Name: stem cell-derived viral ag-specific t lymphocytes suppress hbv replication in mice
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice at JoVE.com

Авторы благодарят д-ра Адама J Геринга из Торонто больницы научно-исследовательский институт для предоставления cDNA для HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) - конкретные A2-ограниченный человек-мурин гибридных генов TCR, и д-р Пей-Джер Чен из Национального университета Тайваня для обеспечения конструкция pAAV/HBV 1.2. Эта работа поддерживается Национальным институтом здравоохранения Грант R01AI121180, R01CA221867 и R21AI109239 до J. S.

Все эксперименты на животных одобрены Комитетом по уходу за животными Техасского университета (IACUC; #2018-0006) и проводятся в соответствии с руководящими принципами Ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных животных. Мыши используются в возрасте 6-9 недель.
1. Поколение...

<ol>
	<li>Scaglione, S. J., Lok, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+hepatitis+B+treatment+in+clinical+practice.">Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice.</a> Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).</li><li>Osiowy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+infancy+and+beyond...+ensuring+a+lifetime+of+hepatitis+B+virus+(HBV)+vaccine-induced+immunity.">From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).</li><li>Gish, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+HBsAg+antigen+during+treatment+with+entecavir+or+lamivudine+in+nucleoside-naive+HBeAg-positive+patients+with+chronic+hepatitis+B.">Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B.</a> Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).</li><li>Kurktschiev, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+CD8++T+cells+in+hepatitis+B+and+C+are+characterized+by+a+lack+of+antigen-specific+T-bet+induction.">Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).</li><li>Fisicaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+intrahepatic+T-cell+responses+can+be+restored+by+blocking+programmed+death-1+pathway+in+chronic+hepatitis+B.">Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B.</a> Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).</li><li>Schurich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+signal+cytokine+IL-12+rescues+the+anti-viral+function+of+exhausted+HBV-specific+CD8+T+cells.">The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208 (2013).</li><li>Gehring, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+virus-specific+T+cells+that+target+HBV+infected+hepatocytes+and+hepatocellular+carcinoma+cell+lines.">Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+Tumor+Necrosis+Factor-alpha+Produced+by+T+Cells+Reduce+the+HBV+Persistence+Form,+cccDNA,+Without+Cytolysis.">Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis.</a> Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).</li><li>Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunocompetent+mouse+model+for+the+tolerance+of+human+chronic+hepatitis+B+virus+infection.">An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).</li><li>Wong, P., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+responses+to+infectious+pathogens.">CD8 T cell responses to infectious pathogens.</a> Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).</li><li>Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+hepatitis+B+virus+clearance+in+chimpanzees.">Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8++T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity.">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+effector+CD8++T+cells+derived+from+naive+rather+than+memory+subsets+possess+superior+traits+for+adoptive+immunotherapy.">Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 117 (3), 808-814 (2011).</li><li>Kerkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+murine+CD8++and+CD4++T+cells+for+preclinical+adoptive+immunotherapy+studies.">Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies.</a> Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).</li><li>Kuball, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitating+matched+pairing+and+expression+of+TCR+chains+introduced+into+human+T+cells.">Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells.</a> Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).</li><li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity.">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).</li><li>Cameron, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Titin-derived+HLA-A1-presented+peptide+as+a+cross-reactive+target+for+engineered+MAGE+A3-directed+T+cells.">Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells.</a> Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).</li><li>Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-+and+CTLA-4-based+inhibitory+chimeric+antigen+receptors+(iCARs)+divert+off-target+immunotherapy+responses.">PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses.</a> Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).</li><li>Maus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+expressing+chimeric+antigen+receptors+can+cause+anaphylaxis+in+humans.">T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans.</a> Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).</li><li>Haque, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+of+regulatory+T+cells+from+pluripotent+stem+cells+and+prevention+of+autoimmunity.">Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity.</a> Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8(+)+T+cells.">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation.">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li><li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance.">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).</li><li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct4-induced+pluripotency+in+adult+neural+stem+cells.">Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells.</a> Cell. 136 (3), 411-419 (2009).</li><li>Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+towards+T+lymphocytes.">Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3986 (2012).</li><li>Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+naive+single-type+tumor+antigen-specific+CD8++T+lymphocytes+from+murine+pluripotent+stem+cells.">Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells.</a> OncoImmunology. 6, (2017).</li><li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+Immunotherapy+in+Mice+Using+Genetically+Engineered+Pluripotent+Stem+Cells.">Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).</li><li>Tan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Expression+Profiles+of+HBV+DNA+Integrated+Into+Genomes+of+Hepatocellular+Carcinoma+Cells+to+Select+T+Cells+for+Immunotherapy.">Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Wu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6C(+)+Monocytes+and+Kupffer+Cells+Orchestrate+Liver+Immune+Responses+Against+Hepatitis+B+Virus+in+Mice.">Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice.</a> Hepatology. , (2019).</li><li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+tissue-associated+regulatory+T+cells+suppress+the+activity+of+pathogenic+cells+in+autoimmune+diabetes.">Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).</li><li>Chisari, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+pathological+effects+of+synthesis+of+hepatitis+B+virus+large+envelope+polypeptide+in+transgenic+mice.">Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).</li><li>Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+tolerance+leads+to+autoantibody+production+but+not+autoimmune+liver+disease+in+hepatitis+B+virus+envelope+transgenic+mice.">Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice.</a> Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).</li></ol>

