Name: radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines
Uploaded: 2019-08-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81402535 en 81672969) en het National Key Research and Development project (2016YFC0904703).

Opmerking: stappen worden uitgevoerd onder de aangegeven temperatuur. Voor stappen waarbij de temperatuur niet wordt vermeld, presteren onder kamertemperatuur (18 – 25 °C). Celkweekmedium moet worden bewaard bij 4 °C en andere reagentia moeten worden opgeslagen volgens de handleidingen van de fabrikant. Medium moet vooraf worden opgewarmd tot 37 °C voordat het aan cellen wordt toegevoegd.
1. sorteren van cellen
<ol><li>Conjugatie van antilichamen Opmerking: gezien de kortere incubati...

<ol>
	<li>Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+as+a+predictive+factor+in+radiotherapy.">Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy.</a> Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).</li><li>Baumann, M., Krause, M., Hill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+role+of+cancer+stem+cells+in+radioresistance.">Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance.</a> Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).</li><li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells--perspectives+on+current+status+and+future+directions:+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells.">Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Wang, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+regulation+of+CHK1+and+CHK2+promotes+radioresistance+in+a+stem+cell-like+population+of+nasopharyngeal+carcinoma+cells.">MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells.</a> Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).</li><li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+reactive+oxygen+species+levels+and+radioresistance+in+cancer+stem+cells.">Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).</li><li>Gomez-Casal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-small+cell+lung+cancer+cells+survived+ionizing+radiation+treatment+display+cancer+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+phenotypes.">Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes.</a> Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).</li><li>Mihatsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+radioresistant+tumor+cells+and+presence+of+ALDH1+activity+in+vitro.">Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro.</a> Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).</li><li>Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit+(CACNA2D1)+enhances+radioresistance+in+cancer+stem-like+cells+in+non-small+cell+lung+cancer+cell+lines.">Calcium channel &#945;2&#948;1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines.</a> Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1B50-1,+a+mAb+raised+against+recurrent+tumor+cells,+targets+liver+tumor-initiating+cells+by+binding+to+the+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit.">1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel &#945;2&#948;1 subunit.</a> Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).</li><li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance:+Cancer+stem+cell.">Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell.</a> Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).</li><li>Zhang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+decarboxylase+activity+drives+non-small+cell+lung+cancer+tumor-initiating+cells+and+tumorigenesis.">Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis.</a> Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+self-renewal.">Cancer stem cells and self-renewal.</a> Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).</li><li>Morgan, M. A., Lawrence, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways:+overcoming+radiation+resistance+by+targeting+DNA+damage+response+pathways.">Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways.</a> Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+exploration+of+cancer+stem+cell+marker+voltage-dependent+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit-mediated+chemotherapy+resistance+in+small-cell+lung+cancer.">Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel &#945;2&#948;1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer.</a> Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).</li></ol>

Dit protocol beschrijft methoden voor het bestuderen van de radio gevoeligheid van CSCs in kanker cellijnen in vitro. In deze studie is de expressie van α2δ1 continu in NSCLC-cellijnen. Daarom is gating gebaseerd op een Isotype-regeling. Alvorens te sorteren, moet de α2δ1-uitdrukking in meerdere cellijnen worden onderzocht door Flowcytometrie en gevalideerd door QPCR of Western Blot. Het wordt aanbevolen om α2δ1-expressie van de gesorteerde α2δ1-hoog en α2δ1-lage cellen opnieuw te analyseren door middel van Flo...

