Name: radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines
Uploaded: 2019-08-21T14:30:00
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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (81402535 e 81672969) e pelo projeto de pesquisa e desenvolvimento chave nacional (2016YFC0904703).

Nota: as etapas são executadas a temperatura indicada. Para as etapas em que a temperatura não é mencionada, execute a temperatura ambiente (18 – 25 ° c). O meio de cultura celular deve ser armazenado a 4 ° c, e outros reagentes devem ser armazenados de acordo com as guias do fabricante. O meio deve ser pré-aquecido a 37 ° c antes de ser adicionado às células.
1. classificação de células
<ol><li>Conjugação de anticorpos Nota: Considerando o tempo mais curto da incubação,...

<ol>
	<li>Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+as+a+predictive+factor+in+radiotherapy.">Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy.</a> Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).</li><li>Baumann, M., Krause, M., Hill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+role+of+cancer+stem+cells+in+radioresistance.">Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance.</a> Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).</li><li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells--perspectives+on+current+status+and+future+directions:+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells.">Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Wang, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+regulation+of+CHK1+and+CHK2+promotes+radioresistance+in+a+stem+cell-like+population+of+nasopharyngeal+carcinoma+cells.">MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells.</a> Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).</li><li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+reactive+oxygen+species+levels+and+radioresistance+in+cancer+stem+cells.">Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).</li><li>Gomez-Casal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-small+cell+lung+cancer+cells+survived+ionizing+radiation+treatment+display+cancer+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+phenotypes.">Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes.</a> Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).</li><li>Mihatsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+radioresistant+tumor+cells+and+presence+of+ALDH1+activity+in+vitro.">Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro.</a> Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).</li><li>Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit+(CACNA2D1)+enhances+radioresistance+in+cancer+stem-like+cells+in+non-small+cell+lung+cancer+cell+lines.">Calcium channel &#945;2&#948;1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines.</a> Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1B50-1,+a+mAb+raised+against+recurrent+tumor+cells,+targets+liver+tumor-initiating+cells+by+binding+to+the+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit.">1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel &#945;2&#948;1 subunit.</a> Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).</li><li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance:+Cancer+stem+cell.">Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell.</a> Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).</li><li>Zhang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+decarboxylase+activity+drives+non-small+cell+lung+cancer+tumor-initiating+cells+and+tumorigenesis.">Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis.</a> Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+self-renewal.">Cancer stem cells and self-renewal.</a> Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).</li><li>Morgan, M. A., Lawrence, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways:+overcoming+radiation+resistance+by+targeting+DNA+damage+response+pathways.">Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways.</a> Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+exploration+of+cancer+stem+cell+marker+voltage-dependent+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit-mediated+chemotherapy+resistance+in+small-cell+lung+cancer.">Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel &#945;2&#948;1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer.</a> Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).</li></ol>

Este protocolo descreve métodos para estudar a radiosensibilidade de CSCs em linhas de células cancerosas in vitro. Neste estudo, a expressão de α2δ1 é contínua em linhagens de células NSCLC. Portanto, a gating é baseada em um controle isotipo. Antes da triagem, a expressão de α2δ1 deve ser examinada em várias linhas celulares por citometria de fluxo e validada por QPCR ou Western Blot. Recomenda-se a reanálise da expressão α2δ1 das células α2δ1-High e α2δ1-Low classificadas por citometria de fluxo,...

