Name: radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines
Uploaded: 2019-08-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (81402535 och 81672969) och nationella viktiga forsknings-och utvecklingsprojekt (2016YFC0904703).

Obs: steg utförs under den angivna temperaturen. För steg där temperaturen inte nämns, utför under rumstemperatur (18 – 25 ° c). Cell odlingsmediet ska förvaras vid 4 ° c och andra reagenser ska förvaras i enlighet med tillverkarens anvisningar. Medel ska förvärmas till 37 ° c innan de tillsätts i cellerna.
1. cell sortering
<ol><li>Konjugering av antikroppar Obs: med tanke på den kortare inkubationstiden, är direktmärkt antikropp att föredra för cell sortering. Om ing...

<ol>
	<li>Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+as+a+predictive+factor+in+radiotherapy.">Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy.</a> Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).</li><li>Baumann, M., Krause, M., Hill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+role+of+cancer+stem+cells+in+radioresistance.">Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance.</a> Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).</li><li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells--perspectives+on+current+status+and+future+directions:+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells.">Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Wang, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+regulation+of+CHK1+and+CHK2+promotes+radioresistance+in+a+stem+cell-like+population+of+nasopharyngeal+carcinoma+cells.">MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells.</a> Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).</li><li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+reactive+oxygen+species+levels+and+radioresistance+in+cancer+stem+cells.">Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).</li><li>Gomez-Casal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-small+cell+lung+cancer+cells+survived+ionizing+radiation+treatment+display+cancer+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+phenotypes.">Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes.</a> Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).</li><li>Mihatsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+radioresistant+tumor+cells+and+presence+of+ALDH1+activity+in+vitro.">Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro.</a> Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).</li><li>Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit+(CACNA2D1)+enhances+radioresistance+in+cancer+stem-like+cells+in+non-small+cell+lung+cancer+cell+lines.">Calcium channel &#945;2&#948;1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines.</a> Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1B50-1,+a+mAb+raised+against+recurrent+tumor+cells,+targets+liver+tumor-initiating+cells+by+binding+to+the+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit.">1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel &#945;2&#948;1 subunit.</a> Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).</li><li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance:+Cancer+stem+cell.">Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell.</a> Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).</li><li>Zhang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+decarboxylase+activity+drives+non-small+cell+lung+cancer+tumor-initiating+cells+and+tumorigenesis.">Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis.</a> Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+self-renewal.">Cancer stem cells and self-renewal.</a> Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).</li><li>Morgan, M. A., Lawrence, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways:+overcoming+radiation+resistance+by+targeting+DNA+damage+response+pathways.">Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways.</a> Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+exploration+of+cancer+stem+cell+marker+voltage-dependent+calcium+channel+&#945;2&#948;1+subunit-mediated+chemotherapy+resistance+in+small-cell+lung+cancer.">Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel &#945;2&#948;1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer.</a> Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).</li></ol>

Detta protokoll beskriver metoder för att studera radiosensitivitet av CSCs i cancer cellinjer in vitro. I denna studie är uttrycket av α2δ1 kontinuerligt i NSCLC-cellinjer. Därför är gating baserad på en isotypen-kontroll. Före sortering skall α2δ1-uttrycket undersökas i flera cellinjer med flödescytometri och valideras av QPCR eller Western blot. Det rekommenderas att analysera α2δ1-uttrycket för de sorterade α2δ1-High-och α2δ1-Low-cellerna med flödescytometri genom att observera fluorescens under ...

