Name: radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines
Uploaded: 2019-08-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation i Kina (81402535 og 81672969) og nationalt nøgle forsknings-og udviklingsprojekt (2016YFC0904703).

Bemærk: der udføres trin under den angivne temperatur. For trin, hvor temperaturen ikke er nævnt, udføres under stuetemperatur (18 – 25 °C). Celle dyrkningsmediet skal opbevares ved 4 °C, og andre reagenser skal opbevares i overensstemmelse med producentens vejledninger. Medium skal præ-varmes til 37 °C, før de tilsættes til celler.
1. celle sortering
<ol><li>Konjugation af antistoffer Bemærk: i betragtning af den kortere inkubationstid foretrækkes direkte mærket antistof t...

<ol>
	<li>Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+as+a+predictive+factor+in+radiotherapy.">Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy.</a> Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).</li><li>Baumann, M., Krause, M., Hill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+role+of+cancer+stem+cells+in+radioresistance.">Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance.</a> Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).</li><li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells--perspectives+on+current+status+and+future+directions:+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells.">Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Wang, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+regulation+of+CHK1+and+CHK2+promotes+radioresistance+in+a+stem+cell-like+population+of+nasopharyngeal+carcinoma+cells.">MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells.</a> Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).</li><li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+reactive+oxygen+species+levels+and+radioresistance+in+cancer+stem+cells.">Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).</li><li>Gomez-Casal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-small+cell+lung+cancer+cells+survived+ionizing+radiation+treatment+display+cancer+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+phenotypes.">Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes.</a> Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).</li><li>Mihatsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+radioresistant+tumor+cells+and+presence+of+ALDH1+activity+in+vitro.">Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro.</a> Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).</li><li>Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit+(CACNA2D1)+enhances+radioresistance+in+cancer+stem-like+cells+in+non-small+cell+lung+cancer+cell+lines.">Calcium channel &#945;2&#948;1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines.</a> Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1B50-1,+a+mAb+raised+against+recurrent+tumor+cells,+targets+liver+tumor-initiating+cells+by+binding+to+the+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit.">1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel &#945;2&#948;1 subunit.</a> Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).</li><li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance:+Cancer+stem+cell.">Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell.</a> Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).</li><li>Zhang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+decarboxylase+activity+drives+non-small+cell+lung+cancer+tumor-initiating+cells+and+tumorigenesis.">Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis.</a> Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+self-renewal.">Cancer stem cells and self-renewal.</a> Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).</li><li>Morgan, M. A., Lawrence, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways:+overcoming+radiation+resistance+by+targeting+DNA+damage+response+pathways.">Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways.</a> Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+exploration+of+cancer+stem+cell+marker+voltage-dependent+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit-mediated+chemotherapy+resistance+in+small-cell+lung+cancer.">Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel &#945;2&#948;1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer.</a> Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).</li></ol>

Denne protokol beskriver metoder til at studere radio følsomheden af CSCs i Cancer cellelinjer in vitro. I dette studie er ekspression af α2δ1 kontinuerlig i NSCLC-cellelinjer. Derfor er gating baseret på en isotype kontrol. Før sortering skal α2δ1-ekspression undersøges i flere cellelinjer ved flow cytometri og valideres af QPCR eller Western blot. Det anbefales at re-analysere α2δ1 ekspression af de sorterede α2δ1-høje og α2δ1-Low-celler ved flow cytometri, ved at observere fluorescens under et fluoresce...

