Name: radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines
Uploaded: 2019-08-21T14:30:00
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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81402535 und 81672969) und dem National Key Research and Development Project (2016YFC0904703) unterstützt.

HINWEIS: Die Schritte werden unter der angegebenen Temperatur durchgeführt. Für Schritte, in denen die Temperatur nicht erwähnt wird, führen Sie unter Raumtemperatur (18–25 °C) aus. Das Zellkulturmedium sollte bei 4 °C gelagert werden, und andere Reagenzien sollten gemäß den Anleitungen des Herstellers gelagert werden. Medium sollte auf 37 °C vorgewärmt werden, bevor es den Zellen zugesetzt wird.
1. Zellsortierung
<ol><li>Antikörperkonjugation HINWEIS: Unter Berücksichtigung...

<ol>
	<li>Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+as+a+predictive+factor+in+radiotherapy.">Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy.</a> Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).</li><li>Baumann, M., Krause, M., Hill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+role+of+cancer+stem+cells+in+radioresistance.">Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance.</a> Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).</li><li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells--perspectives+on+current+status+and+future+directions:+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells.">Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Wang, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+regulation+of+CHK1+and+CHK2+promotes+radioresistance+in+a+stem+cell-like+population+of+nasopharyngeal+carcinoma+cells.">MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells.</a> Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).</li><li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+reactive+oxygen+species+levels+and+radioresistance+in+cancer+stem+cells.">Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).</li><li>Gomez-Casal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-small+cell+lung+cancer+cells+survived+ionizing+radiation+treatment+display+cancer+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+phenotypes.">Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes.</a> Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).</li><li>Mihatsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+radioresistant+tumor+cells+and+presence+of+ALDH1+activity+in+vitro.">Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro.</a> Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).</li><li>Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit+(CACNA2D1)+enhances+radioresistance+in+cancer+stem-like+cells+in+non-small+cell+lung+cancer+cell+lines.">Calcium channel &#945;2&#948;1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines.</a> Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1B50-1,+a+mAb+raised+against+recurrent+tumor+cells,+targets+liver+tumor-initiating+cells+by+binding+to+the+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit.">1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel &#945;2&#948;1 subunit.</a> Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).</li><li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance:+Cancer+stem+cell.">Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell.</a> Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).</li><li>Zhang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+decarboxylase+activity+drives+non-small+cell+lung+cancer+tumor-initiating+cells+and+tumorigenesis.">Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis.</a> Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+self-renewal.">Cancer stem cells and self-renewal.</a> Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).</li><li>Morgan, M. A., Lawrence, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways:+overcoming+radiation+resistance+by+targeting+DNA+damage+response+pathways.">Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways.</a> Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+exploration+of+cancer+stem+cell+marker+voltage-dependent+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit-mediated+chemotherapy+resistance+in+small-cell+lung+cancer.">Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel &#945;2&#948;1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer.</a> Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Radiosensitivität von CSCs in Krebszelllinien in vitro. In dieser Studie ist die Expression von 2 x 1 in NSCLC-Zelllinien kontinuierlich. Daher basiert Gating auf einer Isotypkontrolle. Vor der Sortierung sollte der Ausdruck 2 x 1 in mehreren Zelllinien durch Durchflusszytometrie untersucht und durch QPCR oder Western Blot validiert werden. Es wird empfohlen, die Expression der sortierten, 2,1-hohen und 2-1-niedrigen Zellen durch Durchflusszytometrie, durch Beoba...

Die Strahlentherapie spielt eine wichtige Rolle bei der Krebsbehandlung. Die Existenz von radioresistenten Krebsstammzellen (CSCs) kann jedoch nach der Strahlentherapie1,2zu rückfall- oder schlechten Ergebnissen führen. CSCs zeichnen sich durch ihre Selbsterneuerungsfähigkeit und ihre Fähigkeit aus, heterogene Krebszellen zu erzeugen3. Gepanzert mit einer effizienteren DNA-Schadensreparaturkapazität oder höheren Ebenen von Frei-Radikal-Aufräumsystemen oder anderen Mechanismen, CSCs sind relativ resistent gegen Strahlentherapie4,5,6,7 , 8. Die Identifizierung von CSC-Markern und die Erforschung ihrer Mechanismen wird die Entwicklung von Medikamenten erleichtern, die die Radioresistenz überwinden, ohne normale Gewebeschäden zu erhöhen.