Этот протокол представляет собой метод для создания вирусных Ag-специфических iPSC-CTLs для использования в качестве ACT для подавления репликации HBV в модели murine. При хронической инфекции HBV вирусный геном образует стабильную мини-хромосому, ковалентно закрытую круговую ДНК (cccDNA), которая мо...

После острой инфекции адаптивная иммунная система (т.е. гуморальный и клеточный иммунитет) контролирует основную часть острого гепатита, связанного с ВГВ. Тем не менее, ряд людей в Эндемичных регионах HBV не могут устранить вирусы и впоследствии преобразовать в качестве хронических лиц. Более 25% хронических пациентов (250 миллионов человек) во всем мире развивают прогрессирующее заболевание печени, в результате чего цирроз печени и/или гепатоцеллюлярной карциномы (HCC)1. В результате искоренение настойчивых инфицированных клеток остается общей проблемой здоровья, несмотря на то, что имеется вакцина2 и в настоящее время разрабатывается множество противовирусных препаратов. Стандартное лечение HBV-инфекции включает в себя аналоги ИФН-З, нуклеозида и нуклеотида. Эти агенты обладают непосредственной противовирусной активностью и иммуномодулирующими способностями. Тем не менее, сероконверсия HBe антигена (Ag)- носители антител (Ab) и потеря сывороточной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) появляются индивидуально примерно у 20% пациентов, а также весь иммунологический контроль вируса проверено лишением HBsAg составляет не более 5%3. Кроме того, реакция на лечение часто не является прочной. Профилактическая вакцинация с помощью рекомбинантных HBs Ag очень эффективна в профилактике инфекции, но терапевтическая вакцинация HBs Ag неэффективна. Очевидно, что При опосредованный Т-клеточными иммунными реакциями играет решающую роль в борьбе с инфекцией ВГВ и нарушением функции печени; однако, в хронических больных гепатитом, HBV-реактивные Т-клетки часто удаляются, дисфункциональные, или конвертировать исчерпаны4,5,6. Следовательно, у людей с постоянной инфекцией ВГВ не удалось ни одного попытки восстановить иммунитет, специфический вХВ (т.е. Т-клеточный иммунитет) с помощью противовирусного средства, иммуномодулирующих цитокинов или лечебной иммунизации.
Приемная передача клеток (ACT) HBV Ag-специфических Т-клеток является эффективным лечением, направленным на то, чтобы в конечном итоге искоренить оставшиеся гепатоциты wih HBV7,8. ACT HBV-специфических CTLs в HBV-инфицированных мышей было показано, что причиной переходного, легкого гепатита, и резкое падение ВГВ рибонуклеиновой кислоты (РНК) стенограммы в гепатоцитов. В этих исследованиях, CTLs не ингибировать транскрипцию генов HBV но усилил деградацию транскриптов HBV9. HBV-специфических CTL важны для предотвращения вирусной инфекции и посредничать в очистке HBV10,11. Для ACT основе средств правовой защиты, in vitro расширение HBV-специфических Т-клеток с высокой реактивностью для переселения in vivo было предложено быть идеальным методом12,13,14; тем не менее, нынешние подходы ограничены в отношении их способности генерировать, отделять и расти соответствующие количества и качества HBV-специфических Т-клеток от пациентов для потенциальных методов лечения.
Хотя клинические испытания представляют безопасность, осуществимость и перспективную терапевтическую активность клеточного лечения с помощью инженерных Т-клеток, которые специфичны для Инфицированных вирусом ВпГ гепатоцитов, есть опасения по поводу неблагоприятных последствий происходящих из аутоиммунных реакций из-за перекрестной реактивности от неправильного T-клеточного рецептора (TCR)15,16, вне целевого распознавания Ag неспецифическим TCR17 и на цель вне токсичности химерных рецепторов Ag (CAR) 18 лет , 19 со здоровыми тканями. В настоящее время генетически модифицированные Т-клетки, которые имеют только краткосрочную стойкость in vivo, обычно являются промежуточными или более поздними Т-клетками. На сегодняшний день, плюрипотентные стволовые клетки (PSCs) являются единственным источником для создания большого количества наивных однотипных Ag-специфических Т-клеток20,21,22,23. Индуцированные ПЦ (iPSCs) просто преобразуются из соматических клеток пациента с помощью трансдукции генов нескольких транскрипционных факторов. В результате, iPSCs имеют те же характеристики, как у эмбриональных стволовых клеток (ESCs)24. Благодаря гибкости и возможности для бесконечной способности к самообновлению, в дополнение к замене тканей, iPSC основе лечения могут быть широко применены в регенеративной медицине. Кроме того, полки, лежащие в основе iPSCs, могут существенно улучшить текущую клеточную терапию.
Общая цель этого метода заключается в генерации большого количества HBV-специфических CtLs из iPSCs (т.е. iPSC-CTLs) для иммунотерапии на основе АКТ. Преимущества по сравнению с альтернативными методами в том, что HBV-специфические iPSC-CTL имеют однотипный TCR и наивный фенотип, что приводит к большему развитию Т-клеток памяти после ACT. Показано, что ACT HBV-специфических iPSC-CTLs увеличивает миграцию функциональных CD8и Т-клеток в печени и уменьшает репликацию HBV как в печени, так и в крови управляемых мышей. Этот метод показывает потенциальное использование вирусных Ag-специфических iPSC-CTL для иммунотерапии HBV и может быть адаптирован для генерации других вирусных Ag-специфических iPSC-T-клеток для вирусной иммунотерапии.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HHD mice</td>
			<td>Institut Pasteur, Paris, France</td>
			<td></td>
			<td>H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td>
			<td>RIKEN Cell Bank</td>
			<td>APS0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNL76/7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV/HBV1.2 plasmid</td>
			<td>Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan)</td>
			<td></td>
			<td>HBV DNA construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes</td>
			<td>Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada)</td>
			<td></td>
			<td>FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (V&#945;34 and V&#946;28)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264-specific TCR genes</td>
			<td>Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA)</td>
			<td></td>
			<td>SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 (17A2) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44 (IM7) antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>103012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 (GK1.5) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8 (53-6.7) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#947; (XMG1.2) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>506306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10490-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HBs antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MA5-13059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ABCD1234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria Fusion cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJammer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer</td>
			<td>Proimmune</td>
			<td>F027-4A - 27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Anti-Mouse Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFlt-3L</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease S7</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10107921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp MinElute Virus Spin Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>57704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stem cell-derived viral ag-specific t lymphocytes suppress hbv replication in mice