A radioterapia desempenha um papel importante no tratamento do câncer. No entanto, a existência de células-tronco de câncer radioresistente (CSCS) pode levar a recidiva ou a desfechos ruins após a radioterapia1,2. As CSCs são caracterizadas por sua capacidade de autorenovação e capacidade de gerar células cancerosas heterogéneas3. Blindado com uma capacidade de reparo de dano de DNA mais eficiente ou níveis mais altos de sistemas de eliminação de radicais livres ou outros mecanismos, CSCS são relativamente resistentes à radioterapia4,5,6,7 , 8. identificar os marcadores CSC e explorar seus mecanismos facilitará o desenvolvimento de fármacos que superarão a radiorresistência sem aumentar o dano tecidual normal.
O canal de cálcio tensão-fechado α2δ1 o isoforma 5 da subunidade foi relatado como um marcador para CSCs radioresistant em linhas de pilha de NSCLC9. α2δ1 foi originalmente identificado como um marcador CSC para carcinoma hepatocelular (HCC)10. Usando a imunização subtrativas com um par de linhas de pilha de HCC derivadas dos tumores preliminares e periódicos no mesmo paciente, um anticorpo nomeado 1b50-1 foi identificado para alvejar pilhas periódicas do HCC especificamente. as pilhas 1b50-1-positive mostraram a eficiência elevada da formação da esfera in vitro e o tumorigenicidade elevado in vivo. Seu antígeno foi identificado por espectrometria de massas, como canal de cálcio α2δ1 subunidade isoforma 5. α2δ1 expressa especificamente em CSCs e é indetectável em a maioria de tecidos normais, fazendo lhe um candidato potencial para alvejar CSCs10. α2δ1 pode igualmente servir como um marcador do CSC para linhas de pilha de NSCLC, e foi mostrado para transmitir radioresistance às pilhas de NSCLC parcialmente realçando a eficiência do reparo dos danos do ADN em resposta à radiação9.
Estudar CSCs radioresistant pode fornecer indícios a superar o radioresistance. Usando α2δ1 no NSCLC como um exemplo, os métodos principais para estudar a radiosensibilidade de CSCs são apresentados. Geralmente, CSCS são isolados com um marcador de superfície putativo, e as características da pilha de haste e a radiosensibilidade das populações positivas e negativas da pilha são comparadas. A formação da esfera em um meio soro-livre suplementado com os fatores de crescimento que apoiam a Self-renovação é um ensaio útil para avaliar o células das pilhas in vitro. Células com alta capacidade de formação de esfera são susceptíveis de apresentar tumorigenicidade elevada quando injetadas em camundongos imunodeficientes10,11,12. O ensaio de formação de colônias é então usado para avaliar a radiosensibilidade das células, o que determina quantos perderam a capacidade de gerar descendentes formando a colônia após uma dose de radiação13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B50-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel &#945;2&#948;1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% formaldehyde solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12500062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer/cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSARIA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1975</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_1511</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightning-Link Fluorescein Kit</td>
			<td>Innova Biosciences</td>
			<td>310-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linear accelerator</td>
			<td>VARIAN</td>
			<td>CLINAC 600C/D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBRGREEN</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>QPK-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Violet crystal staining solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines

A presença de células-tronco cancerosas (CSCs) tem sido associada à recidiva ou a desfechos ruins após a radioterapia. Estudar CSCs radioresistant pode fornecer indícios a superar o radioresistance. O canal de cálcio tensão-fechado α2δ1 o isoforma 5 da subunidade foi relatado como um marcador para CSCs radioresistant em linhas de pilha do cancro do pulmão da não-pequena pilha (NSCLC). Usando o canal de cálcio α2δ1 subunidade como um exemplo de um marcador do CSC, os métodos para estudar a radiosensibilidade de CSCs em linhas de pilha de NSCLC são apresentados. Os CSCs são classificados com marcadores putativos por citometria de fluxo, e a capacidade de autorenovação das células classificadas é avaliada pelo ensaio de formação da esfera. O ensaio de formação de colônias, que determina quantas células perdem a capacidade de gerar descendentes formando a colônia após uma certa dose de radiação, é então realizada para avaliar a radiosensibilidade das células classificadas. Este manuscrito fornece os passos iniciais para o estudo da radiosensibilidade das CSCs, que estabelece a base para uma maior compreensão dos mecanismos subjacentes.

α2δ1-alta e α2δ1-baixa A549 células foram classificadas (Figura 1a). Alguns marcadores podem mostrar populações distintas e são fáceis de portão. No entanto, alguns marcadores apenas mostram padrões de expressão alta e baixa, em vez de populações distintas positivas e negativas. Nessa situação, um controle de isotipo é muito importante para gating. A expressão de α2δ1 em células classificadas é validada pelo qPCR. A expressão de CACNA2D1, o gene que codifica ?...

