Name: radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines
Uploaded: 2019-08-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81402535 e 81672969) e dal National Key Research and Development Project (2016YFC0904703).

NOTA: I passi vengono eseguiti sotto la temperatura indicata. Per i passaggi in cui la temperatura non è menzionata, eseguire sotto la temperatura ambiente (18-25 gradi centigradi). Il mezzo di coltura cellulare deve essere immagazzinato a 4 gradi centigradi, e altri reagenti devono essere conservati secondo le guide del produttore. Medio deve essere preriscaldato a 37 gradi centigradi prima di essere aggiunto alle cellule.
1. Ordinamento delle celle
<ol><li>Coniugazione anticorpale NOTA...

<ol>
	<li>Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+as+a+predictive+factor+in+radiotherapy.">Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy.</a> Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).</li><li>Baumann, M., Krause, M., Hill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+role+of+cancer+stem+cells+in+radioresistance.">Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance.</a> Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).</li><li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells--perspectives+on+current+status+and+future+directions:+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells.">Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Wang, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+regulation+of+CHK1+and+CHK2+promotes+radioresistance+in+a+stem+cell-like+population+of+nasopharyngeal+carcinoma+cells.">MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells.</a> Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).</li><li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+reactive+oxygen+species+levels+and+radioresistance+in+cancer+stem+cells.">Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).</li><li>Gomez-Casal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-small+cell+lung+cancer+cells+survived+ionizing+radiation+treatment+display+cancer+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+phenotypes.">Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes.</a> Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).</li><li>Mihatsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+radioresistant+tumor+cells+and+presence+of+ALDH1+activity+in+vitro.">Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro.</a> Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).</li><li>Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit+(CACNA2D1)+enhances+radioresistance+in+cancer+stem-like+cells+in+non-small+cell+lung+cancer+cell+lines.">Calcium channel &#945;2&#948;1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines.</a> Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1B50-1,+a+mAb+raised+against+recurrent+tumor+cells,+targets+liver+tumor-initiating+cells+by+binding+to+the+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit.">1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel &#945;2&#948;1 subunit.</a> Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).</li><li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance:+Cancer+stem+cell.">Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell.</a> Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).</li><li>Zhang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+decarboxylase+activity+drives+non-small+cell+lung+cancer+tumor-initiating+cells+and+tumorigenesis.">Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis.</a> Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+self-renewal.">Cancer stem cells and self-renewal.</a> Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).</li><li>Morgan, M. A., Lawrence, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways:+overcoming+radiation+resistance+by+targeting+DNA+damage+response+pathways.">Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways.</a> Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+exploration+of+cancer+stem+cell+marker+voltage-dependent+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit-mediated+chemotherapy+resistance+in+small-cell+lung+cancer.">Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel &#945;2&#948;1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer.</a> Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).</li></ol>

Questo protocollo descrive i metodi per studiare la radiosensibilità dei CSC nelle linee cellulari tumorali in vitro. In questo studio, l'espressione di "2" è continua nelle righe cellulari NSCLC. Pertanto, gating si basa su un controllo isotipo. Prima dell'ordinamento, l'espressione n. 2 s1 deve essere esaminata in più linee cellulari per citometria di flusso e convalidata da QPCR o macchia occidentale. Si raccomanda di analizzare nuovamente l'espressione di , 1, delle cellule ordinate di 1-alto e di 1-basso per cito...