Инфекция, связанная с вирусом гепатита В (HBV), является глобальной проблемой здравоохранения. С более чем 350 миллионов людей, пострадавших во всем мире, HBV инфекции остается ведущей причиной рака печени. Это вызывает серьезную озабоченность, особенно в развивающихся странах. Неспособность иммунной системы смонтировать эффективный ответ против HBV приводит к хронической инфекции. Хотя вакцина против ог. ВГВ присутствует и создаются новые противовирусные препараты, искоренение вирусно-резервуарных клеток остается одной из основных тем для здоровья. Описано здесь метод для генерации вирусного антигена (Ag) -специфические CD8и цитотоксические Т-лимфоциты (CtL), полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) (т.е. iPSC-CTL), которые имеют возможность подавлять репликацию HBV. Репликация HBV эффективно индуцируется у мышей через гидродинамический инъекций плазмиды экспрессии HBV, pAAV/HBV1.2, в печень. Затем, HBV поверхности Ag-специфической мыши iPSC-CTLs являются приемно переданы, что значительно подавляет репликации HBV в печени и крови, а также предотвращает HBV поверхности Ag выражение в гепатоцитов. Этот метод демонстрирует репликацию HBV у мышей после гидродинамических инъекций и что стволовые клетки, полученные вирусных Ag-специфических CTL может подавить репликацию HBV. Этот протокол предоставляет полезный метод иммунотерапии HBV.

Как показано здесь, HBV вирусных Ag-специфических iPSC-CD8и Т-клетки генерируются системой культуры in vitro. После ACT этих вирусных Ag-специфических iPSC-CD8- Т-клеток существенно подавляют репликацию HBV в модели мурина(Дополнительный файл 1). Мышь iPSC трансумции с MIDR ретровирусной...

Watch this Scientific Journal Video about Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice at JoVE.com

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

Представлен протокол для эффективного подавления вируса гепатита В (HBV) репликации у мышей с помощью приемной передачи клеток (ACT) стволовых клеток полученных вирусных антигенов (Ag)-специфических Т-лимфоцитов. Эта процедура может быть адаптирована для потенциальной аСТ на основе иммунотерапии HBV инфекции.

Стволовые клетки- производные вирусные Ag-специфические T Лимфоциты подавить HBV репликации у мышей

