Name: radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines
Uploaded: 2019-08-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines at JoVE.com

이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81402535 및 81672969)과 국가 핵심 연구 개발 프로젝트 (2016YFC0904703)에 의해 지원되었습니다.

참고: 단계는 표시된 온도에서 수행됩니다. 온도가 언급되지 않은 단계의 경우 실온(18-25°C)에서 수행합니다. 세포 배양 배지는 4°C에서 보관되어야 하며, 다른 시약은 제조사의 가이드에 따라 보관되어야 한다. 배지는 세포에 첨가되기 전에 37°C로 미리 데워야 한다.
1. 셀 정렬
<ol><li>항체 컨쥬게이션 참고: 배양 시간이 짧음을 고려할 때, 직접 표지된 항체는 세포 선별에 ?...

<ol>
	<li>Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+as+a+predictive+factor+in+radiotherapy.">Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy.</a> Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).</li><li>Baumann, M., Krause, M., Hill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+role+of+cancer+stem+cells+in+radioresistance.">Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance.</a> Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).</li><li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells--perspectives+on+current+status+and+future+directions:+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells.">Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Wang, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+regulation+of+CHK1+and+CHK2+promotes+radioresistance+in+a+stem+cell-like+population+of+nasopharyngeal+carcinoma+cells.">MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells.</a> Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).</li><li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+reactive+oxygen+species+levels+and+radioresistance+in+cancer+stem+cells.">Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).</li><li>Gomez-Casal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-small+cell+lung+cancer+cells+survived+ionizing+radiation+treatment+display+cancer+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+phenotypes.">Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes.</a> Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).</li><li>Mihatsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+radioresistant+tumor+cells+and+presence+of+ALDH1+activity+in+vitro.">Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro.</a> Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).</li><li>Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit+(CACNA2D1)+enhances+radioresistance+in+cancer+stem-like+cells+in+non-small+cell+lung+cancer+cell+lines.">Calcium channel &#945;2&#948;1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines.</a> Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1B50-1,+a+mAb+raised+against+recurrent+tumor+cells,+targets+liver+tumor-initiating+cells+by+binding+to+the+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit.">1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel &#945;2&#948;1 subunit.</a> Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).</li><li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance:+Cancer+stem+cell.">Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell.</a> Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).</li><li>Zhang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+decarboxylase+activity+drives+non-small+cell+lung+cancer+tumor-initiating+cells+and+tumorigenesis.">Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis.</a> Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+self-renewal.">Cancer stem cells and self-renewal.</a> Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).</li><li>Morgan, M. A., Lawrence, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways:+overcoming+radiation+resistance+by+targeting+DNA+damage+response+pathways.">Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways.</a> Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+exploration+of+cancer+stem+cell+marker+voltage-dependent+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit-mediated+chemotherapy+resistance+in+small-cell+lung+cancer.">Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel &#945;2&#948;1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer.</a> Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).</li></ol>

이 프로토콜은 시험관내 암 세포주에서 CSC의 방독증을 연구하는 방법을 설명합니다. 본 연구에서, α2δ1의 발현은 NSCLC 세포주에서 연속적이다. 따라서 게이팅은 이소타입 제어를 기반으로 합니다. 분류하기 전에 α2δ1 발현은 유세포측정에 의해 여러 세포주에서 검사되고 QPCR 또는 웨스턴 블롯에 의해 검증되어야 한다. 유세포측정법에 의해, 형광 현미경하에서 형광을 관찰하거나, 또는 QPCR(선별 ?...