Strålebehandling spiller en vigtig rolle i kræftbehandlingen. Eksistensen af radioaktive Cancer stamceller (CSCS) kan dog føre til tilbagefald eller dårlige resultater efter strålebehandling1,2. CSCs er karakteriseret ved deres selv fornyelsesevne og evne til at generere heterogene cancerceller3. Pansret med en mere effektiv DNA-skade reparations kapacitet eller højere niveauer af frie radikaler skylle systemer eller andre mekanismer, er CSCS relativt modstandsdygtige over for strålebehandling4,5,6,7 , 8. identificering af CSC-markører og udforskning af deres mekanismer vil lette udviklingen af lægemidler, der vil overvinde radioresistance uden at øge den normale vævsskade.
Spændings gated calcium kanal α2δ1 underenhed isoform 5 er blevet rapporteret som en markør for radioaktive CSCS i NSCLC cellelinjer9. α2δ1 blev oprindeligt identificeret som en CSC-markør for hepatocellulært karcinom (HCC)10. Ved hjælp af subtraktiv immunisering med et par HCC-cellelinjer afledt af de primære og tilbagevendende tumorer i den samme patient, blev et antistof ved navnet 1B50-1 identificeret til at målrette tilbagevendende HCC-celler specifikt. 1B50-1-positive celler viste høj sfære dannelse effektivitet in vitro og høj tumorigenicitet in vivo. Dets antigen blev identificeret ved massespektrometri, som calcium kanal α2δ1 underenhed isoform 5. α2δ1 udtrykker specifikt i CSCs og er ikke målbart i de fleste normale væv, hvilket gør det til en potentiel kandidat til målretning af CSCs10. α2δ1 kan også fungere som en CSC-markør for NSCLC-cellelinjer, og det har vist sig at give radioresistance til NSCLC-celler delvist ved at øge effektiviteten af reparation af DNA-skader som reaktion på stråling9.
At studere radioaktive CSCs kan give ledetråde til at overvinde radioresistance. Brug af α2δ1 i NSCLC som et eksempel, er vigtige metoder til at studere radio følsomheden af CSCs præsenteret. Normalt er CSCs isoleret med en formodet overflade markør, og stamcelle egenskaberne og radio følsomheden af de positive og negative cellepopulationer sammenlignes. Kugle dannelse i et serumfrit medium suppleret med vækstfaktorer, der understøtter selvfornyelse er en nyttig analyse til at evaluere stemhed af celler in vitro. Celler med høj sfære dannelse kapacitet vil sandsynligvis vise høj tumorgenicitet når injiceres i immundefekt mus10,11,12. Koloni dannelse assay bruges derefter til at vurdere radiofølsomhed af celler, som afgør, hvor mange har mistet evnen til at generere efterkommere danner kolonien efter en dosis af stråling13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B50-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel &#945;2&#948;1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% formaldehyde solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12500062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer/cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSARIA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1975</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_1511</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightning-Link Fluorescein Kit</td>
			<td>Innova Biosciences</td>
			<td>310-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linear accelerator</td>
			<td>VARIAN</td>
			<td>CLINAC 600C/D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBRGREEN</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>QPK-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Violet crystal staining solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines

Tilstedeværelsen af kræft stamceller (CSCs) har været forbundet med tilbagefald eller dårlige resultater efter strålebehandling. At studere radioaktive CSCs kan give ledetråde til at overvinde radioresistance. Spændings gated calcium kanal α2δ1 underenhed isoform 5 er blevet rapporteret som en markør for radioaktive CSCS i cellelinjer, der ikke er af småcellet lungecancer (NSCLC). Ved hjælp af calcium kanal α2δ1 underenhed som et eksempel på en CSC markør, metoder til at studere radiofølsomhed af CSCs i NSCLC cellelinjer præsenteres. CSCs er sorteret med formodede markører ved flow cytometri, og den selv fornyelseskapacitet af sorterede celler evalueres ved Sphere formation assay. Koloni dannelse assay, som bestemmer, hvor mange celler mister evnen til at generere efterkommere danner kolonien efter en vis dosis af stråling, er derefter udføres for at vurdere radiofølsomhed af sorteret celler. Dette manuskript giver de første skridt til at studere radio følsomheden af CSCs, som danner grundlag for yderligere forståelse af de underliggende mekanismer.

α2δ1-høj-og α2δ1-Low A549-celler blev sorteret (figur 1a). Nogle markører kan vise forskellige populationer og er nemme at Gate. Men nogle markører viser kun høje og lave udtryks mønstre i stedet for tydelige positive og negative populationer. I denne situation er en isotype kontrol meget vigtig for gating. Udtrykket α2δ1 i de sorteres celler valideres af qPCR. Ekspression af CACNA2D1, genet, der koder α2δ1, er højere i sorteret α2δ1-høje celler sammenlignet med α2...

Watch this Scientific Journal Video about Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines at JoVE.com

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Tilstedeværelsen af kræft stamceller har været forbundet med tilbagefald eller dårlige resultater efter strålebehandling. Dette manuskript beskriver metoderne til undersøgelse af Cancer stamcellernes radio følsomhed i cellelinjer i lungecancer.

