Name: radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines
Uploaded: 2019-08-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81402535 و 81672969) والمشروع الوطني للبحث والتطوير الرئيسي (2016YFC0904703).

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات تحت درجة الحرارة المشار إليها. بالنسبة للخطوات التي لا يتم فيها ذكر درجة الحرارة، قم بالأداء تحت درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية). يجب تخزين وسيط ثقافة الخلية عند درجة حرارة 4 درجة مئوية، وينبغي تخزين الكواشف الأخرى وفقًا لأدلة الشركة المصنعة. يجب أن تكون متوسطة ق...

<ol>
	<li>Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+as+a+predictive+factor+in+radiotherapy.">Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy.</a> Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).</li><li>Baumann, M., Krause, M., Hill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+role+of+cancer+stem+cells+in+radioresistance.">Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance.</a> Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).</li><li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells--perspectives+on+current+status+and+future+directions:+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells.">Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Wang, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+regulation+of+CHK1+and+CHK2+promotes+radioresistance+in+a+stem+cell-like+population+of+nasopharyngeal+carcinoma+cells.">MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells.</a> Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).</li><li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+reactive+oxygen+species+levels+and+radioresistance+in+cancer+stem+cells.">Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).</li><li>Gomez-Casal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-small+cell+lung+cancer+cells+survived+ionizing+radiation+treatment+display+cancer+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+phenotypes.">Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes.</a> Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).</li><li>Mihatsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+radioresistant+tumor+cells+and+presence+of+ALDH1+activity+in+vitro.">Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro.</a> Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).</li><li>Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit+(CACNA2D1)+enhances+radioresistance+in+cancer+stem-like+cells+in+non-small+cell+lung+cancer+cell+lines.">Calcium channel &#945;2&#948;1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines.</a> Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1B50-1,+a+mAb+raised+against+recurrent+tumor+cells,+targets+liver+tumor-initiating+cells+by+binding+to+the+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit.">1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel &#945;2&#948;1 subunit.</a> Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).</li><li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance:+Cancer+stem+cell.">Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell.</a> Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).</li><li>Zhang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+decarboxylase+activity+drives+non-small+cell+lung+cancer+tumor-initiating+cells+and+tumorigenesis.">Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis.</a> Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+self-renewal.">Cancer stem cells and self-renewal.</a> Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).</li><li>Morgan, M. A., Lawrence, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways:+overcoming+radiation+resistance+by+targeting+DNA+damage+response+pathways.">Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways.</a> Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+exploration+of+cancer+stem+cell+marker+voltage-dependent+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit-mediated+chemotherapy+resistance+in+small-cell+lung+cancer.">Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel &#945;2&#948;1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer.</a> Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول طرق دراسة الحساسية الإشعاعية لـ CSCs في خطوط الخلايا السرطانية في المختبر. في هذه الدراسة، والتعبير عن α2δ1 مستمر في خطوط الخلايا NSCLC. لذلك، يستند gating على عنصر تحكم isotype. قبل الفرز، يجب فحص تعبير α2δ1 في خطوط خلايا متعددة بواسطة قياس التدفق الخلوي والتحقق من صحتها بواسطة QPCR أ?...