방사선 요법은 암 치료에 중요한 역할을합니다. 그러나, 방사선 저항하는 암 줄기 세포 (CSC)의 존재는 방사선요법 1,2후에 재발 또는 나쁜 결과로 이끌어 낼 수 있습니다. CSC는 자기 재생 능력과 이종성 암세포를 생성하는 능력이특징입니다 3. 보다 효율적인 DNA 손상 수리 능력 또는 자유 래 디 칼 청소 시스템 또는 다른 메커니즘의 상부와장갑, CSC는 방사선 요법에 상대적으로 저항 4,5,6,7 , 8.CSC 마커를 식별하고 메커니즘을 탐구하면 정상적인 조직 손상을 증가시지 않고 내성을 극복 할 수있는 약물 개발을 촉진할 수 있습니다.
전압 게이트 칼슘 채널 α2δ1 소단위 이소폰 5는 NSCLC 세포주 9에서방사성 CSC에 대한 마커로서 보고되었다. α2δ1은 원래 간세포암(HCC)10에대한 CSC 마커로 확인되었다. 동일한 환자에서 원발성 및 재발성 종양으로부터 유래된 HCC 세포주 쌍을 이용한 감산 면역을 사용하여, 1B50-1이라는 항체가 재발성 HCC 세포를 특이하게 표적으로 하는 것으로 확인되었다. 1B50-1-양성 세포는 생체외에서 높은 구체 형성 효율을 나타내고 생체 내에서 높은 종양 발생성을 보였다. 이의 항원들은 질량분석법에 의해, 칼슘 채널 α2δ1 소단위 이소암5로서 확인되었다. α2δ1은 특히 CSC에서 표현되며 대부분의 정상 조직에서 탐지할 수 없기 때문에 CSC10을대상으로 하는 잠재적 후보입니다. α2δ1은 또한 NSCLC 세포주를 위한 CSC 마커로서 작용할 수 있으며, 방사선 9에 반응하여 DNA 손상 복구의 효율을향상시킴으로써 부분적으로 NSCLC 세포에 방사성을 부여하는 것으로 나타났다.
방사능 CSC를 연구하는 것은 방사능 저항을 극복하기 위한 단서를 제공할 수 있습니다. NSCLC에서 α2δ1을 예로 사용하여, CSC의 방과성을 연구하는 주요 방법이 제시된다. 일반적으로 CSC는 가성 표면 마커로 단리되고, 양성 및 음성 세포 집단의 줄기 세포 특성 및 방사능 민감도가 비교된다. 자가 재생을 지원하는 성장 인자로 보충된 무혈청 배지에서구 형성은 시험관 내에서 세포의 줄기를 평가하는 유용한 분석이다. 구체 형성 능력이 높은 세포는 면역결핍 마우스10,11,12에주사시 높은 종양성 성을 보일 가능성이 있다. 콜로니 형성 분석은 세포의 방과성을 평가하기 위해 사용되며, 이는 얼마나 많은 사람들이 방사선13의투여 후 식민지를 형성하는 후손을 생성하는 능력을 잃었는지 결정한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B50-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel &#945;2&#948;1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% formaldehyde solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12500062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer/cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSARIA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1975</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_1511</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightning-Link Fluorescein Kit</td>
			<td>Innova Biosciences</td>
			<td>310-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linear accelerator</td>
			<td>VARIAN</td>
			<td>CLINAC 600C/D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBRGREEN</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>QPK-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Violet crystal staining solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines

암 줄기 세포의 존재 (CSCs) 방사선 요법 후 재발 또는 가난한 결과와 관련 된. 방사능 CSC를 연구하는 것은 방사능 저항을 극복하기 위한 단서를 제공할 수 있습니다. 전압 게이트 칼슘 채널 α2δ1 소단위 이소폰 5는 비소세포 폐암(NSCLC) 세포주에서 내성 CSC에 대한 마커로서 보고되었다. CSC 마커의 예로 칼슘 채널 α2δ1 소부를 사용하여, NSCLC 세포주에서 CSC의 방과성성을 연구하는 방법이 제시된다. CSC는 유세포측정에 의해 가설 마커로 분류되고, 정렬된 세포의 자기 갱신 능력은 구형 분석에 의해 평가된다. 얼마나 많은 세포가 방사선의 특정 복용량 후에 식민지를 형성하는 자손을 생성하는 능력을 분실하는지 결정하는 식민지 형성 분석, 그 후에 분류된 세포의 방과민성을 평가하기 위하여 능력을 발휘합니다. 이 원고는 CSC의 방과성 연구를 위한 초기 단계를 제공하며, 이는 기본 메커니즘에 대한 추가 이해를 위한 기초를 확립합니다.

α2δ1-고 및 α2δ1-로우 A549 세포를분류하였다(도 1A). 일부 마커는 뚜렷한 모집단을 표시할 수 있으며 게이트하기가 쉽습니다. 그러나 일부 마커는 뚜렷한 긍정 및 음수 채우기보다는 높고 낮은 식 패턴을 표시합니다. 이 상황에서, 이소형 제어는 게이팅에 매우 중요합니다. 정렬된 셀에서 α2δ1의 발현은 qPCR에 의해 검증된다. Α2δ1을 인코딩하는 유전자인 CACNA2D1의발현은...

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Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

암 줄기 세포의 존재는 방사선 요법 후에 재발 또는 나쁜 결과와 연관되었습니다. 이 원고는 폐암 세포주에서 암 줄기 세포의 방과성을 연구하는 방법을 설명합니다.

