Name: radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines
Uploaded: 2019-08-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines at JoVE.com

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81402535 और 81672969) और राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास परियोजना (2016YFC0904703) द्वारा समर्थित किया गया था।

नोट: कदम संकेत तापमान के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं। जिन चरणों में तापमान का उल्लेख नहीं किया गया है, उनके लिए कमरे के तापमान (18-25 र्ब्) के अधीन कार्य करें। सेल संस्कृति माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कि...

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	<li>Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+as+a+predictive+factor+in+radiotherapy.">Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy.</a> Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).</li><li>Baumann, M., Krause, M., Hill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+role+of+cancer+stem+cells+in+radioresistance.">Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance.</a> Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).</li><li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells--perspectives+on+current+status+and+future+directions:+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells.">Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Wang, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+regulation+of+CHK1+and+CHK2+promotes+radioresistance+in+a+stem+cell-like+population+of+nasopharyngeal+carcinoma+cells.">MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells.</a> Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).</li><li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+reactive+oxygen+species+levels+and+radioresistance+in+cancer+stem+cells.">Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).</li><li>Gomez-Casal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-small+cell+lung+cancer+cells+survived+ionizing+radiation+treatment+display+cancer+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+phenotypes.">Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes.</a> Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).</li><li>Mihatsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+radioresistant+tumor+cells+and+presence+of+ALDH1+activity+in+vitro.">Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro.</a> Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).</li><li>Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit+(CACNA2D1)+enhances+radioresistance+in+cancer+stem-like+cells+in+non-small+cell+lung+cancer+cell+lines.">Calcium channel &#945;2&#948;1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines.</a> Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1B50-1,+a+mAb+raised+against+recurrent+tumor+cells,+targets+liver+tumor-initiating+cells+by+binding+to+the+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit.">1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel &#945;2&#948;1 subunit.</a> Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).</li><li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance:+Cancer+stem+cell.">Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell.</a> Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).</li><li>Zhang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+decarboxylase+activity+drives+non-small+cell+lung+cancer+tumor-initiating+cells+and+tumorigenesis.">Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis.</a> Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+self-renewal.">Cancer stem cells and self-renewal.</a> Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).</li><li>Morgan, M. A., Lawrence, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways:+overcoming+radiation+resistance+by+targeting+DNA+damage+response+pathways.">Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways.</a> Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+exploration+of+cancer+stem+cell+marker+voltage-dependent+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit-mediated+chemotherapy+resistance+in+small-cell+lung+cancer.">Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel &#945;2&#948;1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer.</a> Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).</li></ol>

यह प्रोटोकॉल इन विट्रो में कैंसर सेल लाइनों में सीएससी की विकिरण संवेदनशीलता का अध्ययन करने के तरीकों का वर्णन करता है। इस अध्ययन में, एनएससीएलसी सेल लाइनों में $2$1 की अभिव्यक्ति निरंतर है। इसलिए, gating एक ...