يلعب العلاج الإشعاعي دورًا مهمًا في علاج السرطان. ومع ذلك، فإن وجود الخلايا الجذعية السرطانية المقاومة للأشعة (CSCs) قد يؤدي إلى الانتكاس أو النتائج السيئة بعد العلاج الإشعاعي1،2. وتتميز CSCs من خلال قدرتها على التجديد الذاتي والقدرة على توليد الخلايا السرطانية غير المتجانسة3. مدرعة مع قدرة إصلاح تلف الحمض النووي أكثر كفاءة أو مستويات أعلى من أنظمة المسح الجذورالحرة أو غيرها من الآليات، CSCs هي مقاومة نسبيا للعلاج الإشعاعي 4،5،6،7 , 8.تحديد علامات CSC واستكشاف آلياتها سوف تسهل تطوير الأدوية التي من شأنها التغلب على المقاومة الإشعاعية دون زيادة تلف الأنسجة الطبيعية.
تم الإبلاغ عن قناة الكالسيوم المسورة بالجهد α2δ1 وحدة isoform 5 كعلامة لCSCs المقاومة للراديو في خطوط الخلايا NSCLC9. تم تحديد α2δ1 في الأصل كعلامة CSC لسرطان الخلايا الكبدية (HCC)10. باستخدام التحصين الطرحي مع زوج من خطوط الخلايا HCC المستمدة من الأورام الأولية والمتكررة في نفس المريض، تم تحديد جسم مضاد اسمه 1B50-1 لاستهداف خلايا HCC المتكررة على وجه التحديد. 1B50-1-إيجابية أظهرت الخلايا كفاءة تشكيل المجال عالية في المختبر والورم العالي في الجسم الحي. تم تحديد مستضدها عن طريق قياس الطيف الكتلي، كقناة الكالسيوم α2δ1 الوحدة الفرعية isoform 5. α2δ1 يعبر على وجه التحديد في CSCs وغير قابل للكشف في معظم الأنسجة العادية، مما يجعلها مرشح محتمل لاستهداف CSCs 10. α2δ1 يمكن أيضا أن تكون بمثابة علامة CSC لخطوط الخلايا NSCLC، وقد ثبت لنقل المقاومة الراديوية لخلايا NSCLC جزئيا عن طريق تعزيز كفاءة إصلاح تلف الحمض النووي استجابة للإشعاع9.
دراسة CSCs مقاومة للراديو قد توفر أدلة للتغلب على المقاومة الراديوية. باستخدام α2δ1 في NSCLC كمثال، يتم عرض الأساليب الرئيسية لدراسة حساسية الراديو من CSCs. عادة، يتم عزل CSCs مع علامة السطح المفترضة، ويتم مقارنة خصائص الخلايا الجذعية والحساسية الإشعاعية من مجموعات الخلايا الإيجابية والسلبية. تشكيل المجال في وسط خالية من المصل تكملها عوامل النمو التي تدعم التجديد الذاتي هو فحص مفيد لتقييم جذع الخلايا في المختبر. الخلايا ذات القدرة العالية على تشكيل المجال من المرجح أن تظهر ورم عالية عند حقنها في الفئران التي تعاني من نقص المناعة10،11،12. ثم يتم استخدام فحص تشكيل المستعمرة لتقييم الحساسية الإشعاعية للخلايا، والتي تحدد عدد الذين فقدوا القدرة على توليد أحفاد تشكيل المستعمرة بعد جرعة من الإشعاع13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B50-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel &#945;2&#948;1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% formaldehyde solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12500062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer/cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSARIA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1975</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_1511</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightning-Link Fluorescein Kit</td>
			<td>Innova Biosciences</td>
			<td>310-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linear accelerator</td>
			<td>VARIAN</td>
			<td>CLINAC 600C/D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBRGREEN</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>QPK-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Violet crystal staining solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines

ارتبط وجود الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) بالانتكاس أو النتائج السيئة بعد العلاج الإشعاعي. دراسة CSCs مقاومة للراديو قد توفر أدلة للتغلب على المقاومة الراديوية. تم الإبلاغ عن قناة الكالسيوم ذات البوابات الجهدية α2δ1 الوحدة الفرعية isoform 5 كعلامة لCSCs المقاومة للأشعة في خطوط الخلايا غير الصغيرة سرطان الرئة الخلية (NSCLC). باستخدام قناة الكالسيوم α2δ1 الفرعية كمثال على علامة CSC، يتم عرض طرق لدراسة حساسية الراديو من CSCs في خطوط الخلايا NSCLC. يتم فرز CSCs مع علامات المفترضة عن طريق قياس التدفق، ويتم تقييم قدرة التجديد الذاتي للخلايا التي تم فرزها عن طريق فحص تشكيل المجال. ثم يتم إجراء فحص تشكيل المستعمرة، الذي يحدد عدد الخلايا التي تفقد القدرة على توليد أحفاد تشكيل المستعمرة بعد جرعة معينة من الإشعاع، لتقييم الحساسية الإشعاعية للخلايا المصنفة. تقدم هذه المخطوطة خطوات أولية لدراسة الحساسية الإشعاعية لـ CSCs، والتي ترسي الأساس لزيادة فهم الآليات الأساسية.