Radiotherapie speelt een belangrijke rol bij de behandeling van kanker. Het bestaan van radioresistant kanker stamcellen (CSCS) kan echter leiden tot recidief of slechte resultaten na radiotherapie1,2. CSCs worden gekenmerkt door hun zelfvernieuwings capaciteit en het vermogen om heterogene kankercellen te genereren3. Gepantserd met een efficiëntere DNA-schade herstelcapaciteit of hogere niveaus van vrije radicalen opruiming systemen of andere mechanismen, CSCS zijn relatief resistent tegen radiotherapie4,5,6,7 , 8. het identificeren van CSC-markers en het verkennen van hun mechanismen zal de ontwikkeling van geneesmiddelen die radioresistance zullen overwinnen, vergemakkelijken zonder de normale weefselschade te verhogen.
Voltage-gated calcium kanaal α2δ1 subeenheid isovorm 5 is gerapporteerd als een marker voor radioresistant CSCS in nsclc cellijnen9. α2δ1 werd oorspronkelijk geïdentificeerd als een CSC-marker voor hepatocellulair carcinoom (HCC)10. Met behulp van subtractieve immunisatie met een paar HCC cellijnen afgeleid van de primaire en terugkerende tumoren in dezelfde patiënt, werd een antilichaam genaamd 1B50-1 geïdentificeerd om terugkerende HCC-cellen specifiek te targeten. 1B50-1-positieve cellen toonden een hoge mate van efficiëntie in vitro en hoge tumorigeniteit in vivo. Het antigeen werd geïdentificeerd door massaspectrometrie, als calcium kanaal α2δ1 subeenheid isovorm 5. α2δ1 drukt specifiek in CSCs uit en is niet detecteerbaar in de meeste normale weefsels, waardoor het een potentiële kandidaat is voor het targeten van CSCs10. α2δ1 kan ook dienen als een CSC-marker voor NSCLC-cellijnen, en het is aangetoond dat radioresistance wordt gegeven aan NSCLC-cellen, deels door het verbeteren van de efficiëntie van DNA-schade herstel in reactie op straling9.
Het bestuderen van radiooresistant CSCs kan aanwijzingen geven voor het overwinnen van radioresistance. Met behulp van α2δ1 in NSCLC als voorbeeld worden belangrijke methoden voor het bestuderen van de radio gevoeligheid van CSCs gepresenteerd. Gewoonlijk worden CSCs geïsoleerd met een putende oppervlak marker en worden de eigenschappen van de stamcel en de radio gevoeligheid van de positieve en negatieve celpopulaties vergeleken. Sphere Formation in een serumvrij medium aangevuld met groeifactoren die de zelf vernieuwing ondersteunen, is een nuttige assay om de hoeveelheid cellen in vitro te evalueren. Cellen met hoge bol vorming capaciteit vertonen waarschijnlijk hoge tumorigeniteit wanneer geïnjecteerd in immunodeficiënte muizen10,11,12. Kolonie vorming assay wordt vervolgens gebruikt om te beoordelen van de radio sensitiviteit van cellen, die bepaalt hoeveel hebben verloren het vermogen om te genereren van afstammelingen vormen de kolonie na een dosis straling13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B50-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel &#945;2&#948;1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% formaldehyde solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12500062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer/cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSARIA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1975</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_1511</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightning-Link Fluorescein Kit</td>
			<td>Innova Biosciences</td>
			<td>310-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linear accelerator</td>
			<td>VARIAN</td>
			<td>CLINAC 600C/D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBRGREEN</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>QPK-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Violet crystal staining solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines

De aanwezigheid van kanker stamcellen (CSCs) is in verband gebracht met recidief of slechte uitkomsten na radiotherapie. Het bestuderen van radiooresistant CSCs kan aanwijzingen geven voor het overwinnen van radioresistance. Voltage-gated calcium kanaal α2δ1 subeenheid isovorm 5 is gerapporteerd als een marker voor radioresistant CSCS in niet-kleincellige longkanker (nsclc) cellijnen. Met behulp van de subeenheid van calcium kanaal α2δ1 als voorbeeld van een CSC-marker worden methoden voor het bestuderen van de radio gevoeligheid van CSCs in NSCLC-cellijnen weergegeven. CSCs worden gesorteerd met putatieve markers door Flowcytometrie, en het zelfvernieuwings vermogen van gesorteerde cellen wordt geëvalueerd door Sphere Formation assay. Colony Formation Assay, die bepaalt hoeveel cellen het vermogen verliezen om afstammelingen te genereren die de kolonie vormen na een bepaalde dosis straling, wordt vervolgens uitgevoerd om de radio gevoeligheid van gesorteerde cellen te beoordelen. Dit manuscript biedt eerste stappen voor het bestuderen van de radio gevoeligheid van CSCs, die de basis legt voor een beter begrip van de onderliggende mechanismen.

α2δ1-hoog en α2δ1-lage A549 cellen werden gesorteerd (Figuur 1a). Sommige markers kunnen verschillende populaties vertonen en zijn gemakkelijk te hek. Sommige markeringen tonen echter alleen hoge en lage expressie patronen, in plaats van duidelijke positieve en negatieve populaties. In deze situatie is een Isotype-controle zeer belangrijk voor het gating. De expressie van α2δ1 in gesorteerde cellen wordt gevalideerd door qPCR. De uitdrukking van CACNA2D1, het gen dat α2δ1 co...

Watch this Scientific Journal Video about Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines at JoVE.com

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

De aanwezigheid van kanker stamcellen is in verband gebracht met recidief of slechte uitkomsten na radiotherapie. Dit manuscript beschrijft de methoden om de radio gevoeligheid van kanker stamcellen in longkanker cellijnen te bestuderen.