La radioterapia svolge un ruolo importante nel trattamento del cancro. Tuttavia, l'esistenza di cellule staminali tumorali radioresistenti (CSC) può portare a ricadute o a scarsi esiti dopo la radioterapia1,2. I CSC sono caratterizzati dalla loro capacità di auto-rinnovamento e dalla capacità di generare cellule tumorali eterogenoe3. Corazzati con una capacità di riparazione dei danni al DNA più efficiente o livelli più elevati di sistemi di scavenging a radicali liberi o altri meccanismi, i CSC sono relativamente resistenti alla radioterapia4,5,6,7 , 8. L'identificazione dei marcatori CSC e l'esplorazione dei loro meccanismi faciliterà lo sviluppo di farmaci che supereranno la radioresistenza senza aumentare i normali danni ai tessuti.
Il canale di calcio con tensione-gated n. 2 - 1 isoforme 5 è stato segnalato come marcatore per i CSC radioresistenti nelle linee cellulari NSCLC9. L'H2-1 è stato originariamente identificato come marcatore CSC per il carcinoma epatocellulare (HCC)10. Utilizzando l'immunizzazione sottrattiva con una coppia di linee cellulari HCC derivate dai tumori primari e ricorrenti nello stesso paziente, è stato identificato un anticorpo denominato 1B50-1 per colpire specificamente le cellule HCC ricorrenti. 1B50-1-positivo le cellule hanno mostrato un'elevata efficienza di formazione della sfera in vitro e un'elevata tumorigenicità in vivo. Il suo antigene è stato identificato dalla spettrometria di massa, come isometria di sottounità di calcio 2 . L'espresso da 2 a 1 espressamente nei CSC non è rilevabile nella maggior parte dei tessuti normali, rendendolo un potenziale candidato per il targeting dei CSC10. Il numero 2 può anche fungere da marcatore CSC per le linee cellulari NSCLC, ed è stato dimostrato che impartisce parzialmente la radioresistenza alle cellule NSCLC migliorando l'efficienza della riparazione dei danni al DNA in risposta alle radiazioni9.
Lo studio dei CSC radioresistenti può fornire indizi per superare la radioresistenza. Come esempio, l'uso di .2-1 nel NSCLC, vengono presentati i principali metodi per studiare la radiosensibilità dei CSC. Di solito, i CSC sono isolati con un marcatore di superficie putativo e vengono confrontate le caratteristiche delle cellule staminali e la radiosensibilità delle popolazioni cellulari positive e negative. La formazione di sfere in un mezzo privo di siero integrato con fattori di crescita che supportano l'auto-rinnovamento è un utile saggio per valutare lo stelo delle cellule in vitro. Le cellule con elevata capacità di formazione della sfera possono mostrare un'elevata tumoripotenza quando iniettate in topi immunodeficienti10,11,12. Il saggio di formazione della colonia viene quindi utilizzato per valutare la radiosensibilità delle cellule, che determina quanti hanno perso la capacità di generare discendenti formando la colonia dopo una dose di radiazioni13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B50-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel &#945;2&#948;1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% formaldehyde solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12500062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer/cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSARIA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1975</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_1511</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightning-Link Fluorescein Kit</td>
			<td>Innova Biosciences</td>
			<td>310-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linear accelerator</td>
			<td>VARIAN</td>
			<td>CLINAC 600C/D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBRGREEN</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>QPK-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Violet crystal staining solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines

La presenza di cellule staminali tumorali (CSC) è stata associata a ricadute o scarsi esiti dopo la radioterapia. Lo studio dei CSC radioresistenti può fornire indizi per superare la radioresistenza. Il canale di calcio con cancello di tensione n. 2 è stato segnalato come marcatore per i CSC radioresistenti nelle linee cellulari del cancro del polmone non piccolo (NSCLC). Utilizzando il canale di calcio di 1 o più come esempio di marcatore CSC, vengono presentati metodi per studiare la radiosensibilità dei CSC nelle linee cellulari NSCLC. I CSC sono ordinati con marcatori putativi in base alla citometria di flusso e la capacità di auto-rinnovamento delle cellule ordinate viene valutata in base all'espressione di esempio di formazione. Il saggio di formazione della colonia, che determina quante cellule perdono la capacità di generare discendenti formando la colonia dopo una certa dose di radiazioni, viene quindi eseguito per valutare la radiosensibilità delle cellule ordinate. Questo manoscritto fornisce i primi passi per studiare la radiosensibilità dei CSC, che stabilisce le basi per un'ulteriore comprensione dei meccanismi sottostanti.

Le celle A549 di livello 1 e di abbassamento di 1 USD sono state ordinate (Figura 1A). Alcuni marcatori possono mostrare popolazioni distinte e sono facili da tenere al cancello. Tuttavia, alcuni marcatori mostrano solo modelli di espressione alta e bassa, piuttosto che popolazioni positive e negative distinte. In questo caso, un controllo isotipo è molto importante per gating. L'espressione di 2 x 1 nelle celle ordinate viene convalidata da qPCR. L'espressione di CACNA2D1, il gene...

Watch this Scientific Journal Video about Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines at JoVE.com

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

La presenza di cellule staminali tumorali è stata associata a ricadute o scarsi esiti dopo la radioterapia. Questo manoscritto descrive i metodi per studiare la radiosensibilità delle cellule staminali tumorali nelle linee cellulari del cancro polmonare.