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в приемной передачи клеток iPSC полученных вирусных антиген-специфических Т-клеток для эффективного подавления репликации HBV у мышей. Основным преимуществом этой техники является то, что iPSC полученных вирусных антиген-специфических Т-клеток имеют один тип Т-клеточных рецепторов и наивный фенотип. Для дифференциации HBV-специфических iPSC CD8-положительных Т-клеток, пластина s183 T-клеточных рецепторов ген-трансфуцированных iPSCs на OP9-DL1/DL4 монослой в альфа-минимум среды дополняется 20%фетальной сыворотки крупного рогатого скота и murine Flt3 лиганд для их совместной культуры в инкубаторе клеточной культуры.Регулярно следите за совместной культурой для оценки морфологии клеток. На 28-й день удалите супернатантные и плавающие клетки и отсоедините клетки-адепты 0,25%трипсином. Когда клетки поднимаются со дна контейнера культуры, остановить энзиматической реакции с восемью миллилитров iPSC среды, и собирать клетки центрифугации.Переусердуйте гранулы в 10 миллилитров свежей среды. Разбавить клетки до одного iPSC-производных CD8-положительных Т-клеток до четырех s183 пептид-импульсный спланоцитов соотношение для 40-часовой инкубации в инкубаторе клеточной культуры. В течение последних семи часов добавьте в культуру четыре микролитера разбавленного брефельдина А, чтобы блокировать транспортные процессы во время активации ячейки.Пятно клеток для потока цитометрического анализа внутриклеточных цитокинов, представляющих интерес в соответствии со стандартными протоколами. Для гидродинамической плазмидной доставки HBV через хвостовую вену разбавляют 10 микрограммов плазмиды HBV в 8%эквивалентной массе тела PBS. Загрузите плазмид в один трехми миллилитровый шприц, оснащенный 26-дюймовой иглой на мышь.Нагрейте мышей HHD под тепловой лампой в течение пяти минут, чтобы расширить хвостовые вены, и осторожно потяните мышь в пластиковый хеверитель. Найдите расширенную боковой хвостовой вены в средней трети хвоста и вставьте иглу параллельно вене, чтобы доставить весь объем плазмиды через хвостовую вену в течение трех-пяти секунд. Для вирусных антиген-специфических iPSC-производных CD8-положительных Т-клеток приемной передачи клеток, собирать iPSC CD8-положительных Т-клеток на 22-й день культуры, как попродемонстрировано, и семян клеток на новый 10-сантиметровый элемент культуры блюдо.После 30 минут в инкубаторе культуры клеток, фильтруйте плавающие клетки через 70-микрометровый нейлоновый ситечко, и подсчитайте жизнеспособные клетки. Разбавить клетки в 1,5 раза от 10 до семи клеток на миллилитр концентрации PBS. Ввими 200 микролитров клеток в отдельных четырех-шестинедельных мышей HHD, в хвостовую вену, как только что продемонстрировано.На 14-й день после переноса ячейки выполните гидродинамическую плазмиду HBV, как это было продемонстрировано. В соответствующих экспериментальных конечных точках после заражения, урожай печени от каждого инфицированного животного, и сократить печени на 0,5-на-0,5 на 0,3-сантиметровой ткани образцов. Поместите образцы в 10%нейтральный буфер формалин в течение четырех-24 часов, а затем декалкации в 2,5-молярной формовой кислоты в течение шести-24 часов.Затем промыть образцы в ксилене в течение трех минут, а затем две две минуты полоскания в 100% этанола, 95% этанола, и деионизированной воды. После последнего мытья воды, decalcify тканей в один миллимолярной EDTA при температуре 90 градусов по Цельсию, а затем 30-минутный инкубации при комнатной температуре. Когда ткань остынет, промыть образцы в PBS в течение четырех минут, и использовать ксилен и этанол для депарафинизации и регидратации образцов.