تم فرز خلايا A549 عالية α2δ1 وα2δ1 منخفضة (الشكل 1A). قد تظهر بعض العلامات مجموعات سكانية متميزة وسهلة البوابات. ومع ذلك، تظهر بعض العلامات فقط أنماط التعبير العالية والمنخفضة، بدلاً من مجموعات سكانية إيجابية وسلبية متميزة. في هذه الحالة، عنصر تحكم نوع isotype مهم جداً للزماة. يتم ا...

Watch this Scientific Journal Video about Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines at JoVE.com

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

وقد ارتبط وجود الخلايا الجذعية السرطانية مع الانتكاس أو النتائج السيئة بعد العلاج الإشعاعي. تصف هذه المخطوطة طرق دراسة الحساسية الإشعاعية للخلايا الجذعية السرطانية في خطوط خلايا سرطان الرئة.

الحساسية الإشعاعية للخلايا الجذعية السرطانية في خطوط خلايا سرطان الرئة

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

هذا البروتوكول مهم لأن وجود الخلايا الجذعية السرطانية قد يكون مرتبطا مع الانتكاس أو نتيجة سيئة بعد العلاج الإشعاعي. دراسة الخلايا الجذعية الراديو ريسستانت قد توفر أدلة للتغلب على رادريستينس. في هذه التقنية ، يتم املاح الخلايا الجذعية السرطانية مع علامات وضعية عن طريق تدفق cytometry والقدرة على التجديد الذاتي للخلايا المملحة يتم تقييمها عن طريق قياس تشكيل الكرة.يتم إجراء فحص القولون لتقييم حساسية الراديو للخلايا المملحة. وهو يحدد عدد الخلايا التي فقدت قدرتها على توليد التوليف الذي يشكل المستعمرة بعد جرعة معينة من الإشعاع. تقدم هذه المخطوطة الخطوات القليلة الأولية لدراسة الحساسية الإشعاعية للخلايا الجذعية السرطانية، والتي تضع الأساس لدراسة آلية أكمل.قد تشمل دراسة الآلية البروتينات المتعلقة بإصلاح الضرر بالحمض النووي، وتطهير أنواع الأكسجين التفاعلية، واعتقال دورة الخلايا، وما إلى ذلك. وسوف توفر رؤى هامة في كيفية الخلايا الجذعية السرطانية الحصول على المقاومة الإشعاعية وكيفية التغلب على المقاومة. إثبات إجراء الإشعاع سيكون تشن نان لي، فني إشعاع من قسمنا.لبدء هذا الإجراء، والخلايا A549 ثقافة في دورة 1640- 1640 المتوسطة تكملها 10٪ FBS في 10 أطباق سنتيمتر في 37 درجة مئوية، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80 إلى 90٪، قم بإزالة الوسيطة الخاصة بالثقافة. غسل الخلايا لفترة وجيزة مع ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني.بعد ذلك، إضافة ثلاثة ملليلتر من 0.05٪ التربسين إلى كل طبق. إزالة التربسين وترك التربسين residuary لهضم الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق. تحقق من انفصال الخلايا بشكل متكرر لتجنب الإفراط في الهضم.عندما تصبح الخلايا فضفاضة وتبدأ في الانفصال عن الأطباق، إضافة ثلاثة ملليلتر من 1640- 1640 دورة في الدقيقة المتوسطة تكملها 10٪ FBS ونقل تعليق الخلايا إلى أنبوب 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 300 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل افراط وإعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.نقل 0.5 ملليلتر من تعليق الخلية إلى أنبوب جديد كتحكم في النمط الأيزونمطي. أجهزة الطرد المركزي على حد سواء التحكم والأنابيب التجريبية في 300 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل المُنَاتس الخارقين.ثم، وتمييع كل من الفلورسنت ثنائي التحكم isotype والأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني إلى التركيز الأمثل الثدي لإعداد حل العمل. إعادة تعليق السيطرة والخلايا التجريبية مع كل حل العمل ومزيج بلطف. احتضان العينات في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 40 دقيقة.غسل الخلايا عن طريق إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، وخلط بلطف، وslyruging في 300 مرة ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatants وإعادة تعليق الخلايا مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. بعد ذلك، ضع 40 مصافي خلايا ميكرومتر على أنابيب جديدة 50 ملليلتر، مع التأكد من إعداد أنبوب منفصل وإعداد مصفاة للسيطرة والخلايا التجريبية.تطبيق كل تعليق الخلية على مصفاة كل منها وجمع flowthrough. الطرد المركزي من خلال تدفق في 300 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل افراط و resuspend الخلايا مع 0.2 إلى 1.0 ملليلتر من برنامج تلفزيوني ونقل كل تعليق الخلية في أنبوب منفصل خمسة ملليلتر لعملية استئصال الخلايا تدفق.