Radiosensibilità delle cellule staminali tumorali nelle linee cellulari del cancro del polmone

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Questo protocollo è significativo perché la presenza di cellule staminali tumorali può essere associata a ricaduta o a un esito negativo dopo la radioterapia. Lo studio delle cellule staminali radioresistenti può fornire indizi per superare la radioreistenza. In questa tecnica, le cellule staminali tumorali sono salate con marcatori putativi per citometria del flusso e la capacità di auto-rinnovamento delle cellule salate viene valutata per test di formazione della sfera.Il saggio di formazione della colonia viene eseguito per valutare la radiosensibilità delle cellule salate. Determina quante cellule hanno perso la loro capacità di generare la sintesi che forma la colonia dopo una certa dose di radiazioni. Questo manoscritto fornisce i primi passi per lo studio della radiosensibilità delle cellule staminali tumorali, che stabilisce le basi per uno studio più completo del meccanismo.Lo studio del meccanismo può coinvolgere proteine legate alla riparazione dei danni al DNA, alla clearance delle specie reattive dell'ossigeno, all'arresto del ciclo cellulare, ecc. Fornirà importanti informazioni su come le cellule staminali tumorali ottengono la radioreistenza e su come superare la resistenza. A dimostrare la procedura di radiazioni sarà Chen-Nan Li, un tecnico delle radiazioni del nostro dipartimento.Per iniziare questa procedura, coltura A549 cellule in mezzo RPMI-1640 integrato con 10%FBS in piatti di 10 centimetri a 37 gradi Celsius, con 5% di anidride carbonica. Quando le celle raggiungono l'80-90% di confluenza, rimuovere il supporto di coltura. Lavare brevemente le cellule con tre millilitri di PBS.Aggiungere quindi tre millilitri dello 0,05% di triptina a ciascun piatto. Rimuovere la tripina e lasciare la tripina residuaria per digerire le cellule a 37 gradi Celsius per uno o tre minuti. Controllare frequentemente il distacco delle cellule per evitare la sovragestione.Quando le cellule si allentano e iniziano a staccarsi dai piatti, aggiungere tre millilitri di mezzo RPMI-1640 integrati con 10%FBS e trasferire la sospensione delle cellule in un tubo da 50 millilitri. Centrifuga a 300 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 10 millilitri di PBS.Trasferire 0,5 millilitri della sospensione cellulare in un nuovo tubo come controllo dell'isotipo. Centrifugare sia i tubi di controllo che i tubi sperimentali a 300 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare i supernatanti.Quindi, diluire sia il controllo dell'isotipo di coniugato fluorescente che l'anticorpo in PBS alla concentrazione ottimale titolazione per preparare la soluzione di lavoro. Resuspendare le celle di controllo e sperimentali con ogni soluzione di lavoro e mescolare delicatamente. Incubare i campioni al buio e a temperatura ambiente per 30-40 minuti.Lavare le cellule aggiungendo 10 millilitri di PBS, mescolando delicatamente e centrifugando a 300 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare i supernaganti e rimospendare le cellule con 10 millilitri di PBS. Quindi, posizionare filtri a celle da 40 micrometri su nuovi tubi da 50 millilitri, assicurandosi di preparare una configurazione separata del tubo e del filtro per le celle di controllo e sperimentali.Applicare ogni sospensione cellulare sul rispettivo colino e raccogliere il flusso attraverso. Centrifugare il flusso a 300 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule con da 0,2 a 1,0 millilitri di PBS e trasferire ogni sospensione cellulare in un tubo separato da cinque millilitri per la citometria a flusso.In un armadietto di sicurezza biologico, preparare una piastra di sei pozze per ogni dose di radiazione, incluso il gruppo grigio zero. Aggiungere 1,5 millilitri di supporti 1640 completati ad ogni pozzo. Diluire le cellule raccolte con 1640 supporti completati a una densità cellulare di 1.000 cellule per millilitro.Quindi, aggiungere la sospensione cellulare diluita ai pozzi e scuotere le piastre orizzontalmente per distribuire uniformemente le cellule nei pozzi. Registrare il volume aggiunto in ciascun gruppo di dosi. Cultura a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.Dopo che le celle si sono attaccate alla parte inferiore dei pozzi, aggiungere 1640 supporti completati a ciascun pozzo fino a quando l'altezza del supporto raggiunge un centimetro. Quando le piastre vengono trasferite tra la stanza di coltura cellulare e la stanza di radioterapia, avvolgere le piastre con un foglio di alluminio o metterle in una scatola pulita per evitare la contaminazione. Tenere le piastre piatte per evitare fuoriuscite medie.Successivamente, impostare a 20 centimetri per 20 centimetri campo di radiazione. Posizionare un bolo equivalente tessuto di 1,0 centimetri di spessore sul divano di trattamento e posizionare la piastra a sei pozza sul bolo per tenerli in contatto. Assicurarsi che l'intera piastra si trova all'interno del campo di radiazione.Impostare la distanza sorgente-pelle su 100 centimetri e regolare