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Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

A presença de células-tronco cancerosas tem sido associada com recidiva ou desfechos ruins após a radioterapia. Este manuscrito descreve os métodos para estudar a radiosensibilidade de células-tronco cancerosas em linhagens celulares de câncer de pulmão.

Radiosensibilidade de células-tronco cancerosas em linhas celulares de câncer de pulmão

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Este protocolo é significativo porque a presença de células-tronco cancerígenas pode estar associada a recaídas ou um desfecho ruim após a radioterapia. Estudar as células-tronco radioresistantes pode fornecer pistas para superar a radioresistância. Nesta técnica, as células-tronco cancerígenas são salgadas com marcadores putativos por citometria de fluxo e a capacidade de auto-renovação das células salgadas é avaliada pelo ensaio de formação de esferas.O ensaio de formação da colônia é realizado para avaliar a radiosensibilidade das células salgadas. Determina quantas células perderam sua capacidade de gerar a síntese que formam a colônia após uma certa dose de radiação. Este manuscrito fornece os poucos passos iniciais para o estudo de radiosensibilidade das células-tronco do câncer, que estabelece a base para um estudo mais completo do mecanismo.O estudo do mecanismo pode envolver proteínas relacionadas à reparação de danos no DNA, liberação de espécies reativas de oxigênio, prisão do ciclo celular, etc. Ele fornecerá insights importantes sobre como as células-tronco do câncer recebem radioresistância e como superar a resistência. Demonstrando o procedimento de radiação estará Chen-Nan Li, um técnico de radiação do nosso departamento.Para iniciar esse procedimento, cultura células A549 em RPMI-1640 médio suplementado com 10% FBS em pratos de 10 centímetros a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono. Quando as células atingirem 80 a 90% de confluência, remova o meio de cultura. Lave brevemente as células com três mililitros de PBS.Em seguida, adicione três mililitros de 0,05% trypsin a cada prato. Remova a trippsina e deixe a trippsina residuária para digerir as células a 37 graus Celsius por um a três minutos. Verifique o descolamento das células com frequência para evitar a digestão excessiva.Quando as células se soltarem e começarem a se soltar dos pratos, adicione três mililitros de meio RPMI-1640 suplementados com 10% de FBS e transfira a suspensão das células para um tubo de 50 mililitros. Centrifugar a 300 vezes g e a 4 graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernatante e resuspenque as células em 10 mililitros de PBS.Transfira 0,5 mililitros da suspensão celular para um novo tubo como controle isótipo. Centrifugar tanto o controle quanto os tubos experimentais a 300 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte os supernantes.Em seguida, diluir tanto o controle do isótipo diconjugado fluorescente quanto o anticorpo na PBS para a concentração ideal titulada para preparar a solução de trabalho. Resuspenque as células de controle e experimentais com cada solução de trabalho e misture suavemente. Incubar as amostras no escuro e à temperatura ambiente por 30 a 40 minutos.Lave as células adicionando 10 mililitros de PBS, misturando suavemente, e centrifugando a 300 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte os supernantes e resuspenque as células com 10 mililitros de PBS. Em seguida, coloque 40 filtros de células de micrômetros em novos tubos de 50 mililitros, certificando-se de preparar uma configuração separada de tubo e filtro para o controle e células experimentais.Aplique cada suspensão celular no respectivo coador e colete o fluxo através do fluxo. Centrifugar o fluxo através de 300 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernatante e resuspenque as células com 0,2 a 1,0 mililitros de PBS e transfira cada suspensão celular em um tubo separado de cinco mililitros para citometria de fluxo.Em um armário de segurança biológica, prepare uma placa de seis poços para cada dose de radiação, incluindo o grupo cinza zero. Adicione 1,5 mililitros de 1640 de mídia completas a cada poço. Células colhidas diluídas com 1640 mídia completas a uma densidade celular de 1.000 células por mililitro.Em seguida, adicione a suspensão