في خزانة السلامة البيولوجية، إعداد واحد ستة لوحة جيدا لكل جرعة الإشعاع، بما في ذلك المجموعة الرمادية صفر. إضافة 1.5 ملليلتر من وسائل الإعلام 1640 الانتهاء إلى كل بئر. تمييع الخلايا المقطوعة مع الانتهاء 1640 وسائل الإعلام إلى كثافة الخلية من 1،000 خلية في المليلتر.ثم، إضافة تعليق الخلية المخففة إلى الآبار وتهز لوحات أفقيا لتوزيع الخلايا بالتساوي في الآبار. سجل حجم المضافة في كل مجموعة جرعة. ثقافة في 37 درجة مئويّة مع 5٪ ثاني أكسيد كربون.بعد أن تعلق الخلايا على الجزء السفلي من الآبار، إضافة الانتهاء 1640 وسائل الإعلام إلى كل بئر حتى ارتفاع وسائل الإعلام تصل إلى سنتيمتر واحد. عندما يتم نقل لوحات بين غرفة ثقافة الخلية وغرفة العلاج الإشعاعي، والتفاف لوحات مع رقائق الألومنيوم أو وضعها في صندوق نظيف لتجنب التلوث. عقد لوحات مسطحة لتجنب تسرب المتوسطة.بعد ذلك، تعيين في 20 سم في 20 سم حقل الإشعاع. وضع bolة مكافئة من الأنسجة 1.0 سم سمك على الأريكة العلاج ووضع لوحة ستة جيدا على bolus لإبقائهم في اتصال. تأكد من أن اللوحة كلها داخل مجال الإشعاع.تعيين المسافة مصدر الجلد كما 100 سم وضبط ارتفاع الأريكة العلاج لمحاذاة مستوى السطح المتوسط إلى مستوى الليزر. تسليم الجرعة المخصصة لكل لوحة في تسلسل. بعد هذا، خذ اللوحات إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية في غرفة ثقافة الخلية.استبدال المتوسطة في كل بئر مع مليلتر اثنين من 1640 المتوسطة المكتملة. ثقافة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، مع التأكد من تغيير المتوسطة كل ثلاثة إلى خمسة أيام. بعد سبعة إلى 10 أيام من الإشعاع، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا لفترة وجيزة باستخدام PBS.في غطاء الدخان، إضافة ملليلتر واحد من 4٪ الفورمالديهايد إلى كل بئر لإصلاح الخلايا لمدة 10 دقائق. ثم، إزالة الفورمالديهايد وغسل كل بئر مرتين باستخدام مليلترين من الماء المقطر لكل غسل. إضافة ملليلتر واحد من 1٪ حل البقع البنفسجية الكريستال لكل بئر وصمة عار لمدة 10 دقائق.بعد ذلك، قم بإزالة محلول البقع البنفسجية الكريستالي وغسل الخلايا ثلاث مرات بالماء المقطر. إزالة الماء والسماح للوحات الهواء الجافة لمدة 30 دقيقة. عد عدد المستعمرات مع أكثر من 50 خلية.في هذه الدراسة، يتم فرز كل من ألفا اثنين دلتا واحد عالية وألفا اثنين دلتا واحد الخلايا A549 منخفضة. قد تظهر بعض العلامات مجموعات سكانية متميزة وسهلة الوصول إلى البوابة. ومع ذلك، تظهر بعض العلامات فقط أنماط التعبير العالية والمنخفضة، بدلاً من مجموعات سكانية إيجابية وسلبية مميزة.في هذه الحالة، عنصر تحكم isotype مهم جداً لـ gating. يتم التحقق من صحة تعبير ألفا اثنين دلتا واحد في الخلايا المفجوزة بواسطة qPCR. التعبير عن CACNA2D1، الجين الذي يشفّر ألفا اثنين دلتا واحد، هو أعلى في فرز ألفا اثنين دلتا واحد خلايا عالية مقارنة مع ألفا اثنين دلتا واحد الخلايا المنخفضة.يظهر الشكل النموذجي للمجالات وكفاءة تكوين الكرة هنا. ألفا اثنين دلتا واحد خلايا عالية تظهر كفاءة أعلى تشكيل المجال، مما يشير إلى قدرة أعلى للتجديد الذاتي. وتظهر هنا صور نموذجية للمستعمرات ومنحنيات البقاء على قيد الحياة.يمكن فحص مستعمرة بها حوالي 50 خلية تحت المجهر ووضع علامة عليها كمرجع. يتم حساب عدد المستعمرات ، ثم يمكن حساب جزء من البقاء على قيد الحياة في كل جرعة ويمكن رسم منحنى البقاء على قيد الحياة. ألفا اثنين دلتا واحد خلايا عالية مقاومة نسبيا للإشعاع مقارنة ألفا اثنين دلتا واحد الخلايا المنخفضة.وينبغي أن يتم تنفيذ أي خطوات تتعلق بثقافة الخلية في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية أو مقاعد البدلاء النظيفة laminar. لتجنب التلوث ، يوصى بإضافة المضادات الحيوية إلى الوسط الثقافي بعد الفرز. عندما يتم تحديد علامة الخلايا الجذعية السرطان المفترضة مبدئيا من قبل تحليل تشكيل المجال، ويمكن إجراء مزيد من التوصيف في vivo الحد من مُقايسة التخفيف لتقييم القدرة الورمية.من دراسة آلية من شعاعية ا أطيق، يمكن للباحثين فحص البروتين المتصلة إصلاح الضرر الحمض النووي، وإزالة أنواع الأكسجين التفاعلية، ودورة الخلية اعتقال استجابة للإشعاع. أثناء إشعاع الخلية، يرجى ملاحظة أنه لا يمكن تشغيل المسرع الخطي إلا من قبل فنيين مؤهلين. الابتعاد عن الإشعاع.أثناء الوقوف، يرجى ملاحظة أن الفورمالديهايد متقلبة وخطرة. استخدام الفورمالديهايد في غطاء الدخان.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

