Name: radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines
Uploaded: 2019-08-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (81402535 og 81672969) og nasjonal nøkkel forskning og utviklingsprosjekt (2016YFC0904703).

Merk: trinnene utføres under angitt temperatur. For trinn der temperaturen ikke er nevnt, Utfør under romtemperatur (18 – 25 ° c). Cellekultur medium skal oppbevares ved 4 ° c, og andre reagenser skal oppbevares i henhold til produsentens guider. Medium bør være forvarmet til 37 ° c før den legges til celler.
1. celle sortering
<ol><li>Antistoff Bøyning Merk: Når du tar i betraktning den kortere inkubasjonstiden, foretrekkes antistoff med direkte merket for celle sortering. Hv...

<ol>
	<li>Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+as+a+predictive+factor+in+radiotherapy.">Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy.</a> Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).</li><li>Baumann, M., Krause, M., Hill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+role+of+cancer+stem+cells+in+radioresistance.">Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance.</a> Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).</li><li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells--perspectives+on+current+status+and+future+directions:+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells.">Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Wang, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+regulation+of+CHK1+and+CHK2+promotes+radioresistance+in+a+stem+cell-like+population+of+nasopharyngeal+carcinoma+cells.">MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells.</a> Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).</li><li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+reactive+oxygen+species+levels+and+radioresistance+in+cancer+stem+cells.">Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).</li><li>Gomez-Casal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-small+cell+lung+cancer+cells+survived+ionizing+radiation+treatment+display+cancer+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+phenotypes.">Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes.</a> Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).</li><li>Mihatsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+radioresistant+tumor+cells+and+presence+of+ALDH1+activity+in+vitro.">Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro.</a> Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).</li><li>Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit+(CACNA2D1)+enhances+radioresistance+in+cancer+stem-like+cells+in+non-small+cell+lung+cancer+cell+lines.">Calcium channel &#945;2&#948;1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines.</a> Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1B50-1,+a+mAb+raised+against+recurrent+tumor+cells,+targets+liver+tumor-initiating+cells+by+binding+to+the+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit.">1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel &#945;2&#948;1 subunit.</a> Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).</li><li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance:+Cancer+stem+cell.">Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell.</a> Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).</li><li>Zhang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+decarboxylase+activity+drives+non-small+cell+lung+cancer+tumor-initiating+cells+and+tumorigenesis.">Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis.</a> Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+self-renewal.">Cancer stem cells and self-renewal.</a> Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).</li><li>Morgan, M. A., Lawrence, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways:+overcoming+radiation+resistance+by+targeting+DNA+damage+response+pathways.">Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways.</a> Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+exploration+of+cancer+stem+cell+marker+voltage-dependent+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit-mediated+chemotherapy+resistance+in+small-cell+lung+cancer.">Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel &#945;2&#948;1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer.</a> Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).</li></ol>

Denne protokollen beskriver metoder for å studere radiosensitivity av CSCs i kreftcelle linjer in vitro. I denne studien er uttrykket for α2δ1 kontinuerlig i NSCLC cellelinjer. Derfor er gating basert på en isotype kontroll. Før sortering bør α2δ1-uttrykk undersøkes i flere cellelinjer ved å flyte flowcytometri og godkjennes av QPCR eller Western Blot. Det anbefales å re-analysere α2δ1 uttrykk for de sorterte α2δ1-High og α2δ1-Low celler ved flyt flowcytometri, ved å observere fluorescens under et fluor...