l'altezza del divano di trattamento per allineare il livello medio della superficie al livello laser. Consegnare la dose assegnata a ciascuna piastra in sequenza. Dopo questo, porta i piatti all'armadietto della biosicurezza nella stanza della coltura cellulare.Sostituire il mezzo in ogni pozzo con due millilitri di mezzo 1640 completato. Cultura a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica, assicurandosi di cambiare il mezzo ogni tre o cinque giorni. Da sette a 10 giorni dopo la radiazione, rimuovere il mezzo e lavare brevemente le cellule con PBS.In una cappa aspirante aggiungere un millilitro di formaldeide al 4% ad ogni pozzo per fissare le cellule per 10 minuti. Quindi, rimuovere la formaldeide e lavare ogni bene due volte usando due millilitri di acqua distillata per ogni lavaggio. Aggiungere un millilitro di 1%Soluzione di macchia viola cristallo ad ogni pozzo e macchiare per 10 minuti.Successivamente, rimuovere la soluzione di macchia viola cristallo e lavare le cellule tre volte con acqua distillata. Rimuovere l'acqua e lasciare asciugare le piastre all'aria per 30 minuti. Conta il numero di colonie con più di 50 cellule.In questo studio, sia alfa due delta uno alto e alfa due delta una bassa A549 cellule sono ordinati. Alcuni marcatori possono mostrare popolazioni distinte e sono facili da recintare. Tuttavia, alcuni marcatori mostrano solo modelli di espressione alti e bassi, piuttosto che popolazioni positive e negative distintive.In questa situazione, un controllo dell'isotipo è molto importante per la gating. L'espressione di alfa due delta uno nelle celle ordinate viene convalidata da qPCR. L'espressione di CACNA2D1, il gene che codifica alfa due delta uno, è più alta in alfa ordinato due delta una cellule alte rispetto ad alfa due delta una low cells.Qui viene mostrata la morfologia tipica delle sfere e l'efficienza della formazione della sfera. Alpha due delta una alta cellule mostrano una maggiore efficienza di formazione della sfera, suggerendo una maggiore capacità di auto-rinnovamento. Qui vengono mostrate immagini tipiche delle colonie e delle curve di sopravvivenza.Una colonia con circa 50 cellule può essere esaminata al microscopio e contrassegnata come riferimento. Viene conteggiato il numero di colonie, quindi è possibile calcolare una frazione di sopravvivenza ad ogni dose e tracciare una curva di sopravvivenza. Alfa due delta una cellule alte sono relativamente resistenti alle radiazioni rispetto ad alfa due delta una bassa cellule.Qualsiasi passo relativo alla coltura cellulare deve essere eseguito nell'armadio di sicurezza biologico o nel banco pulito laminare. Per evitare la contaminazione, si consiglia di aggiungere antibiotici al mezzo di coltura dopo lo smistamento. Quando un marcatore di cellule staminali tumorali putative è preventivamente identificato dal saggio di formazione della sfera, è possibile eseguire un'ulteriore caratterizzazione mediante test di diluizione limitante in vivo per valutare la capacità tumorale.Dallo studio del meccanismo di radioreistenza, i ricercatori possono esaminare la proteina correlata alla riparazione dei danni al DNA, alla clearance delle specie reattive dell'ossigeno e all'arresto del ciclo cellulare in risposta alle radiazioni. Durante la radiazione cellulare, si prega di notare che l'acceleratore lineare può essere azionato solo da tecnici qualificati. Tenere lontano dalle radiazioni.In piedi, si prega di notare che la formaldeide è volatile e pericolosa. Utilizzare formaldeide nella cappa dei fumi.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Un protocollo per Rapid post-mortem delle cellule Cultura della diffusa intrinseca Pontine glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

L'istituzione di un'analisi di colonizzazione del polmone per la visualizzazione di cellule del tumore nei tessuti polmonari di circolazione

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Colorazione elastica su vetrini di tessuto gastrico pT3N0M0 gastrico

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto della polpa e co-coltura con cellule tumorali per studiare le loro interazioni

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Istituzione e caratterizzazione di tre linee cellulari adenocarcinoma polmonare resistente agli Agrassiinib sviluppate con l'aumento delle dosi di Afatinib

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Caratterizzare i mutanti correlati alla malattia di RAF Family Kinases utilizzando una serie di metodi pratici e fattibili

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Stabilimento di modelli Xenograft derivati dal paziente derivato dal paziente e linee cellulari primarie

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Caratterizzazione semiautomatica PD-L1 ed enumerazione delle cellule tumorali circolanti da pazienti affetti da cancro del polmone a cellule non piccole mediante immunofluorescenza

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte umane per la generazione di cellule T specifiche dell'antigene tumorale

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...