Для иммунофлуоресцентной маркировки, пятно разделов с 200 микролитров ВГВ поверхности антиген-специфических антител в течение двух часов при комнатной температуре в 75 до 100% увлажненной камеры. В конце инкубации, мыть образцы с пятью пять минут моет в свежем PBS для каждой стирки. Наклеить клетки с DAPI в соответствии со стандартными протоколами перед монтажом слайдов с крышками для визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии.Для иммуногистохимического анализа, пятно разделов с гематоксилином и эозином в соответствии со стандартными протоколами, и оценить проникновение воспалительных клеток в печень с помощью легкой микроскопии. Поток цитометрического анализа iPSC полученных CD3-положительных CD8-положительной популяции показывает, что HBV Т-клеток рецепторов трансдукции резко увеличивает генерацию вирусных s183-специфических CD8-положительных Т-клеток. После стимуляции с Т-обедненных спеноцитов пульсировал с s183 пептид, CD4-отрицательный CD8 одно-положительных IPSC полученных Т-клеток производят большое количество интерферона гамма, как обнаружено внутриклеточного потока цитометрического анализа и ELISA.После инфекции ВГВ путем гидродинамической инъекции репликация ДНК достигает пика на шестой день и постепенно уменьшается, как это наблюдается при анализе ПЦР в режиме реального времени. Кроме того, вирусная репликация значительно снижается в любое время точки у мышей, которые получают HBV вирусных антигенных конкретных Т-клеток по сравнению с мышами, которые получают контрольные клетки. HBV поверхностный белок также существенно снижается у мышей, которые получают HBV вирусный антиген-специфических до iPSC цитотоксических лимфоцитов по сравнению с мышами, обработанных контрольными клетками, ясно демонстрируя, что вирусный антиген-специфический iPSC CD8-положительные Т-клетки имеют возможность уменьшить репликацию HBV в модели murine.Теперь вы должны иметь хорошее понимание того, как генерировать вирусные антиген-специфические Т-клетки из iPSC для приемной иммунотерапии.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Методы оценки бета опосредованная гибель клеток от цитотоксических Т-лимфоцитов

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Генерация Multivirus конкретным Т-клеток по предотвращению / лечения вирусных инфекций после аллогенной трансплантации стволовых клеток

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Расширение цитотоксических Т-лимфоцитов из пуповинной крови, что целевая цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр Вирус, и аденовирус

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по отношению к Т-лимфоцитов

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Выделение и Th17 дифференцировки наивных CD4 Т-лимфоцитов

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Статический Адгезия Анализ по изучению активации интегрина в Т-лимфоцитов

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Выделение вирусной репликации отсек обогащенных субъядерных фракций из аденовируса-инфицированных клетках человека нормальный

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Эффективное протокол Изоляция для B и Т-лимфоциты из небных миндалин человека

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Визуализация IL-22-экспрессирующих Лимфоциты Использование Reporter Мыши

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...