Strålebehandling spiller en viktig rolle i kreft behandling. Eksistensen av radioresistant kreft stamceller (CSCs) kan imidlertid føre til tilbakefall eller dårlige utfall etter strålebehandling1,2. CSCs er preget av deres selv-fornyelse kapasitet og evne til å generere heterogene kreftceller3. Pansrede med en mer effektiv DNA skade reparasjon kapasitet eller høyere nivåer av frie radikaler rensing systemer eller andre mekanismer, CSCs er relativt motstandsdyktig mot strålebehandling4,5,6,7 , 8. identifisering CSC markører og utforske sine mekanismer vil lette utviklingen av legemidler som vil overvinne radioresistance uten å øke normal vevsskade.
Spennings-gated kalsium kanal α2δ1 delenhet isoformen 5 har blitt rapportert som en markør for radioresistant CSCs i NSCLC cellelinjer9. α2δ1 ble opprinnelig identifisert som en CSC markør for leverkreft (HCC)10. Ved hjelp av subtraktiv immunisering med et par HCC cellelinjer avledet fra den primære og tilbakevendende svulster i samme pasient, et antistoff som heter 1B50-1 ble identifisert å målrette tilbakevendende HCC celler spesielt. 1B50-1-positive celler viste høy sfære dannelse effektivitet in vitro og høy tumorgenisitet hos in vivo. Dens antigen ble identifisert ved masse massespektrometri, som kalsium kanal α2δ1 delenhet isoformen 5. α2δ1 spesielt uttrykker i CSCs og er undetectable i de fleste normale vev, noe som gjør det til en potensiell kandidat for målretting CSCs10. α2δ1 kan også tjene som en CSC markør for NSCLC cellelinjer, og det har vist seg å formidle radioresistance til NSCLC celler delvis ved å øke effektiviteten av DNA skade reparasjon som svar på stråling9.
Studere radioresistant CSCs kan gi ledetråder til å overvinne radioresistance. Bruke α2δ1 i NSCLC som et eksempel, viktige metoder for å studere radiosensitivity av CSCs presenteres. Vanligvis er CSCs isolert med en antatte overflate markør, og Stamcelle egenskapene og radiosensitivity til de positive og negative celle populasjoner sammenlignes. Sphere formasjon i et serum fritt medium supplert med vekstfaktorer som støtter selv-fornyelse er en nyttig analysen for å evaluere stemness av celler in vitro. Celler med høy sfære formasjon kapasitet vil trolig vise høy tumorgenisitet hos når injisert i immunodeficient mus10,11,12. Koloni formasjon analysen blir deretter brukt til å vurdere radiosensitivity av celler, som bestemmer hvor mange har mistet evnen til å generere etterkommere danner kolonien etter en dose av stråling13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B50-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel &#945;2&#948;1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% formaldehyde solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12500062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer/cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSARIA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1975</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_1511</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightning-Link Fluorescein Kit</td>
			<td>Innova Biosciences</td>
			<td>310-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linear accelerator</td>
			<td>VARIAN</td>
			<td>CLINAC 600C/D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBRGREEN</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>QPK-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Violet crystal staining solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines

Tilstedeværelsen av kreft stamceller (CSCs) har vært forbundet med tilbakefall eller dårlige utfall etter strålebehandling. Studere radioresistant CSCs kan gi ledetråder til å overvinne radioresistance. Spennings-gated kalsium kanal α2δ1 delenhet isoformen 5 har blitt rapportert som en markør for radioresistant CSCs i ikke-liten celle lungekreft (NSCLC) cellelinjer. Bruke kalsium kanal α2δ1 delenhet som et eksempel på en CSC markør, metoder for å studere radiosensitivity av CSCs i NSCLC cellelinjer presenteres. CSCs er sortert med antatte markører ved flyt flowcytometri, og selv-fornyelse kapasitet på sorterte celler er evaluert av sfære formasjon analysen. Colony formasjon analysen, som bestemmer hvor mange celler mister evnen til å generere etterkommere danner kolonien etter en viss dose av stråling, blir deretter utført for å vurdere radiosensitivity av sorterte celler. Dette manuskriptet gir første skritt for å studere radiosensitivity av CSCs, som etablerer grunnlaget for ytterligere forståelse av de underliggende mekanismene.

α2δ1-høy og α2δ1-Low A549 celler ble sortert (figur 1a). Noen markører kan vise distinkte populasjoner og er lett å gate. Noen markører viser imidlertid bare høye og lave uttrykks mønstre, i stedet for distinkte positive og negative populasjoner. I denne situasjonen er en isotype kontroll svært viktig for gating. Uttrykket for α2δ1 i sorterte celler valideres av qPCR. Uttrykket av CACNA2D1, genet som koder α2δ1, er høyere i sorterte α2δ1-høy celler sammenlignet me...

Watch this Scientific Journal Video about Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines at JoVE.com

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Tilstedeværelsen av kreft stamceller har blitt assosiert med tilbakefall eller dårlige utfall etter strålebehandling. Dette manuskriptet beskriver metodene for å studere radiosensitivity av kreft stamceller i lungekreft cellelinjer.

