Name: radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines
Uploaded: 2019-08-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (81402535 ו 81672969) ואת המפתח הלאומי מחקר ופיתוח פרוייקט (2016YFC0904703).

הערה: השלבים מתבצעים תחת הטמפרטורה שצוינה. לצעדים שבהם הטמפרטורה לא מוזכרת, יש לבצע מתחת לטמפרטורת החדר (18 – 25 ° c). יש לאחסן בינונית של תרבות התא ב-4 ° c, ולאחסן ריאגנטים נוסף בהתאם למדריכים של היצרן. המדיום צריך להיות מחומם מראש עד 37 ° צ' לפני שנוספו לתאים.
1. מיון תאים
<ol><li>בניי?...

<ol>
	<li>Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+as+a+predictive+factor+in+radiotherapy.">Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy.</a> Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).</li><li>Baumann, M., Krause, M., Hill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+role+of+cancer+stem+cells+in+radioresistance.">Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance.</a> Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).</li><li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells--perspectives+on+current+status+and+future+directions:+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells.">Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Wang, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+regulation+of+CHK1+and+CHK2+promotes+radioresistance+in+a+stem+cell-like+population+of+nasopharyngeal+carcinoma+cells.">MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells.</a> Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).</li><li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+reactive+oxygen+species+levels+and+radioresistance+in+cancer+stem+cells.">Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).</li><li>Gomez-Casal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-small+cell+lung+cancer+cells+survived+ionizing+radiation+treatment+display+cancer+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+phenotypes.">Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes.</a> Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).</li><li>Mihatsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+radioresistant+tumor+cells+and+presence+of+ALDH1+activity+in+vitro.">Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro.</a> Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).</li><li>Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit+(CACNA2D1)+enhances+radioresistance+in+cancer+stem-like+cells+in+non-small+cell+lung+cancer+cell+lines.">Calcium channel &#945;2&#948;1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines.</a> Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1B50-1,+a+mAb+raised+against+recurrent+tumor+cells,+targets+liver+tumor-initiating+cells+by+binding+to+the+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit.">1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel &#945;2&#948;1 subunit.</a> Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).</li><li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance:+Cancer+stem+cell.">Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell.</a> Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).</li><li>Zhang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+decarboxylase+activity+drives+non-small+cell+lung+cancer+tumor-initiating+cells+and+tumorigenesis.">Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis.</a> Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+self-renewal.">Cancer stem cells and self-renewal.</a> Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).</li><li>Morgan, M. A., Lawrence, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways:+overcoming+radiation+resistance+by+targeting+DNA+damage+response+pathways.">Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways.</a> Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+exploration+of+cancer+stem+cell+marker+voltage-dependent+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit-mediated+chemotherapy+resistance+in+small-cell+lung+cancer.">Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel &#945;2&#948;1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer.</a> Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר שיטות לחקר רגישות הרדיו של CSCs בקווי הסרטן בתוך מבחנה. במחקר זה, הביטוי של α2δ1 היא רציפה קווי התאים NSCLC. לכן, העליה מבוססת על בקרת isotype. לפני מיון, ביטוי α2δ1 יש לבחון בקווי תאים מרובים על ידי הזרמת cy, לנסות ומאומת על ידי QPCR או הכתם המערבי. מומלץ לנתח מחדש את הביטוי α2δ1 של מיון α2δ1...

