei settimane, nella vena della coda come appena dimostrato.Il giorno 14 dopo il trasferimento cellulare, eseguire un'erogazione idrodinamica di plasmide HBV come dimostrato. Agli endpoint sperimentali appropriati dopo l'infezione, raccogliere il fegato da ogni animale infetto e tagliare i fegati in campioni di tessuto da 0,5 per 0,5 per 0,3 centimetri. Mettere i campioni in formalina tampone neutra al 10% per quattro-24 ore, seguita da decalcificazione in acido formico 2,5 molare per sei-24 ore.Successivamente, sciacquare i campioni in xilene per tre minuti, seguiti da due risciacqui di due minuti in etanolo al 100%, 95% di etanolo e acqua deionizzata. Dopo l'ultimo lavaggio dell'acqua, decalcificare i tessuti in EDTA millimolare a 90 gradi Celsius, seguito da un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Quando il tessuto si è raffreddato, sciacquare i campioni in PBS per quattro minuti e utilizzare xilene ed etanolo per deparaffinizzare e reidratare i campioni.Per l'etichettatura immunofluorescente, macchiare le sezioni con 200 microlitri di anticorpi specifici dell'antigene superficiale HBV per due ore a temperatura ambiente in una camera umidificata dal 75 al 100%. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni con cinque lavaggi di cinque minuti in PBS fresco per ogni lavaggio. Etichettare le celle con DAPI secondo protocolli standard prima di montare le diapositive con coverlips per l'imaging mediante microscopia a fluorescenza.Per l'analisi immunoistochimica, macchiare le sezioni con ematossilina ed eosina secondo protocolli standard e valutare l'infiltrazione di cellule infiammatorie nel fegato mediante microscopia ottica. L'analisi citometrica del flusso della popolazione CD8-positiva CD3-positiva derivata da iPSC rivela che la trasduzione del recettore cellulare HBV T aumenta drasticamente la generazione di cellule T cd8 positive virali specifiche di s183. Dopo la stimolazione con splenociti impoveriti a T pulsati con peptide s183, le cellule T mono-positive CD4-negative CD8 derivate da iPSC producono grandi quantità di gamma di interferone, come rilevato dall'analisi citometrica del flusso intracellulare e dall'ELISA.Dopo l'infezione da HBV per iniezione idrodinamica, la replicazione del DNA raggiunge il sesto giorno e si riduce gradualmente, come osservato dall'analisi PCR in tempo reale. Inoltre, la replicazione virale è significativamente ridotta in tutti i punti di tempo nei topi che ricevono cellule T antigeniche virali HBV rispetto ai topi che ricevono cellule di controllo. La proteina superficiale HBV è anche notevolmente diminuita nei topi che ricevono linfociti citotossici pre-iPSC specifici dell'antigene virale HBV rispetto ai topi trattati con cellule di controllo, dimostrando chiaramente che le cellule T cd8 positive iPSC specifiche dell'antigene virale hanno la capacità di ridurre la replicazione dell'HBV in un modello murino.Ora dovresti avere una buona comprensione di come generare cellule T specifiche dell'antigene virale da iPSC per l'immunoterapia adottiva.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Metodi per valutare la morte delle cellule beta Mediata da linfociti T citotossici

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Espansione linfociti T citotossici da sangue del cordone ombelicale che Target Citomegalovirus, virus di Epstein-Barr virus, e Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Differenziazione Regia di cellule staminali pluripotenti indotte verso Linfociti T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Static Adesione saggio per lo Studio della integrina attivazione nei linfociti T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Isolamento di frazioni sub-nucleare virale replica Vano-arricchite da Adenovirus-infetti cellule normali umane

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Efficiente protocollo Isolamento da B e T linfociti umani da Palatine Tonsille

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...