रेडियोथेरेपी कैंसर के इलाज में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। तथापि, रेडियो प्रतिरोधी कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) के अस्तित्व रेडियोथेरेपी1,2के बाद पतन या खराब परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। सीएससी उनके आत्म नवीनीकरण क्षमता और विषमजात कैंसर कोशिकाओं3उत्पन्न करने की क्षमता की विशेषता है। एक अधिक कुशल डीएनए क्षति की मरम्मत क्षमता या मुक्त मूल अपमार्जन प्रणाली या अन्य तंत्र के उच्च स्तर के साथ बख़्तरबंद, सीएससी अपेक्षाकृत रेडियोथेरेपी4केलिए प्रतिरोधी रहे हैं ,5,6,7 , 8. सीएससी मार्करों की पहचान करना और उनके तंत्र की खोज करने से उन दवाओं के विकास में मदद मिलेगी जो सामान्य ऊतक क्षति को बढ़ाए बिना रेडियो प्रतिरोध को दूर करेंगी।
एनएससीएलसी सेल लाइनों9में रेडियो प्रतिरोधी सीएससी के लिए एक मार्कर के रूप में वोल्टेज-गेट्ड कैल्शियम चैनल $2 ]1 उपइकाई समरूप 5 की सूचना दी गई है। [2] 1 मूल रूप से hepatotocellular कार्सिनोमा (एचसीसी)10के लिए एक सीएससी मार्कर के रूप में पहचान की गई थी। एक ही रोगी में प्राथमिक और आवर्तक ट्यूमर से व्युत्पन्न एचसीसी सेल लाइनों की एक जोड़ी के साथ subtractive प्रतिरक्षण का उपयोग करना, एक एंटीबॉडी नाम 1B50-1 विशेष रूप से आवर्तक एचसीसी कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए पहचान की गई थी। 1B50-1-सकारात्मक कोशिकाओं विवो में इन विट्रो और उच्च tumorigenicity में उच्च क्षेत्र गठन दक्षता से पता चला. इसका प्रतिजन मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाना गया था, के रूप में कैल्शियम चैनल $2 ] 1 subunit isoform 5. [2] 1 विशेष रूप से CSCs में व्यक्त करता है और सबसे सामान्य ऊतकों में undetectable है, यह CS10को लक्षित करने के लिए एक संभावित उम्मीदवार बना रही है. यह एनएससीएलसी सेल लाइनों के लिए सीएससी मार्कर के रूप में भी कार्य कर सकता है, और विकिरण9के प्रत्युत्तर में डीएनए क्षति मरम्मत की दक्षता को बढ़ाकर आंशिक रूप से एनएससीएलसी कोशिकाओं को रेडियो प्रतिरोध प्रदान करने के लिए दिखाया गया है।
रेडियो प्रतिरोधी सीएससी का अध्ययन रेडियो प्रतिरोध पर काबू पाने के लिए सुराग प्रदान कर सकते हैं. एनएससीएलसी में एक उदाहरण के रूप में 2$1 का उपयोग करते हुए सीएससी की रेडियो संवेदनशीलता का अध्ययन करने के लिए प्रमुख विधियाँ प्रस्तुत की जाती हैं। आमतौर पर, CS एक putative सतह मार्कर के साथ अलग कर रहे हैं, और स्टेम सेल विशेषताओं और सकारात्मक और नकारात्मक सेल आबादी के radiosensitivity तुलना कर रहे हैं. एक सीरम मुक्त माध्यम में क्षेत्र गठन विकास कारकों है कि आत्म नवीनीकरण का समर्थन के साथ पूरक इन विट्रो में कोशिकाओं के स्टेमनेस का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी परख है. उच्च क्षेत्र निर्माण क्षमता वाले कोशिकाओं में प्रतिरक्षाविहीन चूहों10,11,12में इंजेक्ट किए जाने पर उच्च ट्यूमरीनिकता दिखाई देने की संभावना है . कॉलोनी गठन परख तो कोशिकाओं की रेडियो संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो निर्धारित करता है कि कितने विकिरण13की एक खुराक के बाद कॉलोनी बनाने के वंशज उत्पन्न करने की क्षमता खो दिया है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B50-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel &#945;2&#948;1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% formaldehyde solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12500062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer/cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSARIA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1975</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_1511</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightning-Link Fluorescein Kit</td>
			<td>Innova Biosciences</td>
			<td>310-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linear accelerator</td>
			<td>VARIAN</td>
			<td>CLINAC 600C/D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBRGREEN</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>QPK-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Violet crystal staining solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines

कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) की उपस्थिति रेडियोथेरेपी के बाद पतन या गरीब परिणामों के साथ जुड़ा हुआ है। रेडियो प्रतिरोधी सीएससी का अध्ययन रेडियो प्रतिरोध पर काबू पाने के लिए सुराग प्रदान कर सकते हैं. गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी) सेल लाइनों में रेडियो प्रतिरोधी सीएससी के लिए एक मार्कर के रूप में वोल्टेज-गेट्ड कैल्शियम चैनल [2] 1 उपइकाई समरूप 5 की सूचना दी गई है। एक सीएससी मार्कर के एक उदाहरण के रूप में कैल्शियम चैनल $2 $ 1 उपइकाई का उपयोग करते हुए, एनएससीएलसी सेल लाइनों में सीएससी की रेडियो संवेदनशीलता का अध्ययन करने के लिए तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं। सीएससी प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा putative मार्करों के साथ हल कर रहे हैं, और हल कोशिकाओं के आत्म नवीनीकरण क्षमता क्षेत्र गठन परख द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। कॉलोनी गठन परख, जो निर्धारित करता है कि कितने कोशिकाओं विकिरण की एक निश्चित खुराक के बाद कॉलोनी बनाने के वंशज उत्पन्न करने की क्षमता खो देते हैं, तो हल कोशिकाओं की रेडियो संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए किया जाता है। यह पांडुलिपि सीएससी की विकिरण संवेदनशीलता का अध्ययन करने के लिए प्रारंभिक कदम प्रदान करती है, जो अंतर्निहित तंत्र की आगे समझने के लिए आधार स्थापित करती है।

र्ं2ं १-१-उच्चतथा र्2े1-निम्न अ549 कोशिकाओं को हल किया गया था (चित्र 1क)। कुछ मार्करों अलग आबादी दिखा सकते हैं और गेट करने के लिए आसान कर रहे हैं. हालांकि, कुछ मार्करों सिर्फ उच्च और कम अभिव्यक्ति प?...

