Name: stem cell-derived viral ag-specific t lymphocytes suppress hbv replication in mice
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice at JoVE.com

Os autores agradecem o Dr. Adam J Gehring do Instituto de pesquisa do hospital geral de Toronto para fornecer cDNA para HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)-específico a2-restringiu genes TCR híbridos humanos-murine, e Dr. Pei-Jer Chen da Universidade Nacional de Formosa para fornecer construção de pAAV/HBV 1,2. Este trabalho é apoiado pelo Instituto Nacional de saúde Grant R01AI121180, R01CA221867 e R21AI109239 para J. S.

Todos os experimentos com animais são aprovados pelo Comitê de cuidados com animais da Universidade do Texas a & M (IACUC; #2018-0006) e são conduzidos em conformidade com as diretrizes da Associação para a avaliação e acreditação de cuidados com animais de laboratório. Os camundongos são usados durante 6 – 9 semanas de idade.
1. geração de células de t CD8+ específicas virais AG de iPSCs (células t IPSC-CD8+ )
<ol><li>Criação dos construtos retrovir...

<ol>
	<li>Scaglione, S. J., Lok, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+hepatitis+B+treatment+in+clinical+practice.">Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice.</a> Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).</li><li>Osiowy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+infancy+and+beyond...+ensuring+a+lifetime+of+hepatitis+B+virus+(HBV)+vaccine-induced+immunity.">From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).</li><li>Gish, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+HBsAg+antigen+during+treatment+with+entecavir+or+lamivudine+in+nucleoside-naive+HBeAg-positive+patients+with+chronic+hepatitis+B.">Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B.</a> Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).</li><li>Kurktschiev, P. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+virus-specific+T+cells+that+target+HBV+infected+hepatocytes+and+hepatocellular+carcinoma+cell+lines.">Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+Tumor+Necrosis+Factor-alpha+Produced+by+T+Cells+Reduce+the+HBV+Persistence+Form,+cccDNA,+Without+Cytolysis.">Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis.</a> Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).</li><li>Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+effector+CD8++T+cells+derived+from+naive+rather+than+memory+subsets+possess+superior+traits+for+adoptive+immunotherapy.">Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 117 (3), 808-814 (2011).</li><li>Kerkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+murine+CD8++and+CD4++T+cells+for+preclinical+adoptive+immunotherapy+studies.">Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies.</a> Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).</li><li>Kuball, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitating+matched+pairing+and+expression+of+TCR+chains+introduced+into+human+T+cells.">Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells.</a> Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).</li><li>van Loenen, M. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+expressing+chimeric+antigen+receptors+can+cause+anaphylaxis+in+humans.">T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans.</a> Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).</li><li>Haque, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+of+regulatory+T+cells+from+pluripotent+stem+cells+and+prevention+of+autoimmunity.">Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity.</a> Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8(+)+T+cells.">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation.">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li><li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance.">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).</li><li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct4-induced+pluripotency+in+adult+neural+stem+cells.">Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells.</a> Cell. 136 (3), 411-419 (2009).</li><li>Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+towards+T+lymphocytes.">Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3986 (2012).</li><li>Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+naive+single-type+tumor+antigen-specific+CD8++T+lymphocytes+from+murine+pluripotent+stem+cells.">Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells.</a> OncoImmunology. 6, (2017).</li><li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+Immunotherapy+in+Mice+Using+Genetically+Engineered+Pluripotent+Stem+Cells.">Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).</li><li>Tan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Expression+Profiles+of+HBV+DNA+Integrated+Into+Genomes+of+Hepatocellular+Carcinoma+Cells+to+Select+T+Cells+for+Immunotherapy.">Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Wu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6C(+)+Monocytes+and+Kupffer+Cells+Orchestrate+Liver+Immune+Responses+Against+Hepatitis+B+Virus+in+Mice.">Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice.</a> Hepatology. , (2019).</li><li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+tissue-associated+regulatory+T+cells+suppress+the+activity+of+pathogenic+cells+in+autoimmune+diabetes.">Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).</li><li>Chisari, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+pathological+effects+of+synthesis+of+hepatitis+B+virus+large+envelope+polypeptide+in+transgenic+mice.">Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).</li><li>Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+tolerance+leads+to+autoantibody+production+but+not+autoimmune+liver+disease+in+hepatitis+B+virus+envelope+transgenic+mice.">Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice.</a> Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).</li></ol>