Radio sensitiviteit van kanker stamcellen in longkanker cellijnen

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Dit protocol is belangrijk omdat de aanwezigheid van kankercellen kan worden geassocieerd met terugval of een slechte uitkomst na radiotherapie. Het bestuderen van de radioresistente stamcellen kan aanwijzingen geven om radioresistentie te overwinnen. In deze techniek worden kankerstamcellen gezouten met putatieve markers door flow cytometrie en wordt de zelfvernieuwingscapaciteit van gezouten cellen geëvalueerd door bolvormingstest.De kolonievormingstest wordt uitgevoerd om de radiogevoeligheid van gezouten cellen te beoordelen. Het bepaalt hoeveel cellen hun vermogen verloren om de synthese te genereren die de kolonie vormt na een bepaalde dosis straling. Dit manuscript biedt de eerste paar stappen voor de radiosensitiviteitsstudie van kankerstamcellen, die de basis voor volledigere mechanismestudie bepaalt.Mechanisme studie kan betrekking hebben op eiwitten in verband met DNA-schade reparatie, klaring van reactieve zuurstof soorten, cel cyclus arrestatie, enz. Het zal belangrijke inzichten geven in hoe kankerstamcellen radioresistentie krijgen en hoe de weerstand te overwinnen. Het aantonen van de stralingsprocedure zal Chen-Nan Li zijn, een stralingstechnicus van onze afdeling.Om te beginnen met deze procedure, cultuur A549 cellen in RPMI-1640 medium aangevuld met 10%FBS in 10 centimeter schotels op 37 graden Celsius, met 5%kooldioxide. Wanneer de cellen 80 tot 90% samenvloeiing bereiken, verwijdert u het kweekmedium. Was de cellen kort met drie milliliter PBS.Voeg vervolgens drie milliliter van 0,05% trypsine toe aan elk gerecht. Verwijder de trypsine en laat de residuaire trypsine om de cellen te verteren op 37 graden Celsius gedurende een tot drie minuten. Controleer het onthechting van de cellen vaak om oververtering te voorkomen.Wanneer de cellen los raken en beginnen los te komen van de gerechten, voeg drie milliliter RPMI-1640 medium aangevuld met 10%FBS en breng de cellen suspensie naar een 50 milliliter buis. Centrifuge op 300 keer g en bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en plaats de cellen opnieuw in 10 milliliter PBS.Breng 0,5 milliliter van de celsuspensie over in een nieuwe buis als isotypecontrole. Centrifugeer zowel de controle als de experimentele buizen op 300 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatants weg.Verdun vervolgens zowel de fluorescerende diconjugated isotypecontrole als het antilichaam in PBS tot de optimale concentratie die is getitreerd om de werkoplossing voor te bereiden. Resuspend de controle en experimentele cellen met elke werkende oplossing en meng zachtjes. Broed de monsters in het donker en bij kamertemperatuur gedurende 30 tot 40 minuten.Was de cellen door het toevoegen van 10 milliliter PBS, mengen zachtjes, en centrifugeren op 300 keer g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatanten weg en plaats de cellen opnieuw met 10 milliliter PBS. Plaats vervolgens 40 micrometer cel strainers op nieuwe 50 milliliter buizen, zorg ervoor dat een aparte buis en zeef setup voor de controle en experimentele cellen voor te bereiden.Breng elke celsuspensie aan op de betreffende zeef en verzamel de flowthrough. Centrifuge de flowthrough op 300 keer g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en zet de cellen opnieuw op met 0,2 tot 1,0 milliliter PBS en breng elke celsuspensie over in een aparte vijf milliliter buis voor stroomcytometrie.Bereid in een biologische veiligheidskast één zes putplaat voor elke stralingsdosis, inclusief de nulgrijze groep. Voeg 1,5 milliliter van voltooide 1640 media aan elke put. Verdun geoogste cellen met voltooide 1640 media tot een celdichtheid van 1.000 cellen per milliliter.Voeg vervolgens de verdunde celsuspensie toe aan de putten en schud de platen horizontaal om de cellen gelijkmatig in de putten te verdelen. Nota van het volume dat in elke dosisgroep is toegevoegd. Cultuur op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide.Nadat de cellen aan de bodem van de putten zijn bevestigd, voeg voltooide 1640 media aan elke put toe tot de mediahoogte één centimeter bereikt. Wanneer de platen worden overgebracht tussen cel cultuur kamer en bestraling kamer, wikkel de platen met aluminiumfolie of zet ze in een schone doos om besmetting te voorkomen. Houd de platen plat om te voorkomen dat er een medium uitslaat.Vervolgens, ingesteld op 20 centimeter bij 20 centimeter straling veld. Plaats een weefsel equivalent bolus van 1,0 centimeter dikte op de behandeling bank en plaats de zes put plaat op de bolus om ze in contact te houden. Zorg ervoor dat de hele plaat zich in het