Strålbehandling spelar en viktig roll vid cancerbehandling. Förekomst av röntgen resistenta cancer stamceller (CSCS) kan dock leda till återfall eller dåliga resultat efter strålbehandling1,2. CSCs kännetecknas av sin självförnyelse kapacitet och förmåga att generera heterogena cancerceller3. Bepansrade med en effektivare DNA-skadereparations kapacitet eller högre nivåer av fria radikaler eller andra mekanismer är CSCs relativt resistenta mot strålbehandling4,5,6,7 , 8. identifiera CSC markörer och utforska deras mekanismer kommer att underlätta utvecklingen av läkemedel som kommer att övervinna radio resistens utan att öka normal vävnadsskada.
Spännings-gated kalcium kanal α2δ1 subenhet isoform 5 har rapporterats som en markör för radioresistent CSCs i NSCLC cellinjer9. α2δ1 identifierades ursprungligen som en CSC-markör för Hepatocellulär cancer (HCC)10. Med subtrantiv immunisering med ett par HCC-cellinjer härledda från de primära och återkommande tumörerna i samma patient identifierades en antikropp som hette 1B50-1 för att rikta återkommande HCC-celler specifikt. 1B50-1-positiva celler visade hög sfär formation effektivitet in vitro och hög tumorigenicitet in vivo. Dess antigen identifierades med masspektrometri, som kalcium kanal α2δ1 subenhet isoform 5. α2δ1 uttrycker särskilt CSCs och är omöjlig att upptäcka i de flesta normala vävnader, vilket gör det till en potentiell kandidat för att rikta CSCs10. α2δ1 kan också fungera som en CSC-markör för NSCLC-cellinjer, och det har visat sig förmedla radioresistens till NSCLC-celler delvis genom att öka effektiviteten av DNA-skadereparation som svar på strålning9.
Att studera radioresistenta CSCs kan ge ledtrådar för att övervinna radio resistens. Att använda α2δ1 i NSCLC som ett exempel, stora metoder för att studera radiosensitivitet av CSCs presenteras. Vanligtvis är CSCs isolerade med en förmodade yta markör, och stamcells egenskaper och radio känslighet av de positiva och negativa cellpopulationer jämförs. Sfär bildning i ett serumfritt medium kompletterat med tillväxtfaktorer som stöder självförnyelse är en användbar analys för att utvärdera stemness av celler in vitro-. Celler med hög sfär formation kapacitet kommer sannolikt att Visa hög tumorigenicitet när injiceras i immunbrist möss10,11,12. Colony formation assay används sedan för att bedöma radio känslighet av celler, som avgör hur många har förlorat förmågan att generera ättlingar bildar kolonin efter en dos av strålning13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td>Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B50-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel &#945;2&#948;1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% formaldehyde solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12500062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer/cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSARIA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_0060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1975</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>RRID: CVCL_1511</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightning-Link Fluorescein Kit</td>
			<td>Innova Biosciences</td>
			<td>310-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linear accelerator</td>
			<td>VARIAN</td>
			<td>CLINAC 600C/D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBRGREEN</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>QPK-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Violet crystal staining solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines

Närvaron av cancer stamceller (CSCs) har förknippats med recidiv eller dåliga resultat efter strålbehandling. Att studera radioresistenta CSCs kan ge ledtrådar för att övervinna radio resistens. Spännings-gated kalcium kanal α2δ1 subenhet isoform 5 har rapporterats som en markör för radioresistent CSCs i icke-småcellig lungcancer (NSCLC) cellinjer. Använda kalcium kanal α2δ1 subenhet som ett exempel på en CSC markör, metoder för att studera radiosensitivitet av CSCs i NSCLC cellinjer presenteras. CSCs sorteras med förmodade markörer av flödescytometri, och självförnyelse kapaciteten hos sorterade celler utvärderas av Sphere formation assay. Colony formation assay, som avgör hur många celler förlorar förmågan att generera ättlingar bildar kolonin efter en viss dos av strålning, utförs sedan för att bedöma radiosensitivitet av sorterade celler. Detta manuskript ger inledande steg för att studera radiosensitivitet hos CSCs, vilket skapar grunden för ytterligare förståelse för de bakomliggande mekanismerna.

α2δ1-High och α2δ1-Low A549 cells sorterades (figur 1a). Vissa markörer kan visa distinkta populationer och är lätta att utfärda utegångsförbud för. Men vissa markörer visar bara höga och låga uttrycksmönster, snarare än distinkta positiva och negativa populationer. I det här fallet är en isotypen-kontroll mycket viktigt för gating. Uttrycket av α2δ1 i sorterade celler valideras av qPCR. Uttrycket av CACNA2D1, genen som kodar α2δ1, är högre i sorterade α2δ...

Watch this Scientific Journal Video about Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines at JoVE.com

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Närvaron av cancer stamceller har förknippats med återfall eller dåliga resultat efter strålbehandling. Detta manuskript beskriver metoderna för att studera radio känslighet av cancer stamceller i lungcancer cellinjer.