Røntgen følsomhed af kræft stamceller i lungekræft cellelinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Denne protokol er signifikant, fordi tilstedeværelsen af kræft stamceller kan være forbundet med tilbagefald eller et dårligt resultat efter strålebehandling. Undersøgelse af de radiosistente stamceller kan give spor til at overvinde radioresistens. I denne teknik saltes kræftstamceller med formodede markører ved flowcytometri, og de saltede cellers selvfornyelseskapacitet evalueres ved kugledannelsesanalyse.Kolonidannelsesanalysen udføres for at vurdere de saltede cellers radiofølsomhed. Det bestemmer, hvor mange celler mistede deres evne til at generere syntesen, der danner kolonien efter en bestemt dosis af stråling. Dette manuskript giver de første få skridt til radiofølsomhedsundersøgelse af kræftstamceller, som danner grundlag for en mere omfattende mekanismeundersøgelse.Mekanisme undersøgelse kan omfatte proteiner relateret til DNA-skader reparation, clearance af reaktive ilt arter, celle cyklus anholdelse, osv. Det vil give vigtig indsigt i, hvordan kræft stamceller får radioresistens, og hvordan man kan overvinde modstanden. Demonstrationen af strålingsproceduren vil være Chen-Nan Li, en strålingstekniker fra vores afdeling.For at begynde denne procedure, kultur A549 celler i RPMI-1640 medium suppleret med 10% FBS i 10 centimeter retter ved 37 grader Celsius, med 5% kuldioxid. Når cellerne når op på 80 til 90 %, skal du fjerne kulturmediet. Cellerne vaskes kort med tre milliliter PBS.Dernæst tilsættes tre milliliter 0,05% trypsin til hver skål. Fjern trypsin og lad residuary trypsin at fordøje cellerne ved 37 grader Celsius i et til tre minutter. Kontroller afrensning af cellerne ofte for at undgå over-fordøjelse.Når cellerne løsner sig og begynder at løsne sig fra skålene, tilsættes tre milliliter RPMI-1640 medium suppleret med 10% FBS og overføre cellerne suspension til en 50 milliliter rør. Centrifuge ved 300 gange g og ved fire grader Celsius i fem minutter. Kassér supernatanten og opsplitning af cellerne i 10 milliliter PBS.Overfør 0,5 milliliter af cellesuspensionen til et nyt rør som isotypekontrol. Centrifuge både kontrol og eksperimentelle rør ved 300 gange g og fire grader Celsius i fem minutter. Kassér supernatanterne.Derefter fortyndes både den fluorescerende dikonjugerede isotypekontrol og antistoffet i PBS til den optimale koncentration, der er titreret for at forberede arbejdsopløsningen. Resuspend kontrol og eksperimentelle celler med hver arbejdsopløsning og bland forsigtigt. Inkuber prøverne i mørke og ved stuetemperatur i 30 til 40 minutter.Cellerne vaskes ved at tilsætte 10 milliliter PBS, blande forsigtigt og centrifugere ved 300 gange g og ved fire grader Celsius i fem minutter. Kassér supernatanterne og opsplit cellerne med 10 milliliter PBS. Dernæst placere 40 mikrometer cellestatorer på nye 50 milliliter rør, og sørg for at forberede et separat rør og si setup til kontrol og eksperimentelle celler.Påfør hver celle suspension på den respektive si og indsamle flowthrough. Centrifuge flowthrough ved 300 gange g og ved fire grader Celsius i fem minutter. Supernatanten kasseres, og cellerne skal opspørges med 0,2 til 1,0 milliliter PBS, og hver cellesuspension overføres til et separat fem milliliterrør til flowcytometri.I et biologisk sikkerhedsskab skal du forberede en seks brøndplade til hver strålingsdosis, herunder den nulgrå gruppe. Tilføj 1,5 milliliter fuldførte 1640 medier til hver brønd. Fortyndet høstede celler med færdige 1640 medier til en celletæthed på 1.000 celler pr. milliliter.Derefter tilsættes den fortyndede celle suspension til brøndene og ryst pladerne vandret for jævnt at fordele cellerne i brøndene. Optag den mængde, der er tilføjet i hver dosisgruppe. Kultur ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Når cellerne er fastgjort til bunden af brøndene, tilføje afsluttet 1640 medier til hver brønd, indtil mediehøjden når en centimeter. Når pladerne overføres mellem cellekulturrum og strålebehandlingsrum, skal pladerne pakkes med aluminiumsfolie eller sættes i en ren kasse for at undgå forurening. Hold pladerne fladt for at undgå, at mediet løber ud.Dernæst sat til 20 centimeter med 20 centimeter stråling felt. Placer et væv tilsvarende bolus på 1,0 centimeter tykkelse på behandlingen sofaen og placere de seks godt plade på bolus at holde dem i kontakt. Sørg for, at hele pladen er inden for strålingsfeltet.Indstil kilde-hud afstand som 100 centimeter og justere højden af behandlingen sofaen til at tilpasse den medium