Radiosensitivity av kreft stamceller i lungekreft cellelinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Denne protokollen er betydelig fordi tilstedeværelsen av kreft stamceller kan være forbundet med tilbakefall eller et dårlig resultat etter strålebehandling. Å studere de radioresisterende stamcellene kan gi ledetråder for å overvinne radioresistens. I denne teknikken saltes kreftstamceller med antatte markører ved strømningscytometri, og selvfornyelseskapasiteten til saltede celler evalueres av sfæreformasjonsanalyse.Koloniformasjonsanalysen utføres for å vurdere radiofølsomheten til saltede celler. Det bestemmer hvor mange celler mistet sin evne til å generere syntesen som danner kolonien etter en viss dose stråling. Dette manuskriptet gir de første trinnene for radiosensitivitetsstudien av kreftstamceller, som etablerer grunnlaget for fyldigere mekanismestudie.Mekanisme studie kan innebære proteiner knyttet til DNA skade reparasjon, clearance av reaktive oksygenarter, celle syklus arrest, etc. Det vil gi viktig innsikt i hvordan kreft stamceller får radioresistens og hvordan å overvinne motstanden. Å demonstrere strålingsprosedyren vil være Chen-Nan Li, en strålingstekniker fra vår avdeling.For å begynne denne prosedyren, kultur A549 celler i RPMI-1640 medium supplert med 10% FBS i 10 centimeter retter ved 37 grader Celsius, med 5% karbondioksid. Når cellene når 80 til 90% samløpet, fjern kulturmediet. Vask cellene kort med tre milliliter PBS.Deretter legger du til tre milliliter med 0,05% trypsin til hver tallerken. Fjern trypsin og la rester trypsin for å fordøye cellene ved 37 grader Celsius i ett til tre minutter. Kontroller løsrivelse av cellene ofte for å unngå overbesværelse.Når cellene løsner og begynner å løsne fra oppvasken, legg til tre milliliter RPMI-1640 medium supplert med 10% FBS og overføre cellene suspensjon til en 50 milliliter tube. Sentrifuge på 300 ganger g og ved fire grader Celsius i fem minutter. Kast de overnaturlige og gjenoppusse cellene i 10 milliliter PBS.Overfør 0,5 milliliter av cellefjæringen til et nytt rør som isotypekontroll. Sentrifuge både kontroll og eksperimentelle rør på 300 ganger g og fire grader Celsius i fem minutter. Kast supernativa.Deretter fortynner du både den fluorescerende dikonjugerte isotypekontrollen og antistoffet i PBS til den optimale konsentrasjonen titrert for å klargjøre arbeidsløsningen. Resuspend kontroll og eksperimentelle celler med hver arbeidsløsning og bland forsiktig. Inkuber prøvene i mørket og ved romtemperatur i 30 til 40 minutter.Vask cellene ved å legge til 10 milliliter PBS, bland forsiktig og sentrifugering ved 300 ganger g og ved fire grader Celsius i fem minutter. Kast supernativa og resuspend cellene med 10 milliliter PBS. Deretter plasserer du 40 mikrometercellesiler på nye 50 milliliter rør, og sørg for å forberede et separat rør- og siloppsett for kontroll- og eksperimentelle celler.Påfør hver celle suspensjon på den respektive silen og samle gjennomstrømningen. Sentrifuger gjennomstrømningen på 300 ganger g og ved fire grader Celsius i fem minutter. Kast de overnaturlige og gjenoppuss cellene med 0,2 til 1,0 milliliter PBS og overfør hver cellesuspensjon til et separat fem milliliter rør for strømningscytometri.I et biologisk sikkerhetsskap, forberede en seks brønnplate for hver strålingsdose, inkludert null grå gruppe. Tilsett 1,5 milliliter fullført 1640 medier til hver brønn. Fortynn høstede celler med fullført 1640 media til en celletetthet på 1000 celler per milliliter.Deretter legger du til den fortynnede cellesuspensjonen til brønnene og rister platene horisontalt for å fordele cellene jevnt i brønnene. Registrer volumet som er lagt til i hver dosegruppe. Kultur ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid.Etter at cellene har festet til bunnen av brønnene, legg til fullførte 1640 medier til hver brønn til mediehøyden når en centimeter. Når platene overføres mellom cellekulturrommet og strålebehandlingsrommet, pakk platene med aluminiumsfolie eller legg dem i en ren boks for å unngå forurensning. Hold platene flate for å unngå at middels søler ut.Deretter satt til 20 centimeter med 20 centimeter strålingsfelt. Plasser en vevsekvivalent bolus på 1,0 centimeter tykkelse på behandlingssofaen og legg de seks brønnplatene på bolusen for å holde dem i kontakt. Kontroller at hele platen er innenfor strålingsfeltet.Still inn kilde-hudavstanden som 100 centimeter og juster høyden