הקרנות משחק תפקיד חשוב בטיפול בסרטן. עם זאת, קיומו של תאי גזע של סרטן רדיווריסיתיים (CSCs) עלול לגרום לנסיגה או תוצאות המסכן לאחר הקרנות1,2. CSCs מאופיינים ביכולת התחדשות עצמית שלהם ויכולת לייצר תאים סרטניים הטרוגניים3. משוריין עם נזק יעיל יותר DNA תיקון קיבולת או רמות גבוהות יותר של מערכות ניקוי הרדיקלי או מנגנונים אחרים, CSCs הם עמידים יחסית הקרנות4,5,6,7 , 8. זיהוי סמנים csc ולחקור את המנגנונים שלהם יקל על פיתוח תרופות אשר להתגבר על מבלי להעלות נזק רקמות נורמלי.
מתח מגודרת הערוץ סידן α2δ1 יחידת איזוטופס 5 דווחה כסמן עבור CSCs radinlc התאים בתוךשורות התאn. α2δ1 זוהה במקור כסמן CSC עבור קרצינומה של hepatocellular (HCC)10. באמצעות חיסון מופחתים עם זוג קווי תא HCC נגזר גידולים ראשוניים וחוזרים באותו החולה, נוגדן בשם 1B50-1 זוהה כדי למקד את תאי HCC חוזרים במיוחד. 1B50-1-תאים חיוביים הראו יעילות היווצרות כדור גבוה בתוך מבחנה וטווריגניות גבוהה ב vivo. האנטיגן שלה זוהה על ידי ספקטרומטר המסה, כמו ערוץ סידן α2δ1 יחידת איזוטופס 5. α2δ1 במיוחד מבטא ב CSCs והוא בלתי ניתן לגילוי ברקמות הנורמלי ביותר, מה שהופך אותו מועמד פוטנציאלי למיקוד CSCs10. α2δ1 יכול גם לשמש סמן CSC עבור קווי התאים NSCLC, והוא הוכח להקנות radioresistance לתאים NSCLC באופן חלקי על ידי שיפור היעילות של תיקון נזק DNA בתגובה קרינה9.
לימוד CSCs הקרינה עשוי לספק רמזים כדי להתגבר על קרינה. שימוש α2δ1 ב NSCLC כדוגמה, שיטות עיקריות כדי ללמוד את הרגישות הרדיושל CSCs מוצגים. בדרך כלל, CSCs מבודדים עם טוש משטח, ומאפייני תאי הגזע והרגישות הרדיוטיבית של אוכלוסיית התאים החיוביים והשליליים מושווים. היווצרות כדור במדיום ללא סרום שיושלם עם גורמי גדילה שתומכים בהתחדשות עצמית היא שיטת שימושי להעריך את הסטדיות של תאים בתחום החוץ. תאים בעלי קיבולת היווצרות כדור גבוה עשויים להראות הטוריגניות גבוהה כאשר מוזרק לתוך עכברים חיסוניים10,11,12. שיטת היווצרות המושבה משמשת להערכת רגישות הרדיו של תאים, הקובעת כמה איבדו את היכולת ליצור צאצאים היוצרים את המושבה לאחר מינון של קרינה13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B50-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel &#945;2&#948;1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% formaldehyde solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12500062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer/cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSARIA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1975</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_1511</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightning-Link Fluorescein Kit</td>
			<td>Innova Biosciences</td>
			<td>310-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linear accelerator</td>
			<td>VARIAN</td>
			<td>CLINAC 600C/D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBRGREEN</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>QPK-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Violet crystal staining solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines

הנוכחות של תאים גזע סרטן (CSCs) היה קשור עם נסיגה או תוצאות עניים לאחר הקרנות. לימוד CSCs הקרינה עשוי לספק רמזים כדי להתגבר על קרינה. מתח מגודרת הערוץ סידן α2δ1 יחידת איזוטופס 5 דווח כסמן עבור CSCs radioresistant בלתי קטן סרטן ריאות תאים (nsclc) קווי התא. באמצעות ערוץ הסידן α2δ1 יחידת כדוגמה של סמן csc, שיטות ללמוד את הרגישות הרדיושל CSCs בקווי התאים nsclc מוצגים. CSCs ממוינים עם סמנים באמצעות זרימה cy, ואת היכולת לחידוש עצמי של תאים מיון מוערך על ידי היווצרות כדור המערך. שיטת היווצרות המושבה, הקובעת כמה תאים מאבדים את היכולת ליצור צאצאים היוצרים את המושבה לאחר מינון מסוים של קרינה, מבוצעת לאחר מכן כדי להעריך את הרגישות הרדיושל תאים ממוינים. כתב יד זה מספק צעדים ראשוניים ללימוד הרגישות הרדיוCSCs, הקובע את הבסיס להבנה נוספת של המנגנון הבסיסי.

תאים A549 α2δ1-high ו-α2δ1-נמוך ממוינים (איור 1A). מספר סמנים עשויים להראות אוכלוסיות נפרדות וקלות לשער. עם זאת, סמנים מסוימים מציגים רק תבניות ביטוי גבוהות ונמוכות, במקום אוכלוסיות חיוביות ושליליות נפרדות. במצב זה, שליטה מסוג isotype היא מאוד חשובה עבור הארגון. הביטוי של α2δ1 בתאים ממו?...

Watch this Scientific Journal Video about Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines at JoVE.com

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

הנוכחות של תאים גזע סרטן שויך התדרדרות או תוצאות עניים לאחר הקרנות. כתב יד זה מתאר את השיטות ללמוד את רגישות הרדיו של תאי גזע סרטן בקווי סרטן הריאות.