stralingsveld bevindt.Stel de afstand tussen de bron en huid in op 100 centimeter en pas de hoogte van de behandelingsbank aan om het gemiddelde oppervlakniveau op het laserniveau uit te lijnen. Lever de toegewezen dosis op elke plaat in volgorde. Breng hierna de platen naar de bioveiligheidskast in de celkweekkamer.Vervang het medium in elke put door twee milliliter voltooid 1640 medium. Cultuur op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide, ervoor te zorgen dat het medium te veranderen om de drie tot vijf dagen. Zeven tot 10 dagen na de straling, verwijder het medium en was de cellen kort met PBS.In een rookkap, voeg een milliliter van 4% formaldehyde aan elke put om de cellen vast te stellen voor 10 minuten. Verwijder vervolgens het formaldehyde en was elke put twee keer met twee milliliter gedestilleerd water voor elke wasbeurt. Voeg een milliliter van 1%Crystal violet vlek oplossing aan elke put en vlek gedurende 10 minuten.Verwijder hierna de kristalzwal violette vlekoplossing en was de cellen drie keer met gedestilleerd water. Verwijder het water en laat de platen 30 minuten drogen. Tel het aantal kolonies met meer dan 50 cellen.In deze studie worden zowel alfa twee delta één hoog als alfa twee delta een lage A549 cellen gesorteerd. Sommige markeringen kunnen verschillende populaties vertonen en zijn gemakkelijk te openen. Echter, sommige markers tonen alleen hoge en lage expressie patronen, in plaats van onderscheidende positieve en negatieve populaties.In deze situatie is een isotypecontrole erg belangrijk voor gating. De expressie van alfa twee delta één in gesorteerde cellen wordt gevalideerd door qPCR. De expressie van CACNA2D1, het gen dat alfa twee delta één codeert, is hoger in gesorteerde alfa twee delta één hoge cellen in vergelijking met alfa twee delta een lage cellen.Typische morfologie van bollen en de sfeervorming efficiëntie wordt hier getoond. Alpha twee delta een hoge cellen tonen een hogere sfeervorming efficiëntie, wat wijst op een hogere zelfvernieuwing capaciteit. Typische beelden van kolonies en overlevingscurven worden hier getoond.Een kolonie met ongeveer 50 cellen kan onder een microscoop worden onderzocht en als referentie worden gemarkeerd. Het aantal kolonies wordt geteld, dan kan een overlevingsfractie bij elke dosis worden berekend en een overlevingscurve kan worden uitgezet. Alpha twee delta een hoge cellen zijn relatief resistent tegen straling in vergelijking met alfa twee delta een lage cellen.Alle stappen met betrekking tot celcultuur moeten worden uitgevoerd in de biologische veiligheidskast of laminaire schone bank. Om besmetting te voorkomen, wordt aanbevolen om antibiotica toe te voegen aan het kweekmedium na het sorteren. Wanneer een vermeende kanker stamcel marker is preliminarily geïdentificeerd door de bol vorming test, verdere karakterisering door in vivo beperken verdunning test kan worden uitgevoerd om de tumorigenic capaciteit te evalueren.Uit de mechanismestudie van radioresistentie kunnen onderzoekers het eiwit onderzoeken dat verband houdt met dna-schadeherstel, klaring van reactieve zuurstofsoorten en celcyclusarrestatie in reactie op straling. Houd er tijdens de celstraling rekening mee dat de lineaire versneller alleen door gekwalificeerde technici kan worden bediend. Blijf uit de buurt van straling.Houd er tijdens het staan rekening mee dat formaldehyde vluchtig en gevaarlijk is. Gebruik formaldehyde in de rookkap.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

De oprichting van een Long kolonisatie Assay voor het circulerende Tumor visualisatie van de cel in de weefsels van de longen

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastische kleuring op paraffine-ingesloten Dia's van pT3N0M0 maagkanker weefsel

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymale stamcellen isolatie uit Pulp weefsel en co cultuur met kankercellen te bestuderen van hun interacties

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Oprichting en karakterisering van drie Afatinib-resistente Long adenocarcinoom PC-9 cellijnen ontwikkeld met toenemende doses van Afatinib

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Karakteriseren ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen met behulp van een set van praktische en haalbare methoden

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Oprichting van maagkanker patiënten afgeleide xenograft modellen en primaire cellijnen

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatische PD-L1 karakterisering en opsomming van circulerende tumor cellen van niet-kleincellige longkanker patiënten door immunofluorescentie

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...