Este protocolo apresenta um método para gerar o IPSC-CTLs AG-específico viral para o uso como o ato para suprimir a replicação de HBV em um modelo murino. Na infecção crônica por HBV, o genoma viral forma um mini cromossomo estável, o DNA circular covalentemente fechado (cccDNA) que pode persistir ao longo da vida útil do hepatócito. Alvejar o afastamento do mini cromossoma viral pode conduzir a uma cura da infecção crônica de HBV. A terapia antiviral atual visa a transcriptase reversa do vírus, mas raramen...

Após a infecção aguda, o sistema imunológico adaptativo (i.e., imunidade humoral e celular) controla a maior parte da hepatite aguda relacionada ao HBV. Ainda, um número de povos nas regiões HBV-endêmicas não pode eliminar os vírus e subseqüentemente converter como indivíduos crônicos. Mais de 25% dos pacientes crônicos (> 250 milhões de pessoas) em todo o mundo desenvolvem doença hepática progressiva, resultando em cirrose hepática e/ou carcinoma hepatocelular (HCC)1. Como resultado, a erradicação de células insistentemente infectadas permanece um problema geral de salubridade, embora haja uma vacina disponível2 e inúmeros medicamentos antivirais estão em desenvolvimento. O tratamento padrão para a infecção pelo HBV inclui análogos de IFN-α, nucleósidos e nucleotídeo. Estes agentes têm a atividade antiviral direta e capacidades modulatórias imunes. No entanto, a soroconversão do antígeno de HBe (AG)+ portadores com anticorpo anti-HBe (AB) e a perda de ácido deoxirribonucleico do HBV SÉRICO (DNA) aparecem individualmente em aproximadamente 20% dos pacientes tratados, e o controle imunológico total do vírus verificada pela privação do HBsAg não é superior a 5%3. Além disso, a resposta ao tratamento muitas vezes não é durável. A vacinação profiláctica com HBs recombinante AG é altamente eficaz em impedir a infecção, mas a vacinação terapêutica de HBs Ag não é eficaz. Claramente, as respostas imunes mediadas por células T desempenham um papel crítico no controle da infecção pelo HBV e comprometimento hepático; no entanto, em pacientes com hepatite crônica, as células T HBV-reativas são freqüentemente excluídas, disfuncionais ou convertem exaustos4,5,6. Consequentemente, em indivíduos com infecção persistente por HBV, nenhuma tentativa de restabelecer a imunidade específica do HBV (i.e., imunidade à base de células T) por meio de remédio antiviral, citocinas imuno-modulatórias ou imunização curativa alcançaram sucesso.
A transferência celular adotiva (Act) de células T específicas do HBV AG é um tratamento eficiente direcionado para eventualmente erradicar os hepatócitos remanescentes wih HBV7,8. O ato de CTLs HBV-específicos em ratos HBV-contaminados foi mostrado para causar a hepatite transiente, suave, e uma gota dramática em transcritos do ácido ribonucleico de HBV (RNA) nos hepatocytes. Nesses estudos, a CTLs não inibiu a transcrição dos genes do HBV, mas melhorou a degradação das transcrições do HBV9. As CTLs específicas do HBV são importantes para prevenir a infecção viral e mediar a depuração do HBV10,11. Para remédios baseados em ato, a expansão in vitro de células T específicas do HBV com alta reatividade para a reinstalação in vivo tem sido sugerida como um método ideal12,13,14; no entanto, as abordagens atuais são restritas em relação às suas habilidades para gerar, separar e cultivar quantidades e qualidades apropriadas de células T específicas do HBV de pacientes para as terapias potenciais.