רגישות רדיושל תאי גזע סרטן בסרטן ריאות תאים קווי

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי כי נוכחות של תאי גזע סרטניים עשוי להיות קשור עם הידרדרות או תוצאה גרועה לאחר הקרנות. לימוד תאי הגזע הרדיו-ססיסטיים עשוי לספק רמזים להתגברות על הרדיו-ארסיסטיות. בטכניקה זו, תאי גזע סרטניים מלוחים עם סמנים putative על ידי cytometry זרימה ואת יכולת התחדשות עצמית של תאים מלוחים מוערך על ידי מוצלח היווצרות כדור.ההתרשכות היווצרות המושבה מבוצעת כדי להעריך את הרגישות הרדיואקטיבית של תאים מלוחים. הוא קובע כמה תאים איבדו את יכולתם ליצור את הסינתזה שיוצרת את המושבה לאחר מנה מסוימת של קרינה. כתב יד זה מספק את הצעדים הראשונים למחקר רגישות רדיואקטיבית של תאי גזע סרטניים, אשר קובע את הבסיס למחקר מנגנון מלא יותר.מחקר מנגנון עשוי לכלול חלבונים הקשורים לתיקון נזק DNA, אישור של מיני חמצן תגובתי, מעצר מחזור התא, וכו '. זה יספק תובנות חשובות על איך תאי גזע סרטניים לקבל radioresistance וכיצד להתגבר על ההתנגדות. הדגמת הליך הקרינה תהיה חן-נאן לי, טכנאי קרינה מהמחלקה שלנו.כדי להתחיל בהליך זה, תאים A549 תרבות RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% FBS ב 10 ס"מ מנות ב 37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו חמצני. כאשר התאים מגיעים ל- 80 עד 90%,confluence, הסר את מדיום התרבות. בקצרה לשטוף את התאים עם שלושה מיליליטר של PBS.לאחר מכן, מוסיפים שלושה מיליליטר של 0.05% טריפסין לכל מנה. הסר את טריפסין ולהשאיר את טריפסין residuary לעכל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 עד 3 דקות. בדוק את הניתוק של התאים לעתים קרובות, כדי למנוע עיכול יתר.כאשר התאים הופכים רופף ולהתחיל להתנתק מן הכלים, להוסיף שלושה מיליליטר של RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% FBS ולהעביר את התאים השעיה לצינור 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב 300 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והתן מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של PBS.העבר 0.5 מיליליטר של ההשעיה התא לתוך צינור חדש כבקרת isotype. צנטריפוגה הן את צינורות הבקרה והן את צינורות הניסוי ב 300 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעיים.לאחר מכן, לדלל הן את בקרת איזוטיפ diconjugated פלואורסצנטי נוגדן PBS לריכוז אופטימלי titrated כדי להכין את פתרון העבודה. יש לעכל מחדש את הבקרה ואת תאי הניסוי עם כל פתרון עבודה ומערבבים בעדינות. הדגירה את הדגימות בחושך ו בטמפרטורת החדר במשך 30 עד 40 דקות.לשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מיליליטר של PBS, ערבוב בעדינות, צנטריפוגה ב 300 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעיים ותיישם מחדש את התאים עם 10 מיליליטר של PBS. לאחר מכן, מניחים 40 מסנני תא מיקרומטר על צינורות חדשים של 50 מיליליטר, ומוודאים להכין צינור נפרד ומערך מסננים עבור הבקרה ותאי הניסוי.החל כל מתלה תא על מסננת בהתאמה ולאסוף את הזרימה. צנטריפוגה הזרימה ב 300 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים עם 0.2 עד 1.0 מיליליטר של PBS והעבר כל מתלה תא לצינור נפרד של חמישה מיליליטר עבור ציטומטריית זרימה.בארון בטיחות ביולוגי, הכינו צלחת אחת של שש היטב לכל מנה של קרינה, כולל הקבוצה האפורה אפס. הוסף 1.5 מיליליטר של מדיה שהושלמה 1640 לכל באר. לדלל תאים שנקטפו עם מדיה הושלמה 1640 לצפיפות תאים של 1, 000 תאים למיליליטר.לאחר מכן, מוסיפים את ההשעיה התא מדולל ל בארות לנער את הצלחות אופקית כדי להפיץ באופן שווה את התאים בארות. הקלט את אמצעי האחסון שנוסף בכל קבוצת מנות. תרבות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.לאחר התאים מחוברים לתחתית בארות, להוסיף הושלמה 1640 מדיה לכל באר עד הגובה התקשורתי מגיע סנטימטר אחד. כאשר הצלחות מועברות בין חדר תרבות התא לחדר הקרנות, לעטוף את הצלחות עם רדיד אלומיניום או לשים אותם בתיבה נקייה, כדי למנוע זיהום. החזק את הצלחות שטוחות כדי למנוע שפיכה בינונית החוצה.