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Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

कैंसर स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति रेडियोथेरेपी के बाद पतन या गरीब परिणामों के साथ जुड़ा हुआ है। इस पांडुलिपि फेफड़ों के कैंसर सेल लाइनों में कैंसर स्टेम कोशिकाओं की रेडियो संवेदनशीलता का अध्ययन करने के तरीकों का वर्णन करता है।

फेफड़ों के कैंसर सेल लाइन्स में कैंसर स्टेम सेल की रेडियो संवेदनशीलता

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि कैंसर स्टेम सेल की उपस्थिति रिलेप्स या रेडियोथेरेपी के बाद खराब परिणाम से जुड़ी हो सकती है। रेडियोरिस्ट स्टेम सेल का अध्ययन रेडियोरेस्टेंस पर काबू पाने के लिए सुराग प्रदान कर सकता है। इस तकनीक में, कैंसर स्टेम कोशिकाओं प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा ख्यात मार्कर के साथ नमकीन कर रहे है और नमकीन कोशिकाओं की आत्म नवीकरण क्षमता क्षेत्र गठन परख द्वारा मूल्यांकन किया जाता है ।कॉलोनी निर्माण परख नमकीन कोशिकाओं की रेडियोसेंसिटिविटी का आकलन करने के लिए किया जाता है। यह निर्धारित करता है कि कितनी कोशिकाओं ने विकिरण की एक निश्चित खुराक के बाद कॉलोनी बनाने वाले संश्लेषण उत्पन्न करने की क्षमता खो दी। यह पांडुलिपि कैंसर स्टेम सेल के रेडियोसेंसिटिविटी अध्ययन के लिए प्रारंभिक कुछ कदम प्रदान करती है, जो फुलर तंत्र अध्ययन के लिए आधार स्थापित करती है।तंत्र अध्ययन में डीएनए क्षति मरम्मत, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की निकासी, सेल चक्र गिरफ्तारी आदि से संबंधित प्रोटीन शामिल हो सकते हैं । यह कैसे कैंसर स्टेम सेल रेडियोरजिस्टेंस मिलता है और कैसे प्रतिरोध पर काबू पाने के लिए में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा । विकिरण प्रक्रिया का प्रदर्शन चेन-नान ली, हमारे विभाग से एक विकिरण तकनीशियन होगा ।इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, आरपीएमआई-1640 मध्यम में संस्कृति A549 कोशिकाओं को 10 सेंटीमीटर व्यंजनों में 10% एफबीएस के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर, 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ पूरक किया गया। जब कोशिकाएं 80 से 90 फीसद संगम तक पहुंच जाएं तो संस्कृति माध्यम को हटा दें। संक्षेप में पीबीएस के तीन मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोते हैं।इसके बाद, प्रत्येक डिश में 0.05% ट्राइपसिन के तीन मिलीलीटर जोड़ें। ट्रिप्पसिन निकालें और एक से तीन मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को पचाने के लिए सापेक्ष ट्राइप्सिन छोड़ दें। अधिक पाचन से बचने के लिए कोशिकाओं की टुकड़ी की अक्सर जांच करें।जब कोशिकाएं ढीली हो जाती हैं और व्यंजनों से अलग होने लगती हैं, तो 10% एफबीएस के साथ पूरक आरपीएमआई-1640 मध्यम के तीन मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं को निलंबन को 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। सेंट्रलाइज 300 बार जी पर और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर। सुपरनेट को त्यागें और पीबीएस के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।आइसोटाइप नियंत्रण के रूप में सेल निलंबन के 0.5 मिलीलीटर को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। 300 बार जी और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर नियंत्रण और प्रायोगिक ट्यूब दोनों को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेटेंट को छोड़ दें।फिर, काम समाधान तैयार करने के लिए इष्टतम एकाग्रता के लिए पीबीएस में फ्लोरोसेंट डाइकोजुगेट आइसोटाइप नियंत्रण और एंटीबॉडी दोनों को पतला करें। प्रत्येक कार्य समाधान के साथ नियंत्रण और प्रयोगात्मक कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और धीरे-धीरे मिलाएं। नमूनों को अंधेरे में और कमरे के तापमान पर 30 से 40 मिनट तक इनक्यूबेट करें।पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धोएं, धीरे से मिलाएं, और ३०० बार जी पर और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र । सुपरनेटेंट्स को त्यागें और पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को फिर से रीसल्ब करें। इसके बाद, नए 50 मिलीलीटर ट्यूबों पर 40 माइक्रोमीटर सेल छन्नी रखें, जिससे नियंत्रण और प्रयोगात्मक कोशिकाओं के लिए एक अलग ट्यूब और छलनी सेटअप तैयार करना सुनिश्चित करें।प्रत्येक कोशिका निलंबन को संबंधित छलनी पर लागू करें और प्रवाह को इकट्ठा करें। सेंट्रलाइज प्रवाह ३०० बार जी पर और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर । सुपरनेट को त्यागें और कोशिकाओं को पीबीएस के 0.2 से 1.0 मिलीलीटर के साथ फिर से खर्च करें और प्रत्येक कोशिका निलंबन को प्रवाह साइटोमेट्री के लिए एक अलग पांच मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, शून्य ग्रे समूह सहित प्रत्येक विकिरण खुराक के लिए एक छह अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें। प्रत्येक कुएं में 1.5 मिलीलीटर पूर्ण 1640 मीडिया जोड़ें। 