Embora os ensaios clínicos apresentem segurança, praticidade e atividade terapêutica prospectiva de tratamentos à base de células por meio de células T projetadas que são específicas para hepatócitos infectados pelo vírus HBV, há preocupações sobre os efeitos desfavoráveis ocorrendo das respostas auto-imunes por causa do cross-Reactivity doreceptor de célulaT de misemparelhamento (TCR)15,16, reconhecimentodo AG do fora-alvo pelo TCR17 não específico e em-alvo fora-toxicidade por um receptor quimérico de AG (carro) 18 anos de , 19 com tecidos saudáveis. Atualmente, as células T geneticamente modificadas, que só têm persistência a curto prazo in vivo, são geralmente células T intermediárias ou posteriores. Até o momento, as células-tronco pluripotentes (PSCs) são a única fonte disponível para gerar alto número de células T ingênuas de tipo único AG-específico20,21,22,23. Os PSCs induzidos (iPSCs) são convertidos simplesmente das pilhas somáticas de um paciente com o uso da transdução do gene de diversos fatores da transcrição. Como resultado, os iPSCs apresentam características semelhantes às das células-tronco embrionárias (ESCs)24. Devido à flexibilidade e possibilidade para a capacidade infinita de autorenovar, além da reposição tecidual, tratamentos baseados em iPSC podem ser amplamente aplicados na medicina regenerativa. Além disso, os regimentos subjacentes iPSCs podem substancialmente melhorar terapias Cell-Based atuais.
O objetivo geral deste método é gerar uma grande quantidade de CTLs específicos do HBV de iPSCs (ou seja, iPSC-CTLs) para imunoterapia baseada em ACT. As vantagens sobre técnicas alternativas são que iPSC-CTLs específico do HBV têm um único-tipo TCR e phenotype ingênuo, que conduz a mais desenvolvimento da pilha de T da memória após o ato. É demonstrado que o ACT de iPSC-CTLs específicos do HBV aumenta a migração de células T CD8+ funcionais no fígado e reduz a replicação do HBV em ambos os fígados e sangue de camundongos administrados. Este método revela um uso potencial de iPSC-CTLs AG-específicos virais para a imunoterapia de HBV e pode ser adaptado para gerar outras pilhas AG-específicas virais de iPSC-T para a imunoterapia viral.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HHD mice</td>
			<td>Institut Pasteur, Paris, France</td>
			<td></td>
			<td>H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td>
			<td>RIKEN Cell Bank</td>
			<td>APS0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNL76/7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV/HBV1.2 plasmid</td>
			<td>Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan)</td>
			<td></td>
			<td>HBV DNA construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes</td>
			<td>Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada)</td>
			<td></td>
			<td>FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (V&#945;34 and V&#946;28)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264-specific TCR genes</td>
			<td>Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA)</td>
			<td></td>
			<td>SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 (17A2) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44 (IM7) antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>103012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 (GK1.5) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8 (53-6.7) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#947; (XMG1.2) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>506306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10490-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HBs antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MA5-13059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ABCD1234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria Fusion cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJammer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer</td>
			<td>Proimmune</td>
			<td>F027-4A - 27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Anti-Mouse Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFlt-3L</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease S7</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10107921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp MinElute Virus Spin Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>57704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stem cell-derived viral ag-specific t lymphocytes suppress hbv replication in mice