폐암 세포줄에 있는 암 줄기 세포의 방과성

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

이 프로토콜은 암 줄기 세포의 존재가 방사선 요법 후에 재발 또는 나쁜 결과와 연관될 수 있기 때문에 중요합니다. 방사능 줄기 세포를 연구하는 것은 방사능을 극복하기 위하여 단서를 제공할 수 있습니다. 이 기술에서, 암 줄기세포는 혈중 세포측정에 의한 putative 마커로 소금화되고 소금에 절인 세포의 자기 재생 능력은 구형성 분석에 의해 평가된다.식민지 형성 분석은 소금에 절인 세포의 방사선 민감성을 평가하기 위해 수행됩니다. 그것은 얼마나 많은 세포 방사선의 특정 복용량 후 식민지를 형성 하는 합성을 생성 하는 그들의 능력을 잃었 결정. 이 원고는 암 줄기 세포의 방사선 반응성 연구를위한 초기 몇 가지 단계를 제공하며, 이는 완전한 메커니즘 연구의 기초를 확립합니다.메커니즘 연구는 DNA 손상 수리, 반응성 산소 종의 정리, 세포 주기 체포 등과 관련된 단백질을 포함 할 수 있습니다. 그것은 암 줄기 세포가 방사능을 얻는 방법과 저항을 극복하는 방법에 중요한 통찰력을 제공할 것입니다. 방사선 절차를 시연하는 것은 우리 부서의 방사선 기술자 인 첸난 리 (Chen-Nan Li)가 될 것입니다.이 절차를 시작하기 위해 RPMI-1640 배지의 배양 A549 세포는 섭씨 37도에서 10센티미터 요리에 10%의 FBS로 보충되었으며 이산화탄소는 5%입니다. 세포가 80 ~ 90%에 도달하면 배양 배지를 제거합니다. PBS의 3 밀리리터로 세포를 간략하게 씻으시면 됩니다.다음으로 각 요리에 0.05%의 트립신 3밀리리터를 추가합니다. 트립신을 제거하고 1 ~ 3 분 동안 섭씨 37도에서 세포를 소화하기 위해 거주 트립신을 둡니다. 과다 소화를 피하기 위해 세포의 분리를 자주 확인하십시오.세포가 느슨해지고 접시에서 분리되기 시작하면 10 %의 FBS로 보충 된 RPMI-1640 배지 3 밀리리터를 추가하고 세포 현탁액을 50 밀리리터 튜브로 옮긴다. 원심 분리기는 300배, 섭씨 4도에서 5분간. 상체를 버리고 PBS의 10 밀리리터에서 세포를 다시 중단하십시오.세포 현탁액의 0.5 밀리리터를 새로운 튜브로 이관형 대조군으로 옮기다. 원심분리기는 대조군과 실험용 튜브를 300배, 섭씨 4도에서 5분간 분리합니다. 초월체를 폐기합니다.이어서, PBS에서 형광 디콘주게이트이있는 동형 조절 및 항체를 모두 희석하여 작업 용액을 준비하기 위해 적정 농도를 정성화한다. 각 작업 용액으로 제어 및 실험 셀을 다시 중단하고 부드럽게 섞습니다. 어두운 시료와 실온에서 30~40분 동안 시료를 배양합니다.PBS의 10 밀리리터를 추가하고 부드럽게 혼합하고 300 배 g와 섭씨 4도에서 5 분 동안 원심분리를 추가하여 세포를 씻으십시오. 슈퍼네이터를 버리고 PBS의 10 밀리리터로 세포를 다시 중단합니다. 다음으로, 새로운 50 밀리리터 튜브에 40 마이크로미터 세포 스트레이너를 배치하여 제어 및 실험 용 세포를 위한 별도의 튜브 및 스트레이너 설정을 준비하십시오.각 셀 서스펜션을 각 스트레이너에 적용하고 흐름을 수집합니다. 원심 분리는 300 배 g와 섭씨 4도에서 5 분 동안 흐르는 흐름을 전달합니다. 상체를 버리고 PBS의 0.2 ~ 1.0 밀리리터로 세포를 다시 중단하고 각 세포 현탁액을 별도의 5 밀리리터 튜브로 이송하여 유동 세포 측정을 합니다.생물학적 안전 캐비닛에서, 제로 그레이 그룹을 포함하여 각 방사선 량에 대해 하나의 6 개의 우물 플레이트를 준비합니다. 각 웰에 1640개의 용지를 완성한 1.5밀리리터를 추가합니다. 1640개의 세포 밀도로 수확된 세포를 밀리리터당 1, 000세포의 세포 밀도로 희석시켰다.그런 다음 희석된 세포 현탁액을 우물에 넣고 플레이트를 수평으로 흔들어 우물에 세포를 균등하게 분배합니다. 각 투여량 그룹에 추가된 볼륨을 기록합니다. 이산화탄소 5%를 가진 섭씨 37도의 배양.세포가 우물 바닥에 부착된 후 미디어 높이가 1센티미터에 도달할 때까지 각 웰에 완료된 1640개의 미디어를 추가합니다. 플레이트가 세포 배양실과 방사선 요법실 간에 전달되면 접시를 알루미늄 호일로 감싸거나 오염을 피하기 위해 깨끗한 상자에 넣습니다. 중간 크기유출을 피하기 위해 접시를 평평하게 유지합니다.다음으로, 20센티미터 방사선 장에 의해 20 센티미터로 설정합니다. 치료 소파에 1.0 센티미터 두께의 조직 동등한 볼러스를 놓고 접촉하도록 볼루스에 6 개의 우물 판을 놓습니다. 