1640 मीडिया के साथ पतला काटा कोशिकाओं 1, 000 कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर की एक कोशिका घनत्व के लिए।फिर, कुओं में पतला कोशिका निलंबन जोड़ें और प्लेटों को क्षैतिज रूप से हिलाएं ताकि कुओं में कोशिकाओं को समान रूप से वितरित किया जा सके। प्रत्येक खुराक समूह में जोड़े गए वॉल्यूम को रिकॉर्ड करें। 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति ।कोशिकाओं के बाद कुओं के नीचे से जुड़ा हुआ है, प्रत्येक अच्छी तरह से पूरा १६४० मीडिया जोड़ने के लिए जब तक मीडिया की ऊंचाई एक सेंटीमीटर तक पहुंचता है । जब प्लेटों को सेल कल्चर रूम और रेडिएशन थेरेपी रूम के बीच स्थानांतरित कर दिया जाता है, तो प्लेटों को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटें या संदूषण से बचने के लिए उन्हें एक साफ बॉक्स में डाल दें। मध्यम रिसाव से बचने के लिए प्लेटों को सपाट रखें।इसके बाद, 20 सेंटीमीटर विकिरण क्षेत्र से 20 सेंटीमीटर पर सेट करें। उपचार सोफे पर 1.0 सेंटीमीटर मोटाई के ऊतक समकक्ष बोलस रखें और उन्हें संपर्क में रखने के लिए बोलस पर छह अच्छी तरह से प्लेट रखें। सुनिश्चित करें कि पूरी प्लेट विकिरण क्षेत्र के भीतर है।स्रोत-त्वचा की दूरी को 100 सेंटीमीटर के रूप में सेट करें और मध्यम सतह स्तर को लेजर स्तर पर संरेखित करने के लिए उपचार सोफे की ऊंचाई को समायोजित करें। क्रम में प्रत्येक प्लेट के लिए सौंपा खुराक वितरित करें। इसके बाद, प्लेटों को सेल कल्चर रूम में बायोसेफ्टी कैबिनेट में ले जाएं।प्रत्येक कुएं में माध्यम को पूर्ण 1640 माध्यम के दो मिलीलीटर के साथ बदलें। 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति, हर तीन से पांच दिनों में माध्यम को बदलने के लिए सुनिश्चित कर रही है । विकिरण के सात से 10 दिन बाद, माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को पीबीएस से संक्षेप में धोएं।एक धूम हुड में, कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए ठीक करने के लिए प्रत्येक कुएं में 4% फॉर्मलडिहाइड का एक मिलीलीटर जोड़ें। फिर, फॉर्मलडिहाइड को हटा दें और प्रत्येक धोने के लिए दो मिलीलीटर आसुत पानी का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से दो बार धोएं। प्रत्येक अच्छी तरह से 1% क्रिस्टल वायलेट दाग समाधान और 10 मिनट के लिए दाग का एक मिलीलीटर जोड़ें।इसके बाद क्रिस्टल वायलेट दाग घोल को हटा दें और कोशिकाओं को डिस्टिल्ड वॉटर से तीन बार धोएं। पानी निकालें और प्लेटों को 30 मिनट के लिए सूखने दें। 50 से अधिक कोशिकाओं वाली कॉलोनियों की संख्या गिनें।इस अध्ययन में, दोनों अल्फा दो डेल्टा एक उच्च और अल्फा दो डेल्टा एक कम A549 कोशिकाओं को हल कर रहे हैं । कुछ मार्कर अलग आबादी दिखा सकते हैं और गेट करने के लिए आसान कर रहे हैं। हालांकि, कुछ मार्कर विशिष्ट सकारात्मक और नकारात्मक आबादी के बजाय उच्च और निम्न अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाते हैं।इस स्थिति में गेटिंग के लिए आइसोटाइप कंट्रोल बहुत जरूरी है। सॉर्ट कोशिकाओं में अल्फा दो डेल्टा एक की अभिव्यक्ति क्यूपीसीआर द्वारा मान्य है। CACNA2D1 की अभिव्यक्ति, जीन है कि अल्फा दो डेल्टा एक एन्कोड, अल्फा दो डेल्टा एक कम कोशिकाओं के साथ तुलना में हल अल्फा दो डेल्टा एक उच्च कोशिकाओं में उच्च है ।क्षेत्रों की विशिष्ट आकृति विज्ञान और क्षेत्र निर्माण दक्षता यहां दिखाई गई है। अल्फा दो डेल्टा एक उच्च कोशिकाओं उच्च क्षेत्र गठन दक्षता दिखाने के लिए, एक उच्च आत्म नवीकरण क्षमता का सुझाव । कालोनियों और अस्तित्व घटता की विशिष्ट छवियां यहां दिखाई जाती हैं।लगभग 50 कोशिकाओं वाली कॉलोनी की जांच माइक्रोस्कोप के तहत की जा सकती है और संदर्भ के रूप में चिह्नित किया जा सकता है। उपनिवेशों की संख्या गिना जाता है, फिर प्रत्येक खुराक पर एक जीवित रहने के अंश की गणना की जा सकती है और एक अस्तित्व वक्र प्लॉट किया जा सकता है। अल्फा दो डेल्टा एक उच्च कोशिकाएं अल्फा दो डेल्टा एक कम कोशिकाओं की तुलना में विकिरण के लिए अपेक्षाकृत प्रतिरोधी हैं।सेल कल्चर से संबंधित कोई भी कदम जैविक सुरक्षा कैबिनेट या लैमिनार क्लीन बेंच में किया जाना चाहिए। संदूषण से बचने के लिए, छंटाई के बाद संस्कृति माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़ने की सिफारिश की जाती है। जब एक ख्यात कैंसर स्टेम सेल मार्कर प्रारंभिक क्षेत्र गठन परख द्वारा पहचाना जाता है, वीवो सीमित कमजोर पड़ने परख में द्वारा आगे लक्षण वर्णन ट्यूमरजनक क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है ।रेडियोरिस्टेंस के तंत्र अध्ययन से, शोधकर्ता डीएनए क्षति मरम्मत, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की निकासी, और विकिरण के जवाब में सेल चक्र गिरफ्तारी से संबंधित प्रोटीन की जांच कर सकते हैं । सेल विकिरण के दौरान, कृपया ध्यान दें कि रैखिक त्वरक केवल योग्य तकनीशियनों द्वारा संचालित किया जा सकता है। रेडिएशन से दूर रहें।खड़े होते समय, कृपया ध्यान दें कि फॉर्मलडिहाइड अस्थिर और खतरनाक है। धूम हुड में फॉर्मलडिहाइड का उपयोग करें।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