Radio känslighet av cancer stamceller i Lung cancer cellinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Detta protokoll är betydande eftersom förekomsten av cancer stamceller kan vara associerade med återfall eller ett dåligt resultat efter strålbehandling. Att studera de radioresistiva stamcellerna kan ge ledtrådar för att övervinna radiomotstånd. I denna teknik, cancer stamceller är saltade med förmodade markörer genom flöde cytometri och självförnyelse kapacitet saltade celler utvärderas av sfärbildning assay.Kolonibildningsanalysen utförs för att bedöma radiosensitiviteten hos saltade celler. Det avgör hur många celler som förlorat sin förmåga att generera den syntes som bildar kolonin efter en viss dos av strålning. Detta manuskript ger de första få stegen för radiosensitivity studie av cancer stamceller, som fastställer grunden för fullständigare mekanism studie.Mekanismstudie kan innebära proteiner relaterade till DNA-skador reparation, clearance av reaktiva syrearter, cellcykelarest, etc. Det kommer att ge viktiga insikter om hur cancerstamceller får radiomotstånd och hur man kan övervinna motståndet. Demonstrerar strålningsproceduren blir Chen-Nan Li, en strålningstekniker från vår avdelning.Till att börja detta förfarande, kultur A549 celler i RPMI-1640 medium kompletteras med 10%FBS i 10 centimeter rätter vid 37 grader Celsius, med 5%koldioxid. När cellerna når 80 till 90%sammanflödet, ta bort odlingsmediet. Tvätta kortfattat cellerna med tre milliliter PBS.Därefter lägger du till tre milliliter på 0,05%trypsin till varje maträtt. Ta bort trypsin och lämna residuary trypsin att smälta cellerna på 37 grader Celsius i en till tre minuter. Kontrollera lossnar ofta cellerna för att undvika över-matsmältning.När cellerna lossnar och börjar lossna från disken, tillsätt tre milliliter RPMI-1640 medium kompletterat med 10%FBS och överföra cellerna suspension till en 50 milliliter rör. Centrifugera vid 300 gånger g och vid fyra grader Celsius i fem minuter. Kassera supernatanten och resuspend cellerna i 10 milliliter av PBS.Överför 0,5 milliliter av cellupphängningen till ett nytt rör som en isotypkontroll. Centrifugera både kontroll- och experimentrören vid 300 gånger g och fyra grader Celsius i fem minuter. Kassera supernatanterna.Späd sedan ut både den fluorescerande dikonjugerad isotypkontroll och antikropp i PBS till den optimala koncentrationen som titrerades för att bereda arbetslösningen. Resuspend kontrollen och experimentella celler med varje arbetslösning och blanda försiktigt. Inkubera proverna i mörker och i rumstemperatur i 30 till 40 minuter.Tvätta cellerna genom att lägga till 10 milliliter PBS, blanda försiktigt, och centrifugera vid 300 gånger g och vid fyra grader Celsius i fem minuter. Kassera supernatanterna och resuspend cellerna med 10 milliliter PBS. Därefter placerar du 40 mikrometercellsiler på nya 50 milliliterrör, och ser till att förbereda ett separat rör och silinställning för kontroll- och experimentcellerna.Applicera varje cellupphängning på respektive sil och samla in genomströmningen. Centrifugera genomströmningen vid 300 gånger g och vid fyra grader Celsius i fem minuter. Kassera supernatanten och resuspend cellerna med 0,2 till 1,0 milliliter PBS och överför varje cell suspension i en separat fem milliliter rör för flödescytometri.I ett biologiskt säkerhetsskåp, förbered en sex brunnsplatta för varje stråldos, inklusive den nollgrå gruppen. Lägg till 1,5 milliliter av färdiga 1640 media till varje brunn. Späd skördade celler med fullbordade 1640 media till en celltäthet på 1, 000 celler per milliliter.Tillsätt sedan den utspädda cellupphängningen till brunnarna och skaka plattorna horisontellt för att jämnt fördela cellerna i brunnarna. Registrera den volym som tillkommer i varje dosgrupp. Kultur vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid.När cellerna har fästs i botten av brunnarna, lägg till avslutade 1640 media till varje brunn tills mediehöjden når en centimeter. När plattorna överförs mellan cellkultur rum och strålterapi rum, linda plattorna med aluminiumfolie eller lägg dem i en ren låda för att undvika kontaminering. Håll plattorna platta för att undvika att medium rinner ut.Därefter fastställs till 20 centimeter med 20 centimeter strålningsfält. Placera en vävnad motsvarande bolus på 1,0 centimeter tjocklek på behandling soffan och placera sex väl plattan på bolus för att hålla dem i kontakt. Se till att hela plattan är inom strålfältet.Ställ käll-huden avstånd som 100 centimeter och justera höjden på behandlingen soffan att anpassa den medelhöga