بروتوكول للثقافة السريع بعد الوفاة خلية من منتشر الجوهرية جسري بالورم الدبقي (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

إنشاء مقايسة الاستعمار الرئة لتعميم التصور خلية الورم في أنسجة الرئة

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

تلطيخ مطاطي على الشرائح جزءا لا يتجزأ من البارافين من أنسجة سرطان المعدة pT3N0M0

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة اللب والثقافة المشتركة مع الخلايا السرطانية لدراسة التفاعلات الخاصة بها

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

إنشاء وتوصيف ثلاثة خطوط الخلايا المضادة للأدينوسرطان الرئة مقاومة للأفاتينب PC-9 مع جرعات متزايدة من Afatinib

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

تحليل مقياس التدفق لأنواع الأكسجين التفاعلي الميتوكوندريا في الجذعية المكونة للدم وخلايا البروجينوتريو وابيضاض الدم المدفوع MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

تميز المسوخ ذات الصلة بالأمراض من Kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني باستخدام مجموعة من الأساليب العملية والممكنة

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

إنشاء نماذج Xenograft المستمدة من سرطان المعدة وخطوط الخلايا الأولية

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

شبه التلقائي PD-L1 توصيف وتعداد الخلايا السرطانية المتداولة من غير الصغيرة خلية سرطان الرئة المرضى عن طريق الفلورة المناعية

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث لتوليد خلايا T الأورام مستضد محدده

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...