Spannungsgegated Calcium-Kanal 2 - 1 Untereinheit Isoform 5 wurde als Marker für radioresistente CSCs in NSCLC-Zelllinien9berichtet. Ursprünglich wurde der CSC-Marker für das hepatozelluläre Karzinom (HCC)10als CSC-Marker identifiziert. Mit subtraktiver Immunisierung mit einem Paar HCC-Zelllinien, die von den primären und rezidivierenden Tumoren bei demselben Patienten abgeleitet wurden, wurde ein Antikörper namens 1B50-1 identifiziert, der speziell auf rezidivierende HCC-Zellen abzielen sollte. 1B50-1-positive Zellen zeigten eine hohe Kugelbildungseffizienz in vitro und eine hohe Tumorigenizität in vivo. Sein Antigen wurde durch Massenspektrometrie identifiziert, als Calciumkanal 2 -1 Untereinheit Isoform 5. Die s21 drückt sich speziell in CSCs aus und ist in den meisten normalen Geweben nicht nachweisbar, was sie zu einem potenziellen Kandidaten für die Ausrichtung auf CSCs10macht. Es hat sich gezeigt, dass nSCLC-Zellen teilweise Radioresistenz gegen NSCLC-Zellen ausstrahlt, indem die Effizienz der REPARATUR von DNA-Schäden als Reaktion auf Strahlung9verbessert wird.
Das Studium radioresistenter CSCs kann Hinweise auf die Überwindung der Funkresistenz liefern. Am Beispiel von NSCLC werden wichtige Methoden zur Untersuchung der Radiosensitivität von CSCs vorgestellt. In der Regel werden CSCs mit einem vermeintlichen Oberflächenmarker isoliert, und die Stammzelleigenschaften und die Radiosensitivität der positiven und negativen Zellpopulationen werden verglichen. Die Kugelbildung in einem serumfreien Medium, ergänzt durch Wachstumsfaktoren, die die Selbsterneuerung unterstützen, ist ein nützlicher Test, um die Stammfähigkeit von Zellen in vitro zu bewerten. Zellen mit hoher Kugelbildungskapazität zeigen wahrscheinlich eine hohe Tumorigenität, wenn sie in immundefizizizizizizizizizizide Mäuse10,11,12injiziert werden. Koloniebildung Assay wird dann verwendet, um die Radiosensitivität von Zellen zu bewerten, die bestimmt, wie viele die Fähigkeit verloren haben, Nachkommen zu erzeugen, die die Kolonie nach einer Dosis von Strahlungbilden 13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B50-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel &#945;2&#948;1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% formaldehyde solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12500062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer/cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSARIA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1975</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_1511</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightning-Link Fluorescein Kit</td>
			<td>Innova Biosciences</td>
			<td>310-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linear accelerator</td>
			<td>VARIAN</td>
			<td>CLINAC 600C/D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBRGREEN</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>QPK-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Violet crystal staining solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines

Das Vorhandensein von Krebsstammzellen (CSCs) wurde mit Rückfällen oder schlechten Ergebnissen nach der Strahlentherapie in Verbindung gebracht. Das Studium radioresistenter CSCs kann Hinweise auf die Überwindung der Funkresistenz liefern. Spannungsgegated Calcium Channel 2 -1 Untereinheit Isoform 5 wurde als Marker für radioresistente CSCs in nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Zelllinien (NSCLC) gemeldet. Anhand der Kalziumkanal-Untereinheit 2 1 als Beispiel für einen CSC-Marker werden Methoden zur Untersuchung der Radiosensitivität von CSCs in NSCLC-Zelllinien vorgestellt. CSCs werden mit vermeintlichen Markern nach Durchflusszytometrie sortiert, und die Selbsterneuerungskapazität sortierter Zellen wird durch Kugelbildungstest ausgewertet. Der Koloniebildungstest, der bestimmt, wie viele Zellen die Fähigkeit verlieren, Nachkommen zu erzeugen, die die Kolonie nach einer bestimmten Dosis Strahlung bilden, wird dann durchgeführt, um die Radioempfindlichkeit sortierter Zellen zu bewerten. Dieses Manuskript enthält erste Schritte zur Untersuchung der Radiosensitivität von CSCs, die die Grundlage für ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen schafft.