ytan nivå till laser nivå. Leverera den tilldelade dosen till varje platta i följd. Efter detta tar du plattorna till biosäkerhetsskåpet i cellkulturrummet.Byt ut mediet i varje brunn mot två milliliter av färdigt 1640 medium. Kultur vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid, se till att byta medium var tredje till femte dag. Sju till tio dagar efter strålning, ta bort mediet och kort tvätta cellerna med PBS.I en rökhuva, tillsätt en milliliter av 4%formaldehyd till varje brunn för att fixa cellerna i 10 minuter. Ta sedan bort formaldehyden och tvätta varje brunn två gånger med två milliliter destillerat vatten för varje tvätt. Tillsätt en milliliter på 1%Crystal violett fläcklösning till varje brunn och fläck i 10 minuter.Efter detta, ta bort Crystal violett fläcklösning och tvätta cellerna tre gånger med destillerat vatten. Ta bort vattnet och låt plattorna lufttorka i 30 minuter. Räkna antalet kolonier med mer än 50 celler.I denna studie, både alfa två delta en hög och alfa två delta en låg A549 celler sorteras. Vissa markörer kan visa olika populationer och är lätta att gate. Men vissa markörer visar bara högt och lågt uttryck mönster, snarare än särskiljande positiva och negativa populationer.I denna situation är en isotypkontroll mycket viktig för att gating. Uttrycket av alfa två delta ett i sorterade celler valideras av qPCR. Uttrycket av CACNA2D1, den gen som kodar alfa två delta en, är högre i sorterade alfa två delta en höga celler jämfört med alfa två delta en låg celler.Typisk morfologi av sfärer och sfärbildningseffektiviteten visas här. Alpha två delta en höga celler visar högre sfär bildning effektivitet, vilket tyder på en högre självförnyelse kapacitet. Här visas typiska bilder av kolonier och överlevnadskurvor.En koloni med cirka 50 celler kan undersökas i mikroskop och markeras som referens. Antalet kolonier räknas, sedan kan en överlevnadsfraktion vid varje dos beräknas och en överlevnadskurva kan ritas upp. Alfa två delta en höga celler är relativt resistenta mot strålning jämfört med alfa två delta en låg celler.Eventuella steg relaterade till cellkultur bör utföras i det biologiska säkerhetsskåpet eller laminär ren bänk. För att undvika kontaminering rekommenderas att tillsätta antibiotika till odlingsmediet efter sortering. När en putativ cancer stamceller markör är preliminärt identifieras av sfären formation assay, ytterligare karakterisering genom in vivo begränsa utspädning assay kan utföras för att utvärdera den tumorigenic kapaciteten.Från mekanismen studie av radioresistance, forskare kan undersöka proteinet i samband med DNA-skador reparation, clearance av reaktiva syrearter, och cellcykelstilhåll som svar på strålning. Under cellstrålningen, observera att den linjära acceleratorn endast kan drivas av kvalificerade tekniker. Håll dig borta från strålning.När du står, observera att formaldehyd är flyktig och farlig. Använd formaldehyd i rökhuven.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Ett protokoll för Rapid Post mortem Cell Culture av Diffus Intrinsic Pontine Gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Inrättandet av en Lung Colonization analys för cirkulerande tumör Cell visualisering i lungvävnad

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastisk färgning på paraffin-inbäddade diabilder av pT3N0M0 mag cancer vävnad

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymala stamceller isolering från massa vävnad och samtidig kultur med cancerceller för att studera deras interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Etablering och karakterisering av tre afatinib-resistenta lung adenocarcinom PC-9 cellinjer som utvecklats med ökande doser av afatinib

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flödescytometrisk analys av mitokondriella reaktiva syreradikaler i murina hematopoietiska Stem och progenitorceller och MLL-AF9 driven leukemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Karakterisera sjukdomsrelaterade mutanter av RAF-Familjekinaser genom att använda en uppsättning praktiska och genomförbara metoder

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Inrättande av patienter med Ventrikelhärledd xenograft-modell och primära cellinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering och uppräkning av cirkulerande tumörceller från icke-småcellig Lung cancer patienter genom Immunofluorescensering

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Använda humana inducerade pluripotenta stamceller för generering av tumör antigen-specifika T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...