celular diluída aos poços e agite as placas horizontalmente para distribuir uniformemente as células nos poços. Registo o volume adicionado em cada grupo de dose. Cultura a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Depois que as células se anexarem à parte inferior dos poços, adicione 1640 de mídia completas a cada poço até que a altura da mídia atinja um centímetro. Quando as placas forem transferidas entre a sala de cultura celular e a sala de radioterapia, enrole as placas com papel alumínio ou coloque-as em uma caixa limpa para evitar contaminação. Segure as placas planas para evitar derramamento médio.Em seguida, fixado em 20 centímetros por campo de radiação de 20 centímetros. Coloque um bolus equivalente a tecido de 1,0 centímetro de espessura no sofá do tratamento e coloque a placa de seis poços no bolus para mantê-los em contato. Certifique-se de que toda a placa está dentro do campo de radiação.Ajuste a distância de origem da pele como 100 centímetros e ajuste a altura do sofá de tratamento para alinhar o nível médio da superfície ao nível de laser. Entregue a dose atribuída a cada placa em sequência. Depois disso, leve as placas para o armário de biossegurança na sala de cultura celular.Substitua o meio em cada poço por dois mililitros de meio 1640 completos. Cultura a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, certificando-se de mudar o meio a cada três ou cinco dias. Sete a dez dias após a radiação, remova o meio e lave brevemente as células com PBS.Em um capô de fumaça, adicione um mililitro de 4% de formaldeído a cada poço para fixar as células por 10 minutos. Em seguida, remova o formaldeído e lave cada poço duas vezes usando dois mililitros de água destilada para cada lavagem. Adicione um mililitro de 1% Solução de mancha violeta cristalina a cada poço e manche por 10 minutos.Depois disso, remova a solução de mancha violeta cristalina e lave as células três vezes com água destilada. Retire a água e deixe as placas secarem por 30 minutos. Conte o número de colônias com mais de 50 células.Neste estudo, ambos alfa dois delta um alto e alfa dois delta um baixo A549 células são classificadas. Alguns marcadores podem mostrar populações distintas e são fáceis de gate. No entanto, alguns marcadores apenas mostram padrões de alta e baixa expressão, em vez de populações positivas e negativas distintas.Nesta situação, um controle de isótipo é muito importante para o gating. A expressão de alfa dois delta um em células classificadas é validada por qPCR. A expressão de CACNA2D1, o gene que codifica alfa dois delta um, é maior em células alfa duas deltas de alta em comparação com alfa dois delta uma células baixas.A morfologia típica das esferas e a eficiência da formação da esfera são mostradas aqui. Alfa dois delta uma células altas mostram maior eficiência de formação de esferas, sugerindo uma maior capacidade de auto-renovação. Imagens típicas de colônias e curvas de sobrevivência são mostradas aqui.Uma colônia com cerca de 50 células pode ser examinada sob um microscópio e marcada como referência. O número de colônias é contado, então uma fração de sobrevivência em cada dose pode ser calculada e uma curva de sobrevivência pode ser plotada. Alfa dois delta uma células altas são relativamente resistentes à radiação em comparação com alfa dois delta uma células baixas.Quaisquer etapas relacionadas à cultura celular devem ser realizadas no gabinete de segurança biológica ou no banco limpo laminar. Para evitar contaminação, recomenda-se adicionar antibióticos ao meio da cultura após a triagem. Quando um marcador de células-tronco de câncer putativo é identificado preliminarmente pelo ensaio de formação da esfera, uma caracterização adicional pelo ensaio de diluição in vivo limitando pode ser realizada para avaliar a capacidade tumorigênica.A partir do estudo do mecanismo de radioresistância, os pesquisadores podem examinar a proteína relacionada à reparação de danos no DNA, liberação de espécies reativas de oxigênio e prisão do ciclo celular em resposta à radiação. Durante a radiação celular, observe que o acelerador linear só pode ser operado por técnicos qualificados. Fique longe da radiação.Enquanto estiver em pé, por favor, note que o formaldeído é volátil e perigoso. Use formaldeído no capô da fumaça.

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