Die Zellen wurden sortiert (Abbildung 1A). Einige Marker können unterschiedliche Populationen aufweisen und sind leicht zu tororieren. Einige Marker weisen jedoch nur hohe und niedrige Ausdrucksmuster auf, anstatt deutliche positive und negative Populationen zu zeigen. In dieser Situation ist eine Isotypkontrolle sehr wichtig für die Gating. Die Expression von 2 x 1 in sortierten Zellen wird durch qPCR validiert. Die Expression von CACNA2D1, dem Gen, das die Kodierung von 2 ,1 , i...

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Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Das Vorhandensein von Krebsstammzellen wurde mit Rückfällen oder schlechten Ergebnissen nach der Strahlentherapie in Verbindung gebracht. Dieses Manuskript beschreibt die Methoden zur Untersuchung der Radiosensitivität von Krebsstammzellen in Lungenkrebszelllinien.

Strahlenempfindlichkeit von Krebsstammzellen in Lungenkrebszelllinien

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Dieses Protokoll ist wichtig, weil das Vorhandensein von Krebsstammzellen mit einem Rückfall oder einem schlechten Ergebnis nach der Strahlentherapie in Verbindung gebracht werden kann. Das Studium der radioresistenten Stammzellen kann Hinweise zur Überwindung der Radioresistenz liefern. Bei dieser Technik werden Krebsstammzellen durch Durchflusszytometrie mit vermeintlichen Markern gesalzen und die Selbsterneuerungsfähigkeit von gesalzenen Zellen durch Kugelbildungstest bewertet.Der Koloniebildungstest wird durchgeführt, um die Radiosensitivität von gesalzenen Zellen zu bewerten. Es bestimmt, wie viele Zellen ihre Fähigkeit verloren haben, die Synthese zu erzeugen, die die Kolonie nach einer bestimmten Dosis Strahlung bilden. Dieses Manuskript enthält die ersten Schritte für die Radiosensitivitätsstudie von Krebsstammzellen, die die Grundlage für eine umfassendere Mechanismusstudie schafft.Die Mechanismusstudie kann Proteine im Zusammenhang mit der Reparatur von DNA-Schäden, der Clearance von reaktiven Sauerstoffspezies, dem Zellzyklusstillstand usw. umfassen. Es wird wichtige Einblicke geben, wie Krebsstammzellen Radioresistenz erhalten und wie die Resistenz überwunden werden kann. Demonstriert wird das Strahlenverfahren von Chen-Nan Li, einem Strahlentechniker aus unserer Abteilung.Um dieses Verfahren zu beginnen, Kultur A549 Zellen in RPMI-1640 Medium ergänzt mit 10%FBS in 10 Zentimeter Geschirr bei 37 Grad Celsius, mit 5%Kohlendioxid. Wenn die Zellen 80 bis 90 % Zusammenfluss erreichen, entfernen Sie das Kulturmedium. Waschen Sie die Zellen kurz mit drei Millilitern PBS.Als nächstes fügen Sie drei Milliliter 0,05%Trypsin zu jedem Gericht hinzu. Entfernen Sie das Trypsin und lassen Sie das residuary Trypsin, um die Zellen bei 37 Grad Celsius für ein bis drei Minuten zu verdauen. Überprüfen Sie häufig die Ablösung der Zellen, um eine Überverdauung zu vermeiden.Wenn die Zellen locker werden und beginnen, sich von den Gerichten zu lösen, fügen Sie drei Milliliter RPMI-1640 Medium mit 10% FBS ergänzt und übertragen die Zellen Suspension zu einem 50 Milliliter Rohr. Zentrifuge bei 300 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 10 Milliliter PBS wieder aus.