på behandlingssofaen for å justere middels overflatenivå til lasernivået. Lever den tildelte dosen til hver plate i rekkefølge. Etter dette tar du platene til biosikkerhetsskapet i cellekulturrommet.Erstatt mediet i hver brønn med to milliliter fullført 1640 medium. Kultur ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid, og sørg for å endre mediet hver tredje til fem dager. Syv til 10 dager etter stråling, fjern mediet og vask cellene kort med PBS.I en røykhette legger du til en milliliter med 4% formaldehyd til hver brønn for å fikse cellene i 10 minutter. Deretter fjerner du formaldehyd og vasker hver brønn to ganger ved hjelp av to milliliter destillert vann for hver vask. Tilsett en milliliter 1% krystallfiolett flekkløsning til hver brønn og flekk i 10 minutter.Etter dette fjerner du krystallfiolett flekkløsning og vasker cellene tre ganger med destillert vann. Fjern vannet og la platene lufttørke i 30 minutter. Telle antall kolonier med mer enn 50 celler.I denne studien sorteres både alfa to delta en høy og alfa to delta en lav A549 celler. Noen markører kan vise distinkte populasjoner og er enkle å gate. Noen markører viser imidlertid bare høye og lave uttrykksmønstre, i stedet for særegne positive og negative populasjoner.I dette tilfellet er en isotypekontroll svært viktig for gating. Uttrykket for alfa to delta en i sorterte celler er validert av qPCR. Uttrykket av CACNA2D1, genet som koder alfa to delta en, er høyere i sortert alfa to delta en høye celler sammenlignet med alfa to delta en lav celler.Typisk morfologi av kuler og sfæreformasjonseffektivitet er vist her. Alfa to delta en høye celler viser høyere sfære formasjon effektivitet, noe som tyder på en høyere selvfornyelse kapasitet. Typiske bilder av kolonier og overlevelseskurver vises her.En koloni med ca 50 celler kan undersøkes under et mikroskop og merkes som en referanse. Antall kolonier telles, så kan en overlevelsesfraksjon ved hver dose beregnes og en overlevelseskurve kan plottes. Alfa to delta en høye celler er relativt motstandsdyktig mot stråling sammenlignet med alfa to delta en lav celler.Eventuelle tiltak knyttet til cellekultur bør utføres i det biologiske sikkerhetsskapet eller laminær ren benk. For å unngå forurensning anbefales det å legge antibiotika til kulturmediet etter sortering. Når en antatt kreftstamcellemarkør er foreløpig identifisert av sfæreformasjonsanalysen, kan ytterligere karakterisering ved in vivo begrensende fortynningsanalyse utføres for å evaluere tumorogen kapasitet.Fra mekanismen studie av radioresistens, forskere kan undersøke protein knyttet til DNA skade reparasjon, clearance av reaktive oksygenarter, og celle syklus arrest som svar på stråling. Under cellestråling må du være oppmerksom på at den lineære akseleratoren bare kan betjenes av kvalifiserte teknikere. Holdes vekk fra stråling.Mens du står, vær oppmerksom på at formaldehyd er flyktig og farlig. Bruk formaldehyd i røykhetten.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokoll for Rapid Post mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Etablering av en lunge kolonisering analysen for sirkulerende svulst celle effekt i lunge vev

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastisk farging på parafin-embedded lysbilder av pT3N0M0 magekreft vev

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymal stamceller isolert fra cellulose vev og co kultur kreftceller å studere deres samhandling

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Etablering og karakterisering av tre Afatinib-resistente Lung Adenokarsinom PC-9 Cell Lines utviklet med økende doser av Afatinib

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow analytiske analyse av mitokondrie reaktive oksygen arter i murine blodkreft stem og stamceller og MLL-AF9 drevet leukemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Karakterisere sykdom-relaterte mutanter av RAF familie kinaser ved hjelp av et sett av praktiske og gjennomførbare metoder

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering av magekreft pasient-avledet Xenograft modeller og primær celle Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering og opplisting av sirkulerende tumor celler fra ikke-liten celle Lungekreftpasienter ved Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Bruke Human indusert Pluripotent stamceller for generering av tumor antigen-spesifikke T celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...