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é uma questão de saúde global. Com mais de 350 milhões pessoas afetadas em todo o mundo, a infecção pelo HBV continua sendo a principal causa de câncer hepático. Esta é uma grande preocupação, especialmente nos países em desenvolvimento. A falha do sistema imunitário para montar uma resposta eficaz de encontro ao HBV conduz à infecção crônica. Embora a vacina HBV está presente e novos medicamentos antivirais estão sendo criados, a erradicação das células de vírus-reservatório continua a ser um grande tema de saúde. Descrito aqui é um método para a geração de antígeno viral (AG)-linfócitos T citotóxicos CD8+ específicos (CTLs) derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) (ou seja, IPSC-CTLs), que têm a capacidade de suprimir a replicação do HBV. A replicação de HBV é induzida eficientemente nos ratos através da injeção hidrodinâmico de um Plasmid da expressão de HBV, de paav/HBV 1.2, no fígado. Então, a superfície de HBV AG-específico iPSC-CTLs do rato é transferida adoptivamente, que suprime extremamente a replicação de HBV no fígado e no sangue assim como impede a expressão da superfície AG de HBV nos hepatocytes. Este método demonstra a replicação de HBV nos ratos após a injeção hidrodinâmico e que os CTLs AG-específicos virais derivado da pilha de haste podem suprimir a replicação de HBV. Este protocolo fornece um método útil para a imunoterapia de HBV.

Como mostrado aqui, as células de T de iPSC-CD8+ específicas do HBV viral AG são geradas por um sistema de cultura in vitro. Após o ato destas pilhas AG-específicas virais de T IPSC-CD8+ suprimir substancialmente a replicação de HBV em um modelo murino (arquivo suplementar 1). Os IPSC do rato são transfomeados com a construção retroviral de MIDR que codifica um gene híbrido do HBV TCR do humano-rato (HBS183-191-specific, s183), a seguir os iPSCs gene-transvados...

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Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

Aqui apresentamos um protocolo para a supressão efetiva da replicação do vírus da hepatite B (HBV) em camundongos utilizando a transferência de células adotivas (ACT) de linfócitos T específicos de antígenos virais derivados de células-tronco (AG). Este procedimento pode ser adaptado para a imunoterapia baseada em ACT potencial da infecção por HBV.

Células-tronco derivadas virais AG-specific T da haste suprimir a replicação de HBV em ratos