Übertragen Sie 0,5 Milliliter der Zellsuspension als Isotypkontrolle in ein neues Rohr. Zentrifugieren Sie sowohl die Steuer- als auch die Versuchsröhrchen bei 300 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie die Überräube.Verdünnen Sie dann sowohl die fluoreszierende diconjugierte Isotypkontrolle als auch den Antikörper in PBS auf die optimale Konzentration, die zur Vorbereitung der Arbeitslösung titriert wird. Setzen Sie die Kontroll- und Versuchszellen mit jeder Arbeitslösung aus und mischen Sie sie sanft. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln und bei Raumtemperatur für 30 bis 40 Minuten.Waschen Sie die Zellen, indem Sie 10 Milliliter PBS hinzufügen, sanft mischen und zentrifugieren bei 300 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie die Überräube und setzen Sie die Zellen mit 10 MilliliterPBS wieder aus. Als nächstes legen Sie 40 Mikrometer Zellsiebe auf neue 50 Milliliter-Röhren, um sicherzustellen, dass ein separates Rohr und Sieb Setup für die Steuer- und Versuchszellen vorbereitet.Tragen Sie jede Zellsuspension auf das jeweilige Sieb auf und sammeln Sie den Durchfluss. Zentrifugieren Sie den Durchfluss bei 300 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit 0,2 bis 1,0 Milliliter PBS wieder auf und übertragen Sie jede Zellsuspension in eine separate Fünf-Milliliter-Röhre für die Durchflusszytometrie.Bereiten Sie in einem biologischen Sicherheitsschrank eine sechs Brunnenplatte für jede Strahlendosis vor, einschließlich der grauen Gruppe Null. Fügen Sie 1,5 Milliliter abgeschlossener 1640 Medien zu jedem Brunnen hinzu. Verdünnung von geernteten Zellen mit abgeschlossenen 1640 Medien auf eine Zelldichte von 1.000 Zellen pro Milliliter.Dann fügen Sie die verdünnte Zellsuspension in die Brunnen und schütteln Sie die Platten horizontal, um die Zellen in den Brunnen gleichmäßig zu verteilen. Zeichnen Sie das in jeder Dosisgruppe hinzugefügte Volumen auf. Kultur bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.Nachdem die Zellen an der Unterseite der Brunnen befestigt sind, fügen Sie fertige 1640 Medien zu jedem Brunnen hinzu, bis die Medienhöhe einen Zentimeter erreicht. Wenn die Platten zwischen Zellkulturraum und Strahlentherapieraum übertragen werden, wickeln Sie die Platten mit Aluminiumfolie oder legen Sie sie in eine saubere Box, um Verunreinigungen zu vermeiden. Halten Sie die Platten flach, um ein Austreten des Mediums zu vermeiden.Als nächstes auf 20 Zentimeter mal 20 Zentimeter Strahlungsfeld eingestellt. Legen Sie einen Gewebeäquivalent bolus von 1,0 Zentimeter Dicke auf die Behandlungscouch und legen Sie die sechs Brunnenplatte auf den Bolus, um sie in Kontakt zu halten. Stellen Sie sicher, dass sich die gesamte Platte innerhalb des Strahlungsfeldes befindet.Stellen Sie den Quell-Haut-Abstand auf 100 Zentimeter ein, und passen Sie die Höhe der Behandlungscouch an, um die mittlere Oberflächenebene an der Laserebene auszurichten. Geben Sie die zugewiesene Dosis nacheinander an jede Platte weiter. Danach nehmen Sie die Platten zum Biosicherheitsschrank im Zellkulturraum.Ersetzen Sie das Medium in jedem Brunnen durch zwei Milliliter abgeschlossen1640 Medium. Kultur bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, um sicherzustellen, dass das Medium