전체 플레이트가 방사선 장 내에 있는지 확인합니다.소스-피부 거리를 100cm로 설정하고 처리 소파의 높이를 조정하여 중간 표면 레벨을 레이저 레벨에 정렬합니다. 각 플레이트에 배정된 용량을 순서대로 전달합니다. 그 후, 세포 배양실의 생물안전 캐비닛에 판을 가져 가라.매1640 배지의 2밀리리터로 매질의 배지를 교체한다. 이산화탄소 5%를 가진 섭씨 37도의 문화는 3~5일마다 매체를 변경합니다. 방사선 후 7~10일 후에 는 배지를 제거하고 PBS로 세포를 간단히 씻어낸다.연기 후드에, 10 분 동안 세포를 해결하기 위해 각 우물에 4 %의 포름알데히드의 1 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 포름알데히드를 제거하고 각 세척에 대해 증류수 2 밀리리터를 사용하여 두 번 잘 씻습니다. 1밀리리터1%의 크리스탈 바이올렛 얼룩 액액을 각 웰에 넣고 10분 동안 염색합니다.그 후, 크리스탈 바이올렛 얼룩 용액을 제거하고 증류수로 세포를 세 번 씻는다. 물을 제거하고 접시가 30 분 동안 건조하게하십시오. 50개 이상의 세포를 가진 식민지수를 계산합니다.이 연구에서는 알파 2 델타 1개의 높은 및 알파 2 델타 1개의 낮은 A549 세포가 정렬됩니다. 일부 마커는 뚜렷한 인구를 표시할 수 있으며 게이트가 용이합니다. 그러나 일부 마커는 특유의 긍정 및 음수 집단이 아닌 높고 낮은 식 패턴을 보여줍니다.이 경우, 등류형 컨트롤은 게이팅에 매우 중요합니다. 정렬된 셀에서 알파 2 델타 1의 발현은 qPCR에 의해 검증됩니다. 알파 2 델타 1을 인코딩하는 유전자인 CACNA2D1의 발현은 분류된 알파 2델타 1개의 고세포에서 알파 2델타 1개의 낮은 세포와 비교하여 더 높다.구체의 전형적인 형태와 구 형성 효율이 여기에 나와 있다. 알파 2 델타 하나의 높은 셀은 더 높은 자기 재생 용량을 제안, 더 높은 구 형성 효율을 보여줍니다. 식민지와 생존 곡선의 전형적인 이미지는 여기에 표시됩니다.약 50개의 세포를 가진 식민지는 현미경의 밑에 검사되고 참조로 표시될 수 있습니다. 식민지의 수는 계산되고, 각 복용량에서 생존 분수를 계산하고 생존 곡선을 플롯할 수 있습니다. 알파 2 델타 1 개의 높은 세포는 알파 2 델타 1 개의 낮은 세포에 비해 방사선에 상대적으로 저항한다.세포 배양과 관련된 모든 단계는 생물학적 안전 캐비닛 또는 라미나르 클린 벤치에서 수행되어야 합니다. 오염을 피하기 위해 분류 후 배양 배지에 항생제를 추가하는 것이 좋습니다. putative cancer 줄기 세포 마커가 구형성 분석에 의해 예습적으로 확인되면, 생체 내에서 희석 분석법을 제한하는 추가 특성화는 종양 성 용량을 평가하기 위해 수행될 수 있다.방사능 의 메커니즘 연구에서, 연구원은 DNA 손상 복구와 관련된 단백질을 검사 할 수 있습니다, 반응성 산소 종의 통관, 방사선에 대한 응답으로 세포 주기 체포. 세포 방사선 동안, 선형 가속기는 자격을 갖춘 기술자에 의해서만 작동할 수 있다는 점에 유의하십시오. 방사선을 멀리하십시오.서 있는 동안 포름알데히드는 휘발성이 높고 위험합니다. 연기 후드에 포름알데히드를 사용하십시오.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

확산 내장 뇌교 신경 교종의 신속한 사후 세포 배양을위한 프로토콜 (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

연구

암 연구학

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

pT3N0M0 위암 조직의 파라핀 내장 슬라이드에 탄성 염색

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

펄프 조직 문화와 공동 암 세포와 그들의 상호 작용을 공부 하에서 중간 엽 줄기 세포 분리

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

아파티닙 내성 폐 선암 종 PC-9 세포주 의 설립 및 특성은 아파티닙의 증가 복용량으로 개발

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

실용적이고 실행 가능한 방법 세트를 사용하여 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이 특성화

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...