overflade niveau til laserniveau. Den tildelte dosis leveres til hver plade i rækkefølge. Derefter skal du tage pladerne til biosikkerhedsskabet i cellekulturrummet.Udskift mediet i hver brønd med to milliliter afsluttet 1640 medium. Kultur ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid, og sørg for at ændre mediet hver tre til fem dage. Syv til 10 dage efter stråling, fjerne mediet og kort vaske cellerne med PBS.I en røghætte, tilsæt en milliliter 4% formaldehyd til hver brønd for at fastsætte cellerne i 10 minutter. Derefter fjernes formaldehyd og vaskes hver brønd to gange ved hjælp af to milliliter destilleret vand til hver vask. Tilsæt en milliliter 1% Krystal violet plet opløsning til hver brønd og plet i 10 minutter.Derefter fjernes krystal violet pletopløsningen og cellerne tre gange med destilleret vand. Fjern vandet og lad pladerne lufttørre i 30 minutter. Tæl antallet af kolonier med mere end 50 celler.I denne undersøgelse sorteres både alfa to delta et højt og alfa to delta et lavt A549-celler. Nogle markører kan vise forskellige populationer og er nemme at gate. Men nogle markører viser bare høje og lave udtryksmønstre i stedet for markante positive og negative populationer.I denne situation er en isotypekontrol meget vigtig for gating. Udtrykket af alfa to delta et i sorterede celler valideres af qPCR. Ekspressionen af CACNA2D1, det gen, der koder alpha to delta et, er højere i sorteret alpha to delta en høj celler sammenlignet med alfa to delta en lave celler.Typisk morfologi af kugler og kugledannelse effektivitet er vist her. Alpha to delta en høj celle viser højere kugledannelse effektivitet, hvilket tyder på en højere selvfornyelse kapacitet. Typiske billeder af kolonier og overlevelseskurver vises her.En koloni med omkring 50 celler kan undersøges under et mikroskop og markeres som reference. Antallet af kolonier tælles, så en overlevelse fraktion ved hver dosis kan beregnes og en overlevelse kurve kan plottes. Alpha to delta en høj celler er relativt resistente over for stråling i forhold til alfa to delta en lave celler.Alle trin i forbindelse med cellekultur bør udføres i det biologiske sikkerhedsskab eller laminar ren bænk. For at undgå forurening anbefales det at tilføje antibiotika til kulturmediet efter sortering. Når en formodede kræft stamcellemarkør er preliminarily identificeret ved kugledannelse assay, yderligere karakterisering ved in vivo begrænsende fortynding assay kan udføres for at vurdere tumorigenic kapacitet.Fra mekanismen undersøgelse af radioresistens, forskere kan undersøge protein relateret til DNA-skader reparation, clearance af reaktive ilt arter, og celle cyklus anholdelse som reaktion på stråling. Under cellestråling skal du være opmærksom på, at den lineære accelerator kun kan betjenes af kvalificerede teknikere. Hold dig væk fra stråling.Mens du står, skal du være opmærksom på, at formaldehyd er flygtigt og farligt. Brug formaldehyd i røghætten.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokol til Rapid Post-mortem Cell Culture af Diffus Intrinsic Pontine gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Etablering af en lunge kolonisering Assay for Cirkulerende Tumor Cell visualisering i lungevæv

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastisk farvning på paraffin-indlejrede slides af pT3N0M0 gastrisk Cancer væv

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymale stamceller isoleret fra Pulp væv og fælles kultur med kræftceller til at studere deres interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Etablering og karakterisering af tre Afatinib-resistente lunge adenokarcinom PC-9 cellelinjer udviklet med stigende doser Afatinib

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow Cytometrisk analyse af mitokondrie reaktive oxygen arter i murine hæmatopoietiske stamceller og Progenitorcellerne og MLL-AF9 drevet leukæmi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Karakterisere sygdomsrelaterede mutanter af RAF-familie kinaser ved hjælp af et sæt praktiske og gennemførlige metoder

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering af gastrisk Cancer patient afledte xenograft-modeller og primære cellelinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering og optælling af cirkulerende tumor celler fra ikke-småcellet lunge cancer patienter ved immunofluorescens

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Anvendelse af menneskeskabte pluripotente stamceller til generering af tumor antigen-specifikke T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...