alle drei bis fünf Tage zu ändern. Sieben bis zehn Tage nach der Strahlung das Medium entfernen und die Zellen kurz mit PBS waschen.In einer Dunstabzugshaube, fügen Sie einen Milliliter 4%Formaldehyd zu jedem Brunnen, um die Zellen für 10 Minuten zu fixieren. Dann entfernen Sie das Formaldehyd und waschen Sie jeden Brunnen zweimal mit zwei Milliliter destilliertem Wasser für jede Wäsche. Fügen Sie einen Milliliter 1%Kristallviolettfleck Lösung zu jedem Brunnen und Fleck für 10 Minuten.Danach die kristallviolette Fleckenlösung entfernen und die Zellen dreimal mit destilliertem Wasser waschen. Entfernen Sie das Wasser und lassen Sie die Platten 30 Minuten lang an der Luft trocknen. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien mit mehr als 50 Zellen.In dieser Studie werden beide Alpha-zwei-Delta-Eins-Hoch- und Alpha-zwei-Delta-Eins-Niedrige A549-Zellen sortiert. Einige Marker können unterschiedliche Populationen aufweisen und sind leicht zu tororieren. Einige Marker weisen jedoch nur hohe und niedrige Ausdrucksmuster auf, anstatt ausgeprägte positive und negative Populationen zu unterscheiden.In dieser Situation ist eine Isotypkontrolle sehr wichtig für die Gating. Die Expression von alpha zwei Delta eins in sortierten Zellen wird durch qPCR validiert. Die Expression von CACNA2D1, dem Gen, das Alpha zwei Delta eins kodiert, ist höher in sortierten Alpha zwei Delta ein hohe Zellen im Vergleich zu alpha zwei Delta ein niedrige Zellen.Typische Morphologie von Kugeln und die Sphärenbildungseffizienz wird hier gezeigt. Alpha zwei Delta ein hohe Zellen zeigen eine höhere Kugelbildung Effizienz, was auf eine höhere Selbsterneuerungskapazität. Typische Bilder von Kolonien und Überlebenskurven werden hier gezeigt.Eine Kolonie mit etwa 50 Zellen kann unter dem Mikroskop untersucht und als Referenz markiert werden. Die Anzahl der Kolonien wird gezählt, dann kann eine Überlebensfraktion bei jeder Dosis berechnet und eine Überlebenskurve dargestellt werden. Alpha zwei Delta ein hohe Zellen sind relativ resistent gegen Strahlung im Vergleich zu Alpha zwei Delta ein niedrige Zellen.Alle Schritte im Zusammenhang mit der Zellkultur sollten im biologischen Sicherheitsschrank oder laminaren sauberen Bank durchgeführt werden. Um eine Kontamination zu vermeiden, wird empfohlen, dem Kulturmedium nach dem Sortieren Antibiotika hinzuzufügen. Wenn ein vermeintlicher Krebsstammzellmarker durch den Kugelbildungstest vorläufig identifiziert wird, kann eine weitere Charakterisierung durch in vivo-begrenzenden Verdünnungstest durchgeführt werden, um die tumorgene Kapazität zu bewerten.Aus der Mechanismusstudie der Radioresistenz können Forscher das Protein untersuchen, das mit der Reparatur von DNA-Schäden, der Clearance von reaktiven Sauerstoffspezies und dem Zellzyklusstillstand als Reaktion auf Strahlung zusammenhängt. Bitte beachten Sie bei der Zellstrahlung, dass der Linearbeschleuniger nur von qualifizierten Technikern betrieben werden kann. Von Strahlung fernhalten.Beachten Sie im Stehen, dass Formaldehyd flüchtig und gefährlich ist. Verwenden Sie Formaldehyd in der Dunstabzugshaube.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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