फैलाना आंतरिक Pontine Glioma की रैपिड पोस्टमार्टम सेल संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

फेफड़ों के ऊतकों में ट्यूमर कोशिका दृश्य परिसंचारी के लिए एक फेफड़े औपनिवेशीकरण परख की स्थापना

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

pT3N0M0 गैस्ट्रिक कैंसर ऊतक के पैराफिन-एम्बेडेड स्लाइड पर लोचदार दाग

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymal लुगदी ऊतक और सह कैंसर कोशिकाओं के साथ संस्कृति से कोशिका अलगाव स्टेम उनके बातचीत का अध्ययन करने के लिए

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

स्थापना और तीन Afatinib प्रतिरोधी फेफड़े Adenocarcinoma पीसी-9 सेल लाइन्स की विशेषता Afatinib की बढ़ती खुराक के साथ विकसित

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

यूरीन हेमाटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाओं और एमएल-AF9 प्रेरित ल्यूकेमिया में Mitochondrial प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के प्रवाह Cytometric विश्लेषण

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

व्यावहारिक और संभावित तरीकों का एक सेट का उपयोग करके आरएएफ परिवार Kinases के रोग से संबंधित उत्परिवर्ती विशेषता

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

गैस्ट्रिक कैंसर रोगी व्युत्पन्न Xenograft मॉडल और प्राथमिक सेल लाइनों की स्थापना

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर रोगियों से अर्द्ध-स्वचालित पीडी-एल 1 विशेषता और परिसंचरण ट्यूमर कोशिकाओं की गणना

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

ट्यूमर एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग करना

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...