לאחר מכן, נקבע על 20 ס"מ על ידי שדה קרינה 20 ס"מ. מניחים בולוס שווה ערך לרקמה בעובי 1.0 ס"מ על ספת הטיפול וממקמים את צלחת ששת הטובים על הבולוס כדי לשמור אותם במגע. תוודא שכל הלוחית נמצאת בתוך שדה הקרינה.הגדר את מרחק המקור-עור כ- 100 ס"מ והתאם את גובה ספת הטיפול כדי ליישר את רמת פני השטח הבינונית לרמת הלייזר. לספק את המינון שהוקצה לכל צלחת ברצף. לאחר מכן, קח את הצלחות לארון biosafety בחדר תרבות התא.החלף את המדיום בכל באר בשני מיליליטר של מדיום 1640 שהושלם. תרבות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, הקפדה לשנות את המדיום כל שלושה עד חמישה ימים. שבעה עד עשרה ימים לאחר הקרינה, להסיר את המדיום בקצרה לשטוף את התאים עם PBS.במכסה המנוע של האדים, הוסיפו מיליליטר אחד של 4% פורמלדהיד לכל באר כדי לתקן את התאים למשך 10 דקות. לאחר מכן, להסיר את פורמלדהיד ולשטוף כל באר פעמיים באמצעות שני מיליליטר של מים מזוקקים עבור כל לשטוף. הוסיפו מיליליטר אחד של תווי כתם סגול קריסטל 1% לכל באר והכתימו במשך 10 דקות.לאחר מכן, להסיר את פתרון הכתם סגול קריסטל ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם מים מזוקקים. מוציאים את המים ונותנים לצלחות להתייבש במשך 30 דקות. ספור את מספר המושבות עם יותר מ-50 תאים.במחקר זה, הן אלפא שתי דלתא אחד גבוה אלפא שני דלתא אחד נמוך A549 תאים ממוינים. סמנים מסוימים עשויים להראות אוכלוסיות נפרדות וקל לשער. עם זאת, סמנים מסוימים פשוט מראים דפוסי ביטוי גבוהים ונמוכים, ולא אוכלוסיות חיוביות ושליליות ייחודיות.במצב זה, בקרת isotype חשוב מאוד עבור gating. הביטוי של אלפא 2 דלתא אחד בתאים ממוינים מאומת על-ידי qPCR. הביטוי של CACNA2D1, הגן המקודד אלפא שתי דלתא אחת, הוא גבוה יותר אלפא ממוין שני דלתא תאים גבוהים אחד לעומת אלפא שני דלתא תאים נמוכים אחד.מורפולוגיה אופיינית של ספירות ויעילות היווצרות הכדור מוצגת כאן. אלפא שני דלתא תאים גבוהים אחד להראות יעילות היווצרות כדור גבוה יותר, מה שמרמז על יכולת התחדשות עצמית גבוהה יותר. תמונות אופייניות של מושבות ועקומות הישרדות מוצגות כאן.מושבה עם כ-50 תאים יכולה להיבדק תחת מיקרוסקופ ולסמן אותה כהפניה. מספר המושבות נספר, ואז ניתן לחשב שבר הישרדות בכל מנה ונוכנה עקומת הישרדות. אלפא שני דלתא תאים גבוהים אחד עמידים יחסית לקרינה לעומת אלפא שני דלתא תאים נמוכים אחד.כל שלב הקשור לתרבות התאים צריך להתבצע בארון הבטיחות הביולוגי או בספסל הנקי למינארי. כדי למנוע זיהום, מומלץ להוסיף אנטיביוטיקה למדיום התרבות לאחר המיון. כאשר סמן תאי גזע סרטן putative מזוהה מראש על ידי בדיקת היווצרות הכדור, אפיון נוסף על ידי vivo הגבלת בדיקה דילול יכול להתבצע כדי להעריך את היכולת tumorigenic.ממחקר המנגנון של radioresistance, החוקרים יכולים לבחון את החלבון הקשור לתיקון נזק DNA, אישור של מיני חמצן תגובתי, ומעצר מחזור התא בתגובה לקרינה. במהלך קרינת התא, שים לב כי המאיץ ליניארי יכול להיות מופעל רק על ידי טכנאים מוסמכים. תתרחק מקרינה.בעמידה, שים לב כי פורמלדהיד הוא הפכפך ומסוכן. השתמש בפורמלדהיד במכסה המנוע של האדים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

פרוטוקול תרבית תאי ראפיד פוסט מורטם של Glioma Pontine המפוזר העצמותי (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

מכתים אלסטי על פרפין-שקופיות מוטבעות של רקמת סרטן pT3N0M0 קיבה

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

בידוד תאי גזע mesenchymal זולה רקמות, תרבות משותפת עם תאים סרטניים ללמוד אינטראקציות שלהם

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

הקמה ואפיון של שלוש מנות העמידות Afatinib של ריאה אדנוקרצינומה PC-9 תאים שפותחו עם הגדלת מינונים של Afatinib

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

הזרמת כדוריות הדם של מיני חמצן מיטוכונדריאלי מורטין בגזע ובתאי מחולל ולוקמיה מונחה AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

אפיון מוטציות הקשורות למחלות של חיל המשפחה באמצעות קבוצה של שיטות מעשיות ושימושיות

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאים סרטניים במחזור בין שאינם קטנים תאים סרטן ריאות חולים על ידי Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...