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na transferência celular adotiva da célula T específica de antígeno viral derivada do iPSC para uma supressão eficaz da replicação do HBV em camundongos. A principal vantagem desta técnica é que as células T específicas de antígeno viral derivadas do iPSC têm um receptor de células T de um único tipo e fenótipo ingênuo. Para diferenciação de células T iPSC cd8-positivas específicas do HBV, placa s183 T receptor de células transduced iPSCs em uma monocamada OP9-DL1/DL4 em meio alfa-mínimo complementado com soro bovino 20% fetal e ligante murine Flt3 para sua co-cultura em uma incubadora de cultura celular.Monitore a co-cultura regularmente para avaliar a morfologia celular. No dia 28, remova as células supernacantes e flutuantes, e desprende as células aderentes com 0,25% de trippsina. Quando as células tiverem levantado do fundo do recipiente de cultura, pare a reação enzimática com oito mililitros do meio iPSC e colete as células por centrifugação.Resuspend a pelota em 10 mililitros de meio fresco. Diluir as células para uma célula T CD8-positiva derivada do iPSC para quatro s183 peptídeo-pulsed splenocyte razão para uma incubação de 40 horas na incubadora de cultura celular. Durante as últimas sete horas, adicione quatro microliters de brefeldin diluído A à cultura, para bloquear os processos de transporte durante a ativação celular.Manche as células para análise citométrica de fluxo das citocinas intracelulares de interesse de acordo com os protocolos padrão. Para a entrega plasmida de HBV hidrodinâmica através da veia traseira, diluir 10 microgramas de HBV plasmid em um equivalente de 8% da massa corporal de PBS. Carregue o plasmídeo em uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de 26 bitolas e 1/2 polegada por mouse.Aqueça os ratos de HHD sob uma lâmpada de calor por cinco minutos para dilatar as veias da cauda e puxe cuidadosamente um rato em um conterrante plástico. Localize uma veia traseira lateral dilatada no terço médio da cauda, e insira a agulha paralela à veia para entregar todo o volume de plasmídeo através da veia da cauda durante um período de três a cinco segundos. Para a transferência de células adoção de células T cd8-positivas derivadas de antígeno viral, colete as células T iPSC CD8-positivas no dia 22 da cultura, como demonstrado, e semee as células em um novo prato de cultura celular de 10 centímetros.Após 30 minutos na incubadora de cultura celular, filtre as células flutuantes através de um coador de nylon de 70 micrômetros e conte as células viáveis. Diluir as células para um 1,5 vezes 10 para as sete células por mililitro de concentração de PBS. Injete 200 microliters de células em camundongos HHD individuais de quatro a seis semanas de idade, na veia da cauda como apenas demonstrado.No dia 14, após a transferência celular, realize uma entrega plasmida de HBV hidrodinâmico como demonstrado. Nos pontos finais experimentais apropriados pós-infecção, colhia o fígado de cada animal infectado, e corte os fígados em amostras de tecido de 0,5 por 0,5 por 0,3 centímetros. Coloque as amostras em formalina tampão 10% neutra por quatro a 24 horas, seguida de decalcificação em ácido fórmico de 2,5 molar por seis a 24 horas.Em seguida, enxágue as amostras em xileno por três minutos, seguido por duas enxaguas de dois minutos em 100% etanol, 95% etanol e água deionizada. Após a última lavagem de água, decalcifique os tecidos em EDTA de um mililitro a 90 graus Celsius, seguido por uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente. Quando o tecido tiver esfriado, enxágue as amostras em PBS por quatro minutos e use xileno e etanol para desparafinar e reidratar as amostras.Para rotulagem imunofluorescente, colora as seções com 200 microliters de anticorpo específico de antígeno da superfície HBV por duas horas à temperatura ambiente em uma câmara de 75 a 100% umidificada. No final da incubação, lave as amostras com cinco lavagens de cinco minutos em PBS fresco para cada lavagem. Rotule as células com DAPI de acordo com os protocolos padrão antes de montar os slides com tampas para imagem por microscopia de fluorescência.Para análise imunohistoquímica, colorir as seções com hematoxilina e eosina de acordo com os protocolos padrão, e avaliar a infiltração de células inflamatórias no fígado por microscopia leve. A análise citométrica de fluxo da população CD8-positive derivada do IPSC revela que a transdução do receptor de células HBV T aumenta drasticamente a geração de células T cD8-positivas específicas do SPSC. Após a estimulação com esplenócitos t-esgotados pulsados com peptídeo s183, as células T derivadas do CD8 CD8 single-positive iPSC produzem grandes quantidades de gamma interferon, detectadas pela análise citométrica de fluxo intracelular e ELISA.Após a infecção pelo HBV por injeção hidrodinâmica, a replicação do DNA atinge o pico no sexto dia e reduz gradualmente, como observado pela análise pcr em tempo real. Além disso, a replicação viral é significativamente reduzida em todos os pontos de tempo em camundongos que recebem células T específicas antigênicas do HBV em comparação com camundongos que recebem células de controle. A proteína superficial HBV também é substancialmente diminuída em camundongos que recebem linfócitos citotóxicos pré-iPSC específicos do IPSC do HBV em comparação com camundongos tratados com células de controle, demonstrando claramente que as células T iPSC cd8 positivas específicas do antígeno viral têm a capacidade de reduzir a replicação do HBV em um modelo murino.Agora você deve ter uma boa compreensão de como gerar células T específicas de antígeno viral a partir de iPSC para imunoterapia adotiva.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Métodos para avaliar Mediated Beta Morte celular por linfócitos T citotóxicos

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Imunologia e Infecção

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Expandindo linfócitos T citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus Target, vírus de Epstein-Barr, e Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Estática Adesão Ensaio para o Estudo da integrina Ativação em Linfócitos T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Isolamento de Frações Sub-nuclear Viral Replication Compartimento enriquecidas de Adenovirus-infectados células normais Humanos

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Protocolo de isolamento eficiente para linfócitos B e T a partir de tonsilas palatinas Humanos

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...